转Bt基因作物毒素蛋白降解特性研究进展Abstract: The characteristics of Bt insecticidal proteins, soil remaining and accumulating of toxins released by transgenic Bt crops, and the impact of transgenic Bt crops on ecological environment were summarized. The degradation of Bt Protein in soil and its impacting factors were also discussed. It was suggested that the degradation of transgenic Bt crops stalks should be investigated, to degrade Bt proteins in transgenic Bt crops while degrading transgenic Bt crops stalks.Key words: transgenic Bt crops; toxins protein; soil; degradation自1983年转基因作物问世以来,转基因作物发展迅猛,全球种植面积从1996年的170万hm2增加到2009年的1.34亿hm2,翻了近80倍,累计达10亿hm2,截至2009年累计经济效益达519亿美元｡2009年共有25个国家的1 400万农民种植了转基因作物,其中,美国是世界上最大的转基因作物种植国,占全世界的48%｡2009年,转基因耐除草剂大豆仍然是主要的转基因作物,占全球转基因作物种植面积的52%,其次是转基因玉米(占31%)､转基因棉花(占12%)和转基因油菜(占5%)｡2009年发展中国家转基因作物种植面积占世界的46%,中国居世界第六位｡农业生物技术应用国际服务组织(ISAAA)预测:2015年,世界将有40个国家的2 000万农民种植转基因作物,种植面积将扩大到2亿hm2 [1]｡转Bt基因作物是全球商品化程度最快的抗虫转基因作物,目前进行商业化种植的有转Bt基因玉米(Bt11､Mon810､Event176等)､棉花､马铃薯和杨树等｡但转Bt基因作物大规模种植的潜在生态风险是许多科学家争论的焦点｡研究表明,Bt杀虫晶体蛋白可以通过转Bt基因作物根系分泌物或作物残留等形式进入土壤生态系统,并且在土壤和环境中比较稳定,经过较长的时间后仍具有很高的活性,因此可能会对土壤微生物类群､土壤多样性以及周围生态环境产生不利影响｡本研究综述了转Bt基因作物毒素蛋白的降解特性研究进展,旨在为开展Bt杀虫晶体蛋白的降解研究工作和系统评估转Bt基因作物的生态风险提供参考数据｡1Bt杀虫蛋白1.1Bt杀虫蛋白的杀虫机制Bt(Bacillus thuringiensis)是一种革兰氏阳性需氧型芽孢杆菌,1901年Ishiwata首先在染病的蚕蛾中发现这种芽孢杆菌,但是没有保存下来｡1909年,Berliner从德国苏云金省的地中海粉螟上重新分离到Bt,并正式定名为苏云金芽孢杆菌[2]｡苏云金芽孢杆菌在其芽孢形成过程中,能产生一种杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins)｡Bt的毒素可分为内毒素和外毒素｡外毒素指苏云金杆菌在生命活动过程中排出体外的代谢物,包括α-外毒素､β-外毒素､γ-外毒素､不稳定外毒素和水溶性外毒素等｡内毒素又称δ-内毒素､晶体毒素或杀虫晶体蛋白｡其中用于转基因植物的主要是δ-内毒素,δ-内毒素被敏感昆虫幼虫取食后,在其消化道内消化酶的作用下,蛋白被水解释放出Mr约60×103~70×103的活性毒蛋白分子(Toxin),毒蛋白与昆虫中肠上皮细胞上的特异性受体结合,并发生作用而使细胞膜穿孔｡