实验一 人类基因组DNA的提取与鉴定_百替生物

实验十三质粒DNA的提取与鉴定_百替生物实验十三质粒DNA的提取与鉴定一实验目的1.了解分光光度计测定DNA含量的原理和方法。

2.熟悉质粒的基本特性及质粒DNA提取的基本原理。

3.掌握碱变性法提取质粒DNA的基本操作过程。

二实验原理质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA 分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。

细菌质粒大小介于1～200Kb 之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。

质粒DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件又可以使DNA复性。

SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。

所以，SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。

释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境就会变性。

然后，用酸性乙酸钾中和溶液碱性使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA由于分子巨大在短时间内难以复性。

离心后，质粒DNA将留在上清中，染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。

通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。

测定DNA浓度的方法有两种：一是利用分光光度计法测定DNA 的紫外光吸收值；一是利用溴化乙锭荧光强度法测定样品中溴化乙锭发射的荧光强度来计算核酸的含量。

（1）紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm处的吸收峰即可对DNA进行定量。

一般在中性pH环境条件下进行测定，此方法常用于测定比较纯净的DNA样品。

（2）溴化乙锭荧光强度法：溴化乙锭能与DNA结合并嵌入双链中，当受紫外光照射时会激发产生荧光，且荧光的强度与DNA含量成正比。

三药品器材一器材1.电泳仪（包括直流电源整流器和电泳槽两部分）2.台式离心机与高压灭菌锅3.超净工作台、摇床和各式加样枪二试剂1.溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖10mmol/L EDTA，20mmol/L20mMTris-HCl pH8.0100mg/ml RNase A（抽质粒时现加）溶液Ⅰ可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2（6.859×104Pa）高压下蒸汽灭菌15分钟，40C冰箱贮存（注：不能将RNase A加入溶液Ⅰ中一起灭菌，RNase A用时现加）。

质粒DNA的提取与电泳鉴定质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。

方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。

2、37℃振荡培养过夜。

3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。

4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。

9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。

10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。

11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。

2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。

3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。

5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。

6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。

7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

8、取20ml进行电泳检查。

质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。

大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。

dna提取及测定实验报告DNA 提取及测定实验报告一、实验目的1、掌握从生物样本中提取 DNA 的基本原理和方法。

2、学习使用分光光度计测定 DNA 浓度和纯度。

3、培养实验操作能力和科学思维。

二、实验原理DNA 是遗传信息的携带者，存在于细胞核和细胞器中。

提取 DNA 的基本原理是利用细胞裂解液破坏细胞膜和核膜，使 DNA 释放出来，然后通过一系列的物理和化学方法去除蛋白质、RNA 等杂质，从而获得纯净的 DNA 。

常用的 DNA 提取方法有酚氯仿抽提法、盐析法、试剂盒法等。

本实验采用试剂盒法提取 DNA ，其原理是利用硅胶膜在高盐环境下特异性吸附 DNA ，而在低盐环境下 DNA 被洗脱下来。

分光光度计测定 DNA 浓度和纯度的原理是 DNA 在 260nm 处有特征吸收峰，其吸光度与 DNA 浓度成正比。

同时，DNA 在 280nm 处也有吸收峰，通过计算 A260/A280 的比值，可以评估 DNA 的纯度。

纯DNA 的 A260/A280 比值约为 18 。

三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的动物肝脏组织DNA 提取试剂盒无水乙醇双蒸水2、实验仪器离心机移液器恒温培养箱分光光度计四、实验步骤1、样本处理称取约 01g 新鲜的动物肝脏组织，放入研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉末状。

将研磨好的组织粉末转移至 15ml 离心管中，加入200μl 裂解液，充分混匀，室温放置 5min ，使细胞充分裂解。

2、 DNA 提取向裂解液中加入200μl 无水乙醇，充分混匀。

将混合液转移至吸附柱中，12000rpm 离心 1min ，弃去滤液。

向吸附柱中加入500μl 洗涤液 1 ，12000rpm 离心 1min ，弃去滤液。

向吸附柱中加入500μl 洗涤液 2 ，12000rpm 离心 1min ，弃去滤液。

再次 12000rpm 离心 2min ，以去除残留的洗涤液。

将吸附柱转移至新的 15ml 离心管中，向吸附膜中央加入50μl 洗脱液，室温放置 2min ，12000rpm 离心 1min ，收集洗脱液，即为提取的DNA 。

第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定第一节转化基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。

只有当其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。

在分子克隆实践中，在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。

一、重组DNA分子转入原核生物细胞1.重组质粒DNA分子转化大肠杆菌转化（transformation）——重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。

转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。

（1）CaCl2处理后的细菌转化或转染A、制备感受态细胞受体细胞的细菌，经一定浓度的冰冷的CaCl2（50～100mmol／L）溶液处理后变成。

所谓感受态细胞，处在感受态状态的菌体有摄取各种外源DNA的能力。

转化：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程；转染：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程；好的感受态细胞，每微克的超螺旋质粒DNA可得5×107个转化体。

