实验一 人类基因组DNA的提取与鉴定_百替生物

实验十三质粒DNA的提取与鉴定_百替生物实验十三质粒DNA的提取与鉴定一实验目的1.了解分光光度计测定DNA含量的原理和方法。

2.熟悉质粒的基本特性及质粒DNA提取的基本原理。

3.掌握碱变性法提取质粒DNA的基本操作过程。

二实验原理质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA 分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。

细菌质粒大小介于1～200Kb 之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。

质粒DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件又可以使DNA复性。

SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。

所以，SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。

释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境就会变性。

然后，用酸性乙酸钾中和溶液碱性使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA由于分子巨大在短时间内难以复性。

离心后，质粒DNA将留在上清中，染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。

通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。

测定DNA浓度的方法有两种：一是利用分光光度计法测定DNA 的紫外光吸收值；一是利用溴化乙锭荧光强度法测定样品中溴化乙锭发射的荧光强度来计算核酸的含量。

（1）紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm处的吸收峰即可对DNA进行定量。

一般在中性pH环境条件下进行测定，此方法常用于测定比较纯净的DNA样品。

（2）溴化乙锭荧光强度法：溴化乙锭能与DNA结合并嵌入双链中，当受紫外光照射时会激发产生荧光，且荧光的强度与DNA含量成正比。

三药品器材一器材1.电泳仪（包括直流电源整流器和电泳槽两部分）2.台式离心机与高压灭菌锅3.超净工作台、摇床和各式加样枪二试剂1.溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖10mmol/L EDTA，20mmol/L20mMTris-HCl pH8.0100mg/ml RNase A（抽质粒时现加）溶液Ⅰ可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2（6.859×104Pa）高压下蒸汽灭菌15分钟，40C冰箱贮存（注：不能将RNase A加入溶液Ⅰ中一起灭菌，RNase A用时现加）。

质粒DNA的提取与电泳鉴定质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。

方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。

2、37℃振荡培养过夜。

3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。

4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。

9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。

10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。

11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。

2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。

3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。

5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。

6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。

7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

8、取20ml进行电泳检查。

质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。

大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。

dna提取及测定实验报告DNA 提取及测定实验报告一、实验目的1、掌握从生物样本中提取 DNA 的基本原理和方法。

2、学习使用分光光度计测定 DNA 浓度和纯度。

3、培养实验操作能力和科学思维。

二、实验原理DNA 是遗传信息的携带者，存在于细胞核和细胞器中。

提取 DNA 的基本原理是利用细胞裂解液破坏细胞膜和核膜，使 DNA 释放出来，然后通过一系列的物理和化学方法去除蛋白质、RNA 等杂质，从而获得纯净的 DNA 。

常用的 DNA 提取方法有酚氯仿抽提法、盐析法、试剂盒法等。

本实验采用试剂盒法提取 DNA ，其原理是利用硅胶膜在高盐环境下特异性吸附 DNA ，而在低盐环境下 DNA 被洗脱下来。

分光光度计测定 DNA 浓度和纯度的原理是 DNA 在 260nm 处有特征吸收峰，其吸光度与 DNA 浓度成正比。

同时，DNA 在 280nm 处也有吸收峰，通过计算 A260/A280 的比值，可以评估 DNA 的纯度。

纯DNA 的 A260/A280 比值约为 18 。

三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的动物肝脏组织DNA 提取试剂盒无水乙醇双蒸水2、实验仪器离心机移液器恒温培养箱分光光度计四、实验步骤1、样本处理称取约 01g 新鲜的动物肝脏组织，放入研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉末状。

将研磨好的组织粉末转移至 15ml 离心管中，加入200μl 裂解液，充分混匀，室温放置 5min ，使细胞充分裂解。

2、 DNA 提取向裂解液中加入200μl 无水乙醇，充分混匀。

将混合液转移至吸附柱中，12000rpm 离心 1min ，弃去滤液。

向吸附柱中加入500μl 洗涤液 1 ，12000rpm 离心 1min ，弃去滤液。

向吸附柱中加入500μl 洗涤液 2 ，12000rpm 离心 1min ，弃去滤液。

再次 12000rpm 离心 2min ，以去除残留的洗涤液。

将吸附柱转移至新的 15ml 离心管中，向吸附膜中央加入50μl 洗脱液，室温放置 2min ，12000rpm 离心 1min ，收集洗脱液，即为提取的DNA 。