消化道细胞内的离子浓度和渗透压平衡遭破坏,使上皮细胞裂解,并导致昆虫死亡[3-8]｡1.2Bt杀虫蛋白的应用1978年,Stahly等[9]确定了Bt杀虫蛋白基因的位置和可操作性｡此后,各国科学家纷纷将Bt杀虫蛋白基因转入其他微生物,构建或改良可高效产生Bt杀虫晶体蛋白的工程菌株;或将其改造后转入植物体,以期获得抗虫的转基因植物｡1987年,比利时的Vaeck等[10]利用农杆菌介导法将完整的Cry1Ab基因和3’端缺失后仅保留5’端编码毒蛋白核心区的不同长度的Cry1Ab基因导入烟草,获得了第一例转Bt基因的植物,同年还有3个实验室也报道了转Bt基因的烟草或番茄[4,10,11],但这些转基因植物的抗虫性都很弱,难以检测出mRNA的转录,Bt杀虫蛋白的表达量很低,主要原因是未改造的Bt基因具有原核性质不能在真核生物中高效表达｡因此,为了提高Bt基因在转基因植物中的表达水平,科学家们纷纷对Bt基因进行改造或人工合成,将Bt基因的不稳定序列换成植物偏爱的密码子｡Perlak等[12]在不改变Bt杀虫蛋白氨基酸序列的前提下,将CryIAb､CryIAc基因的密码子进行改造,使这两个基因在转基因棉花中的表达水平提高了近100倍,Bt杀虫蛋白的含量提高到占可溶性蛋白的0.05%~0.10%,抗虫功效明显增强｡除了对Bt基因的密码子进行改造外,还可以通过使用组织特异性启动子或强启动子来提高Bt基因在转基因植物中的表达水平,从而达到抗虫的目的｡随着生物技术的发展,近年来科学家们开始尝试用复合的具有非竞争性结合关系的Bt基因来转化植物,以获得对多种害虫都能产生抗性的转基因植物,Salm等[13]用分别属于CryIAb和CryIAc的活性片段构建了一个融合基因,并将其导入烟草和番茄,得到了对甜菜夜蛾､烟芽夜蛾､烟草夜蛾都有抗性的转基因植株｡1.3国内转Bt基因植物研究现状国内有关转Bt基因作物的研究虽然起步较晚,但进展很快｡1992年中国农业科学院生物技术研究所专家,按照高等植物偏爱密码子的原则,在保持杀虫蛋白活性中心与结构的前提下,人工全序合成了Cry1A基因,并与江苏省农业科学院合作采用花粉管通道途径将人工全序合成的Bt基因导入棉花,获得高抗棉铃虫的转Bt 抗虫棉花[14,15],使我国成为继美国之后获得拥有自主知识产权转基因抗虫棉的第二个国家｡此外,中国科学院微生物所､上海植物生理研究所等单位也合成及部分改造了Cry1A基因并导入烟草､甘蓝和大豆,获得了抗虫转基因植株[16]｡丁群星等[17]用子房注射法,将经修饰后Cry1Ac基因导入玉米,使玉米螟的平均死亡率达86.66%｡另外,我国科学家对转Bt基因水稻的研究也较多,华中农业大学､浙江大学､中国科学院遗传与发育研究所､浙江省农业科学院等单位相继都获得了高抗虫的转Bt基因水稻,并已进行环境释放试验｡但是,迄今为止我国只有转Bt基因的抗虫棉得到了商品化生产,转Bt基因抗虫玉米､水稻等粮食作物大部分还处于安全评价阶段｡2009年11月27日,华中农业大学研发的转cry1Ab/cry1Ac基因抗虫水稻华恢1号和Bt汕优63获得了农业部颁发的生产应用安全证书,使转Bt基因水稻向商业化应用迈出了实质性的一步｡2008年,科技部､农业部､财政部等部门联合启动了“转基因生物新品种培育科技重大专项”,专项实施的目标是获得一批具有重要应用价值和自主知识产权的基因,培育一批抗病虫､抗逆､优质､高产､高效的重大转基因生物新品种｡专项的实施必将提高农业转基因生物研究和产业化整体水平,加快我国转基因作物新品种培育和商业化种植的步伐,为我国农业可持续发展提供强有力的科技支撑｡2转Bt基因作物对土壤生态系统的影响转Bt基因作物的Bt杀虫蛋白可以通过根系分泌､残茬分解､秸秆还田以及花粉飘落等进入土壤生态系统,并快速紧密结合于土壤活性颗粒的表面,从而避免了被降解｡研究表明,这些Bt杀虫蛋白能够在土壤中存在一段较长的时间,并且具有一定的活性,有可能对土壤的生态系统造成一定的影响｡