B、细胞转化（或转染）的具体操作过程：①将处于对数期的新鲜培养物于0℃4000转/分离心10分，回收细菌细胞；②将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2低渗溶液处理30分钟，离心回收细胞，再用适量0℃的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，以诱导感受态产生。

③加入适量DNA，于42℃热处理混合物90秒，使DNA分子被细胞吸收；④将混合物快速转到冰浴中，冷却1~2分，加入适当的培养基，在37℃培养45分，使细胞复苏并表达质粒所携带的转化基因；⑤通过选择培养基上平板培养，选择转化体。

⑥如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。

（2）电穿孔转化法基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。

人类基因组dna的提取实验报告
人类基因组DNA的提取实验报告
DNA提取是分子生物学和遗传学研究中的基础性技术之一。

本次实验旨在从人类细胞中提取DNA，并通过多种方法进行检测和分析。

以下是实验的详细过程和结果。

实验材料与方法：
1.材料：人类细胞样本、细胞裂解液、蛋白酶K、异丙醇、氯仿、等渗盐溶液、乙醇、TE缓冲液、琼脂糖、DNA标准品。

2.方法：
（1）取100μl人类细胞样本，加入细胞裂解液中进行细胞破裂。

（2）加入蛋白酶K使细胞膜和蛋白质降解。

（3）加入异丙醇使DNA沉淀，离心去除上层液体。

（4）加入氯仿和等渗盐溶液，离心分离DNA纯化。

（5）加入乙醇沉淀DNA。

（6）加入TE缓冲液重溶DNA。

（7）用琼脂糖凝胶电泳法分离DNA并检测。

实验结果：
经过琼脂糖凝胶电泳分离，成功提取了人类细胞的DNA样本。

在电泳结果中，能够明显地看到DNA条带的形成，表明DNA的提取和纯化过程都比较成功。

为了进一步检测DNA的纯度和浓度，我们使用了多种方法，如吸光度测定、荧光染料检测等。

实验结果表明，提取出的DNA纯度较高，浓度也较为理想。

结论：
通过本次实验，我们成功地提取了人类细胞的DNA，并对其进行了检测和分析。

这为我们后续的研究提供了重要的基础。

同时，实验还说明了DNA提取技术的重要性和应用广泛性，不仅在分子生物学和遗传学领域有着广泛的应用，也在医学和生物工程等领域具有重要的价值。

实验DNA的粗提取与鉴定目的要求1.了解实验原理。

2.学会DNA的粗提取和鉴定的方法，观察提取出来的DNA物质。

3．通过本实验培养实验操作能力和观察能力。

实验原理1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。

当NaCl的物质的量浓度为0.14mOl／L时,DNA的溶解度最低。

利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。

2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。

利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。

3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。

注意事项1.步骤3析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入。

2.实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。

实验用具鸡血细胞液（5～10mL）；体积分数为95％的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为0．1g／mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2mol／L和0．015mol／L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯（100mL，1个，50mL，500mL，各2个），漏斗，试管（20mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒（100mL，1个），纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。

课时安排一课时课前准备制备鸡血细胞液，方法是：将质量浓度为0.1g／mL的柠檬酸钠溶液100mL，置于500mL烧怀中，注入新鲜的鸡血（约180mL），用玻璃棒搅拌，使其充分混合，以免凝血。

静置于冰箱内一天，使血细胞自行沉淀。

（也可以用离心机离心2 min（转速1000转/分）。

用吸管吸去上清液。

板书（提前写好）DNA的粗提取与鉴定实验原理：1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。

2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。

3.DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。

方法步骤：1．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。

人类基因组DNA的提取及SBMA基因的诊断一、实验目的初步了解人基因组DNA提取方法，掌握人类基因组DNA在遗传病的分子诊断中的应用。

初步掌握分子诊断中常用的分子生物学技术，初步掌握动态突变导致人类遗传病的基因诊断分析方法。

二、实验原理1.人类基因组DNA的提取采用非酶法提取基因组DNA。

非酶法提取基因组DNA是应用饱和氧化钠溶液通过脱水和沉淀作用将细跑中蛋白析出，同时利用SDS结合蛋白质，从而将基因组DNA提取出来。

这种方法不需要使用蛋白酶K和其他的有机溶剂，大大降低了对操作者的危害。

2.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳的分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。

但由于其孔径相比于蛋白质太大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。

电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。

常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。

琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。

3.SBNA基因的诊断脊髓延髓肌萎缩症（SBMA，Spinal and Bulbar Muscular Atrophy），别称为X-连锁脊髓延髓肌萎缩症，又称Kennedy病（肯尼迪氏症），是一种迟发的X-连锁隐性遗传性神经系统变性疾病，属三核苷酸重复扩增的神经变性病，主要累及下运动神经元、感觉系统和内分泌系统。

一、材料为了方便起见，我们注明了本室所用培养基、试剂及在附录6.6仪器的型号和来源，供读者参考。

(一)仪器(见附录6．6)(二)器皿(见附录6．6)(三)菌种大肠杆菌K-12HBl0l(pBR322)(四)培养基1.LB液体培养基：(0．5％)1.5克精解蛋白胨(上海禽蛋二厂，生化试剂或日本po1ypepton，下同)。

