汉恒生物-慢病毒生产及使用操作手册第二版

慢使用操作指南慢使用操作指南1.慢简介1.1 定义：慢是一种特殊的，能够在细胞中长期存活并进行复制。

1.2 用途：慢广泛应用于基因转导、基因敲除和基因表达等实验研究中。

2.慢使用前准备工作2.1 实验室准备工作2.1.1 实验室空间准备：确保实验室内有足够的操作空间和合适的消毒设备。

2.1.2 材料准备：准备好所需的培养基、细胞培养物、慢载体等。

2.1.3 设备准备：确保离心机、冰箱等设备正常工作，并准备好相关的仪器和器材。

2.2 人员准备工作2.2.1 人员培训：对参与慢操作的人员进行培训，了解操作步骤和安全风险。

2.2.2 个人防护：提供必要的防护装备，如实验服、手套、面罩等。

3.慢操作步骤3.1 细胞培养3.1.1 细胞培养物准备：根据实验需求选择合适的细胞培养物，并进行细胞的预处理和培养。

3.1.2 细胞密度调整：根据实验要求，调整细胞培养物的密度，以保证细胞的正常生长。

3.2 慢感染3.2.1 慢载体注射：将慢载体注射到培养好的细胞中。

3.2.2 感染条件控制：根据实验需求，控制慢感染的时间、浓度和温度等条件。

3.3 细胞培养和检测3.3.1 细胞培养：将感染好的细胞进行培养，并观察细胞的生长状态。

3.3.2 细胞检测：使用相关实验方法，对感染细胞进行检测和分析。

4.实验安全措施4.1 操作环境控制：确保实验室内通风良好，避免慢的扩散和污染。

4.2 废液处理：将产生的废液经过正确处理，避免对环境和人体造成污染和伤害。

4.3 事故应急处理：在发生事故或意外情况时，立即采取应急措施，并及时报告相关人员。

5.附件本文档所涉及的附件，包括但不限于实验记录表格、实验数据文件等。

6.法律名词及注释6.1 慢：指一种具有长周期和潜伏期的。

7.结束语感谢您阅读本文档，如有任何疑问或意见，请随时与我们联系。

汉恒逆转录病毒操作手册一、逆转录病毒的试用装分装与储存1.收到汉恒生物逆转录病毒产品后，请先对逆转录病毒产品进行分装处理，建议20-50μl/管。

如1-2天内使用，则留足够量病毒4℃保存，余下逆转录病毒置于-80℃长期保存。

2.病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前重新测定病毒滴度。

3.反复冻融会降低逆转录病毒滴度：逆转录病毒滴度越低，冻融对滴度的影响越大，108IU/ml的逆转录病毒冻融2次滴度没有显著性差异，第3次冻融开始，每冻融一次滴度降低约10%；滴度107IU/ml滴度逆转录病毒，从第2次冻融开始，每次冻融病毒滴度下降10%-15%。

二、逆转录病毒试用装实验策略与关键知识点1.逆转录病毒感染策略：逆转录病毒本身的病毒滴度不高，感染细胞时病毒消耗量较大，试用装体积较小，建议使用96孔板进行MOI梯度感染测试。

逆转录病毒感染细胞后会反转录并插入基因组形成稳转，因此逆转录病毒感染一般采用感染少量细胞，然后将细胞放大化培养。

而不是直接大量感染。

注意：对于一些传代能力较差的原代细胞，比如BMSC等，建议采用腺病毒感染。

2.逆转录病毒感染关键知识点1）细胞准备：由于试用装体积有限，请使用96孔板准备细胞，逆转录病毒感染细胞前，请确保目的细胞状态良好、无支原体污染。

逆转录病毒感染的时候细胞汇合率为40%～60%间为宜。

2）感染细胞最佳MOI的测定：MOI（感染复数）是指每个细胞感染的病毒数。

逆转录病毒对于不同种类不同来源的细胞，其最适MOI各有差别，原则上最适MOI是感染效率较好的最低MOI。

MOI一般以3：10：30：100的比例递增进行梯度摸索，一般的细胞基础逆转录病毒感染MOI 可从3为开始，即设立4个常规的MOI摸索，即3，10，30，100。

3)助转剂polybrene的选择：实验证明，polybrene可提高逆转录病毒对大部分细胞的感染效率，但polybrene 有一定的细胞毒性，不同细胞对polybrene的敏感度不同，polybrene最常用的工作浓度为5～8μg/ml。

慢病毒感染细胞实验方法一、实验概述培养生长状态良好的目的细胞，根据慢病毒感染预实验结果设计各组实验条件，进行正式感染。

若为荧光标记的慢病毒感染，参照预实验确定的感染时间点，于荧光显微镜下观察GFP表达情况，荧光率达70-80％左右，细胞汇合度达80%左右，收集细胞进入下游实验。

若为抗性基因（如Puromycin）标记的慢病毒感染，感染48 h-72h后，使用抗生素筛选48h，收集细胞汇合度70%-80%左右的生长状态良好的细胞进行下游实验。