因此,最近几年转Bt基因作物对土壤生态系统的影响受到人们的广泛关注,成为转Bt基因作物安全的研究热点之一｡2000年美国EPA将转Bt基因作物对土壤生态系统的影响列为转Bt基因作物风险评价的重要组成部分｡2.1转Bt基因作物Bt杀虫蛋白在土壤中的残留和积累Bt杀虫蛋白在土壤中与土壤颗粒紧密结合,很难降解,并持续产生毒性[18]｡1996年,Palm等[19]将转Bt基因抗虫棉的枝叶埋入5种不同微生态系统土壤中,140 d后,在其中的3种土壤中仍能检测到Bt杀虫蛋白,其含量分别为初始浓度的3%､16%和35%｡1997年,James等[20]研究证实Bt杀虫蛋白可通过枯枝落叶而残留在土壤中,并进一步证明Bt杀虫蛋白可以与土壤黏粒结合,使其毒性难以降解,最长可以持续2~3个月｡Saxena等[21]报道,转基因玉米Bt毒素蛋白通过根系分泌和残体降解释放到土壤中,并在土壤中残留最长可达350 d,Saxena等还研究了残留于土壤中的Bt杀虫蛋白的毒性,结果表明食用转Bt玉米分泌物的幼虫停止进食,5 d后死亡率高达95%~100%,而对照组玉米螟则未有死亡,这表明转Bt基因作物根系分泌物具有较强的Bt杀虫蛋白活性｡虽然,转Bt基因作物分泌的Bt 杀虫蛋白具有较强的杀虫活性,并能够在土壤中残留一段较长的时间,但是Deepak等[22]研究表明,这些残留在土壤中的Bt杀虫蛋白不会被下一季作物吸收｡因此,这些残留在土壤中的Bt杀虫蛋白并不会对下一季作物的抗虫活性产生影响｡但是,农业生态系统相对简单,稳定性差,对干扰较敏感,转Bt基因作物的大面积种植导致的大量Bt杀虫蛋白进入土壤,可能会对土壤生态系统产生较大的影响[23]｡2.2转Bt基因作物对土壤微生物区系的影响任馨等[24]在实验室条件下,比较了克螟稻Bt基因表达最高期秸秆和同一时期亲本稻秸秆的添加对淹水土壤可培养厌氧细菌数量和细菌群落组成的影响｡结果表明,与亲本对照相比,培养初期克螟稻秸秆的添加对淹水土壤厌氧发酵性细菌､产氢产乙酸细菌､反硝化细菌和产甲烷细菌的数量产生了显著性影响,但培养后期这种显著性差异基本消失｡PCR-DGGE指纹图谱和主成分分析(PCA)结果表明,两种秸秆处理土壤细菌群落组曾在培养的第三周和第五周达到显著性差异,随着培养时间的延长,两种秸秆处理土壤间细菌群落组成的差异逐渐减小,到培养的第11周,两种秸秆处理土壤间细菌群落组成的差异基本消失｡王洪兴等[25]通过研究转Bt基因水稻及其亲本秸秆在降解过程中对土壤微生物主要类群的影响,发现在秸秆降解过程中,转Bt基因组细菌和放线菌数量显著低于非转基因组,而真菌数量显著高于非转基因组,转Bt基因组反硝化细菌活性显著低于非转基因组,而解磷微生物活性在各处理组之间无明显差异｡但是,近年来Devare等[26]的一些研究结果显示转Bt基因作物并未给土壤生态系统造成重要影响｡2004年,Devare等[26]经过半年多田间种植转Cry3Bb杀虫蛋白基因的转Bt基因玉米,并通过末端限制片段长度多态性分析评估了其根际与周围的土壤微生物数量､活跃度(包括土壤氮素矿化量､短期土壤消化作用､土壤呼吸作用)和细菌群落结构,发现同时期转Bt基因玉米根际与周围的土壤中,上述指标均不存在显著性差异,转Bt基因玉米未给土壤微生物数量､活跃度及细菌群落生态带来重要影响｡2007年,Devare等[27]报道,经过3年的田间种植转Cry3Bb玉米,并通过测定种植3年转Cry3Bb玉米每年3个时期(作物种植前､开花期､收获期)收集的大批土壤样本的土壤微生物数量､活跃度数据,发现转Bt玉米对土壤微生物数量和活跃度的影响,呈现出明显的周期性变化｡与其2004年报道的试验结论一致,转Bt基因玉米未给土壤生态系统带来重要影响｡但是,目前对土壤中转Bt 杀虫蛋白的生态效应研究明显不足,评价的物种单一,周期短,对土壤中敏感微生物的研究仅局限在土壤微生物不到1%的可人工培养的种类上,尚未有对土壤微生物群落､生物多样性及功能的长期定位研究｡