(1％)3克，酵母浸出粉(上海酵母厂，生化试剂或Oxoid英国或difCo美国，下同)。

(0.5%)1．5克，氯化钠(上海南汇彭镇营房化工厂，分子量58．44，分析纯，下同)。

(1％)3克葡萄糖(上海化学试剂采购供应站，分子量198．17，分析纯，下同)。

按上述配方用重蒸水(以ddH20表示，下同)溶解至300毫升。

用10mol/LNa0H调pH至7．2－7．4。

分装于150毫升三角烧瓶中，每瓶30毫升。

然后置高压蒸汽锅以10342l.4帕(15磅／时2)，灭菌20分钟。

2．M9液体培养基A液：NaHPO4.2H2O(上海化学试剂二厂，分子量178．05，分析纯)12克KH2PO4(上海化学试剂二厂，分子量136．08，分析纯6克NH4Cl(上海无机化工研究所，分子量53．49，分析纯2克NaCl1克蛋白胨10克重蒸水定容至1800毫升按上述配方配制A液1800毫升，分装于500毫升三角烧瓶中，每瓶180毫升。

B液：MgSO4.7H20(上海金山尖塔化工厂，分子量303．30，分析纯，下同)0.26克葡萄糖8克重蒸水定容至200毫升按上述配方配制B液，分装于100毫升/250毫升三角瓶，共2只。

将A液与B液置高压蒸汽消毒锅中，以55158.08帕(8磅／时2)，灭菌30分钟。

接种前，在无菌室内用灭菌移液管吸20毫升B液加入180毫升/500毫升三角瓶的A液中，即成200毫升的M9液体培养基。

3.抗菌素：氨苄青霉素（Amp）临用时无菌水配制在灭菌有盖试管中，母液浓度为100毫克/毫升。

人类基因组DNA的提取与鉴定实验一人类基因组DNA的提取与鉴定实验目的1、学习人类基因组DNA的提取原理和方法。

2、熟悉应用分子生物学实验常用仪器。

实验原理哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA，除特殊要求外，白血球、肝或脾组织是最常用的材料。

原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞；有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如用口腔上皮脱落细胞、发根细胞。

根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏，保持DNA分子的完整；（3）将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。

在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。

一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。

这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

一、材料一份提取总DNA的细胞或组织1.5ml Eppendorf管、微量移液器与吸头、15ml离心管、三角瓶（500或1000ml）。

二、设备离心机、电子天平、恒温水浴箱、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、微波炉或沸水浴、透射紫外灯。

三、试剂1．细胞核裂解液(STE)：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA2．0.8%（W/V）标准琼脂糖；3．0.5×TBE缓冲液4．其他试剂：TE缓冲液或重蒸水、氯仿/异戊醇（24:1，V/V）、异丙醇或无水乙醇、电泳加样缓冲液、溴化乙锭（EB）四、操作步骤（酚法抽提染色体DNA）（一）DNA的提取1. 采集口腔粘膜脱落细胞，用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。

实验名称：DNA提取与鉴定实验日期：2023年3月15日实验者：张三实验目的：1. 学习DNA提取的基本原理和操作步骤。

2. 掌握DNA纯化、定量和鉴定方法。

3. 了解DNA在生物科学研究中的应用。

实验原理：DNA是生物体内携带遗传信息的分子，存在于细胞核、线粒体和叶绿体中。

DNA提取是分子生物学研究中的重要技术之一，用于获取纯化的DNA样品，为后续实验提供材料。

本实验采用苯酚/氯仿法提取DNA，并通过紫外分光光度法测定DNA浓度和纯度。

实验材料：1. 人发样本2. 10×TE缓冲液3. 5M NaCl溶液4. 95%乙醇5. 70%乙醇6. 1×TAE缓冲液7. 1%琼脂糖凝胶8. 紫外分光光度计9. 离心机10. 电泳仪实验步骤：1. 将人发样本剪成小段，用剪刀剪碎，置于研钵中。

2. 向研钵中加入1ml 10×TE缓冲液，研磨至无颗粒状物质。

3. 将研磨好的样本转移至离心管中，加入2ml苯酚/氯仿溶液，剧烈振荡5分钟。

4. 12,000rpm离心15分钟，将上清液转移至新的离心管中。

5. 向上清液中加入等体积的95%乙醇，混匀，静置10分钟。

6. 12,000rpm离心10分钟，弃去上清液。

7. 用70%乙醇洗涤沉淀物，12,000rpm离心5分钟，弃去上清液。

8. 将沉淀物溶于100μl 5M NaCl溶液中，用紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。

9. 将提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

实验结果：1. DNA浓度：50ng/μl2. DNA纯度：A260/A280=1.83. 琼脂糖凝胶电泳结果：DNA条带清晰，与Marker位置一致。

实验讨论：1. 本实验成功提取了人发样本中的DNA，表明实验操作正确。

2. DNA纯度较高，说明提取过程中杂质较少。

3. 琼脂糖凝胶电泳结果显示，DNA分子量与Marker一致，进一步证实了提取的DNA纯度较高。

实验结论：本实验成功提取了人发样本中的DNA，并通过紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳对DNA进行了鉴定。