第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定第一节转化基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。

只有当其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。

在分子克隆实践中，在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。

一、重组DNA分子转入原核生物细胞1.重组质粒DNA分子转化大肠杆菌转化（transformation）——重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。

转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。

（1）CaCl2处理后的细菌转化或转染A、制备感受态细胞受体细胞的细菌，经一定浓度的冰冷的CaCl2（50～100mmol／L）溶液处理后变成。

所谓感受态细胞，处在感受态状态的菌体有摄取各种外源DNA的能力。

转化：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程；转染：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程；好的感受态细胞，每微克的超螺旋质粒DNA可得5×107个转化体。

B、细胞转化（或转染）的具体操作过程：①将处于对数期的新鲜培养物于0℃4000转/分离心10分，回收细菌细胞；②将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2低渗溶液处理30分钟，离心回收细胞，再用适量0℃的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，以诱导感受态产生。

③加入适量DNA，于42℃热处理混合物90秒，使DNA分子被细胞吸收；④将混合物快速转到冰浴中，冷却1~2分，加入适当的培养基，在37℃培养45分，使细胞复苏并表达质粒所携带的转化基因；⑤通过选择培养基上平板培养，选择转化体。

⑥如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。

（2）电穿孔转化法基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。

人类基因组dna的提取实验报告
人类基因组DNA的提取实验报告
DNA提取是分子生物学和遗传学研究中的基础性技术之一。

本次实验旨在从人类细胞中提取DNA，并通过多种方法进行检测和分析。

以下是实验的详细过程和结果。

实验材料与方法：
1.材料：人类细胞样本、细胞裂解液、蛋白酶K、异丙醇、氯仿、等渗盐溶液、乙醇、TE缓冲液、琼脂糖、DNA标准品。

2.方法：
（1）取100μl人类细胞样本，加入细胞裂解液中进行细胞破裂。

（2）加入蛋白酶K使细胞膜和蛋白质降解。

（3）加入异丙醇使DNA沉淀，离心去除上层液体。

（4）加入氯仿和等渗盐溶液，离心分离DNA纯化。

（5）加入乙醇沉淀DNA。

（6）加入TE缓冲液重溶DNA。

（7）用琼脂糖凝胶电泳法分离DNA并检测。

实验结果：
经过琼脂糖凝胶电泳分离，成功提取了人类细胞的DNA样本。

在电泳结果中，能够明显地看到DNA条带的形成，表明DNA的提取和纯化过程都比较成功。

为了进一步检测DNA的纯度和浓度，我们使用了多种方法，如吸光度测定、荧光染料检测等。

实验结果表明，提取出的DNA纯度较高，浓度也较为理想。

结论：
通过本次实验，我们成功地提取了人类细胞的DNA，并对其进行了检测和分析。

这为我们后续的研究提供了重要的基础。

同时，实验还说明了DNA提取技术的重要性和应用广泛性，不仅在分子生物学和遗传学领域有着广泛的应用，也在医学和生物工程等领域具有重要的价值。

实验DNA的粗提取与鉴定目的要求1.了解实验原理。

2.学会DNA的粗提取和鉴定的方法，观察提取出来的DNA物质。

3．通过本实验培养实验操作能力和观察能力。

实验原理1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。

当NaCl的物质的量浓度为0.14mOl／L时,DNA的溶解度最低。

利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。

2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。

利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。

3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。

注意事项1.步骤3析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入。

2.实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。

实验用具鸡血细胞液（5～10mL）；体积分数为95％的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为0．1g／mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2mol／L和0．015mol／L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯（100mL，1个，50mL，500mL，各2个），漏斗，试管（20mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒（100mL，1个），纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。

课时安排一课时课前准备制备鸡血细胞液，方法是：将质量浓度为0.1g／mL的柠檬酸钠溶液100mL，置于500mL烧怀中，注入新鲜的鸡血（约180mL），用玻璃棒搅拌，使其充分混合，以免凝血。

静置于冰箱内一天，使血细胞自行沉淀。

（也可以用离心机离心2 min（转速1000转/分）。

用吸管吸去上清液。

板书（提前写好）DNA的粗提取与鉴定实验原理：1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。

2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。

3.DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。

方法步骤：1．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。