我国在这方面的研究仍未引起足够的重视,而且研究方法和手段也比较落后｡随着人们安全性意识的不断加强,必将增加这方面的研究投入,从而促进转基因生物产业的健康发展｡2.3转Bt基因作物对土壤动物和植物的影响在种植过转Bt基因玉米或者加入其秸秆120~180 d后的土壤上,无论种植非转基因玉米､胡萝卜､萝卜或甘蓝,在这些后茬作物组织中用ELISA检测或幼虫生测均未检测到Bt杀虫蛋白,但是其土壤中仍有活性的Bt杀虫蛋白,表明土壤中已经存在的Bt杀虫蛋白不会被后茬非转基因作物吸收和利用[22],不会对这些非转基因作物的生长和特性产生影响｡将蚯蚓培养在被Bt杀虫蛋白污染的土壤中45 d 后,其肠道内容物和粪便中均能检测到Bt杀虫蛋白,但这些Bt杀虫蛋白对蚯蚓种群的数量和生长状况没有影响,将蚯蚓转移到不含Bt杀虫蛋白的新鲜无污染土壤中培养2~3 d后,其肠道内容物中的Bt杀虫蛋白消失[28],表明结合态Bt杀虫蛋白不会影响蚯蚓的正常生长｡3转Bt基因作物Bt杀虫蛋白在土壤中降解的影响因素目前,关于Bt杀虫蛋白在土壤中降解时间的报道差异较大,可能是因为土壤中Bt杀虫蛋白的降解受到多种因素的影响,其中主要因素可能是土壤微生物､土壤湿度､酸碱度､黏粒组成及含量｡3.1土壤生物对Bt杀虫蛋白在土壤中降解的影响土壤生物是Bt杀虫蛋白在土壤中发生失活或降解的主要作用因子之一,尤其是土壤微生物,它是影响Bt杀虫蛋白在土壤中降解的最关键因子｡Palm等[19]研究发现,在种植转Bt基因棉花的土壤中,Bt杀虫蛋白的量在前14 d快速下降,然后下降趋势逐渐减慢｡而土壤经γ射线处理后,其中的Bt杀虫蛋白降解速度明显减慢｡白耀宇等[29]研究发现,在前6 d内KMD2叶片冻干粉Cry1Ab蛋白的降解速度相当快,这与Palm等[19]的研究结果较为相似,推测其快速降解的主要原因是Cry1Ab杀虫蛋白在自由状态下被土壤微生物作为一种碳源或氮源分解利用｡土壤微生物的数量及其生物活性与土壤的类型密切相关,通常有机质含量高的土壤中微生物数量多,土壤中的Bt杀虫蛋白易被土壤中的微生物降解;同时,一般情况下土壤pH值较高则土壤微生物活性也较高,有利于Bt杀虫蛋白的降解｡另外,土壤生态环境中的昆虫也能消耗一些Bt杀虫蛋白,即土壤中的Bt杀虫蛋白进入昆虫(包括靶标害虫和非靶标昆虫)体内被降解｡3.2土壤湿度对Bt杀虫蛋白在土壤中降解的影响土壤湿度是影响Bt杀虫蛋白在土壤中降解速度的主要因素之一[30]｡白耀宇等[29]研究表明,土壤淹水可显著促进Cry1Ab的降解,且淹水后Cry1Ab的降解动态在不同土壤之间十分相似,但是淹水对Cry1Ab降解的促进作用仅发生在前12 d 之内,此后多数时间内淹水与非淹水处理间Cry1Ab的降解无显著差异｡3.3土壤酸碱度对Bt杀虫蛋白在土壤中降解的影响土壤酸碱度对土壤中Bt杀虫蛋白的降解也有一定的影响,土壤pH值较高,则土壤中Bt杀虫蛋白降解较快,而土壤pH值较低,则不利于Bt杀虫蛋白的降解｡首先,土壤中微生物活性受到土壤酸碱度的影响｡一般情况下,土壤pH值高,则土壤微生物活性就大,微生物分解Bt杀虫蛋白的能力就强,致使大多数的Bt杀虫蛋白被微生物降解｡在pH值为中性的土壤中,利用生物测定法检测Bt杀虫蛋白的活性,结果表明转Bt棉花和玉米中的Bt杀虫蛋白的活性很快被降解,而pH值较低的土壤则不利于微生物对Bt杀虫蛋白的降解[31]｡其次,土壤中具有表面活性的微粒对Bt杀虫蛋白的吸附能力也受到土壤酸碱度的影响｡pH值在4.4~10.0时,蒙脱石和高岭石对Bt杀虫蛋白的吸附量都随pH值的升高而呈线性降低,由于游离态的Bt 杀虫蛋白更容易降解,因此Bt杀虫蛋白的降解率随pH值的升高而呈线性升高[32]｡Tapp等[33]报道Btk和Bt杀虫蛋白与土壤黏土矿物的吸附在pH值为6时达到最大值,因为Bt杀虫蛋白的等电点在5.5左右｡当土壤的pH值接近杀虫蛋白的等电点时,中性杀虫蛋白所受的斥力最小,致使杀虫蛋白与土壤表面有最大的接触机会,从而提高杀虫蛋白与土壤颗粒的吸附力｡结合到高岭石的杀虫蛋白可被ddH2O解吸,而结合在蒙脱石上的Bt杀虫蛋白只能被0.2%的Tris缓冲液解吸｡另外,Bt杀虫蛋白在自然含有或人为加入高岭石的土壤中的杀虫活性比自然含有或人为加入蒙脱石的土壤高,且持续的时间长,其主要原因就是含蒙脱石的土壤pH 值高,细菌活性强[34]｡3.4土壤黏粒对Bt杀虫蛋白在土壤中降解的影响土壤中黏粒的含量和组分也在很大程度上影响Bt杀虫蛋白的降解｡Stotzky等[35]研究发现,土柱中Bt蛋白含量随着黏粒浓度的升高而降低｡Donegan等[36]研究发现在沙壤土和黏壤土中,转Cry1Ab基因棉花叶片和茎秆分解释放杀虫蛋白的高活性状态可分别持续28 d和40 d,这是因为黏壤土中含有更多的土壤活性颗粒,而土壤中的沙粒和泥沙粒由于不具有表面活性的缘故,则不能吸附毒素｡而进一步的研究证实,Bt杀虫蛋白与土壤黏粒的结合,大大减少了其在土壤中的降解｡此外,光照(特别是紫外线)､气候和转Bt基因作物的品种类型､Bt杀虫蛋白浓度也影响其在土壤中的降解速率｡4展望目前的研究表明,转Bt基因作物通过各种形式向土壤生态系统中释放Bt杀虫蛋白｡位于地表的Bt杀虫蛋白,可以很容易被光降解,而土壤中的Bt杀虫蛋白可以与土壤中具有表面活性的颗粒吸附并紧密结合,从而延缓了土壤微生物对Bt杀虫蛋白的降解,致使大量的Bt杀虫蛋白在土壤中长期滞留甚至富集｡由于Bt杀虫蛋白与土壤颗粒结合后其蛋白结构并没有发生改变,依然保持较高的活性,因此,Bt 杀虫蛋白在土壤中的残留和富集可能会对土壤中非靶标生物造成不良影响,从而影响土壤生态系统的平衡｡转基因植物在进入田间释放和商业化应用的过程中应该开展土壤生态学影响的研究和监测,相对而言,发达国家在这方面已开展了不少工作,但由于研究方法和试验条件的限制,许多问题仍未弄清｡转Bt基因作物环境影响的研究是一个长期而复杂的过程,因此,需要从不同的角度开展系统的研究工作,为全面评价转Bt基因作物释放Bt杀虫蛋白可能引起的生态环境风险提供理论依据｡大面积种植转Bt基因作物后,会产生大量的含有Bt杀虫蛋白的植物秸秆,这些秸秆如果“秸秆还田”则使秸秆中含有的Bt杀虫蛋白进入土壤生态系统,造成Bt 杀虫蛋白在土壤中的累积,从而影响土壤生态系统的平衡｡因此,我们需要对转Bt 基因作物秸秆的处置和综合利用进行研究,开发转Bt基因作物秸秆处置新技术,在利用秸秆的同时降解秸秆中的Bt杀虫蛋白,从而大大降低进入土壤生态系统的Bt杀虫蛋白｡秸秆是一种非常丰富的生物质能源,被广泛地应用于生产生活的各个领域,例如利用植物纤维开发生物燃料,通过微生物处理生产生物肥料､生物饲料,利用植物纤维进行造纸等｡在利用转Bt基因作物秸秆生产沼气､生物肥料的过程中,需要对秸秆中Bt杀虫蛋白的降解情况进行研究和监测,争取通过对生产技术的改进(比如加入特定的微生物和酶)来提高秸秆中Bt杀虫蛋白的降解速度,从而从根本上消除Bt杀虫蛋白对生态系统的潜在影响｡本实验室经过一段时间的研究,从转Bt基因水稻种植田筛选出了一种能够降解Bt杀虫蛋白的细菌,在实验室条件下,4 d内该细菌能够降解转Bt基因水稻秸秆中90%以上的Bt杀虫蛋白,这对于利用转Bt基因作物秸秆生产生物肥料､沼气过程中,降解秸秆中的Bt杀虫蛋白,彻底消除Bt杀虫蛋白对生态系统的潜在影响,具有非常高的应用价值｡参考文献:[1] JAMES C. 2009年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势——第一个十四年1996~2009[J].中国生物工程杂志,2010,30(2):1-22.[2] SCHNEPF E, CRICKMORE N, V AN RIE J, et al. 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