二、实验材料1.主要试剂试剂名称试剂来源cat.No.胎牛血清Ausbian VS500TDMEM Corning 10-013-CVR胰酶生工生物工程（上海）股份有限公司T0458-50G Puromycin Clontech 631305D-Hanks 上海吉凯基因技术有限公司配制2.主要仪器仪器名称仪器来源cat.No.荧光显微镜奥林帕斯IX71CO2培养箱日本三洋SANYO MCO-175倒置显微镜上海蔡康光学仪器有限公司XDS-100离心机赛默飞世尔科技(中国)有限公司Fresco 21生物安全柜上海振样创空气净化设备有限公司Bio 1200-Ⅱ-A2三、实验步骤1．准备目的细胞（1）从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻。

（2）完全解冻后，1300 rpm，离心3 min，75%酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。

（3）吸去冻存液上清，加入1 mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3 mL完全培养基的6-cm dish 中，轻轻晃匀后置于37℃、5% CO2培养箱。

（4）24 h后更换一次培养液继续培养，待细胞汇合度达80%左右传代培养，保持细胞良好的生长状态。

2．目的细胞慢病毒感染（1）贴壁细胞：a.处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养基制成3-5×104个/mL细胞悬液，并根据表1接种相应的细胞数到培养板中，继续培养保证感染时铺板量达到15-30%左右。

病毒载体操作安全手册引言根据W HO生物安全手册对感染性微生物的相对危害程度制订的危险度等级的划分标准。

病毒的危险度为 4 级，它对个体和群体的危险均高，通常能引起人或动物的严重疾病，并且很容易发生个体之间的直接或间接传播，对感染一般没有有效的预防和治疗措施。

所以我们需要制定一定的安全注意事项，包括设备的要求、操作人员的防护、操作的规范性以及废弃物的处理等，以避免潜在的危险。

一、病毒房设备要求我们知道细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。

目前超净工作台的广泛使用，很大程度上方便了组织细胞培养工作，并使一些常规实验室有可能用于进行细胞培养。

细胞培养实验室应能进行六方面的工作：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。

病毒房的设备在普通细胞房的基础上要求更高，尤其是其无菌操作设备。

(一)无菌操作区1、无菌操作室：无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离，不能穿行或受其他干扰。

理想的无菌操作室应划为三部分：1（1）更衣室—―供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。

（2）缓冲间—―位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。

（3) 无菌操作间—―专用于无菌操作、细胞培养。

无菌操作间的空气消毒：紫外线灯。

2、二级生物安全柜：生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。

（二）孵育区本区对无菌的要求虽不比无菌区严格，但仍需清洁无尘，因此也应设置在干扰少而非来往穿行的区域。

孵育一般可在恒温培养箱内进行。

（三）制备区在该区主要进行培养液及有关培养用的液体等的制备，如条件有限，可以在操作区进行。

（四）储藏区主要存放各类冰箱、干燥箱、液氮罐、无菌培养液、培养瓶等，此环境也需要清洁无尘。

慢病毒专用转染试剂LentiFit TM使用说明书产品简介：LentiFit TM脂质体转染试剂是一种高效的阳离子脂质体转染试剂。

与其他脂质体转染试剂相比，汉恒生物独立研发的LentiFit TM脂质体转染试剂具有转染效率高，重复性好，操作简单，无明显细胞毒性，抗血清干扰等优点。

对于大多数细胞，用LentiFit TM转染后72小时内不更换培养液无明显细胞毒性。

同时，血清的存在不影响LentiFit TM的转染效率，这样可以减小无血清对细胞的损伤。

基于以上优点，LentiFit TM常用做慢病毒包装的转染试剂。

包装清单以及储存条件：试剂名货号储存条件规格有效期LentiFit TM转染试剂Let10004℃保存 1 mL12个月使用方法：1.细胞培养：以1个10 cm培养皿转染293T细胞为例，转染前一天接种细胞(20-24小时)，接种细胞约3.5×106，接种体积10 mL，确保第二天转染时细胞汇合度（confluent）能达到约50%~70%。

2.在进行转染步骤前，把10 cm培养皿中的培养液更换成新鲜细胞培养液，培养液的体积为5 mL，放回培养箱中继续培养，并准备转染体系（步骤3-6）。

3. 把LentiFit TM脂质体转染试剂轻轻混匀。

4. 对于待转染的10 cm培养皿中的细胞，取一只洁净无菌离心管，加入24 µg质粒（目的质粒和辅助质粒的比例根据不同包装系统进行调整）到500 µL DMEM溶液，用枪轻轻吹打混匀。

5. 取另一只洁净无菌离心管，加入500 µL DMEM溶液，再加入40 µL LentiFit TM，用枪轻轻吹打混匀,室温放置5分钟。

6. 将步骤4与5中的质粒溶液与LentiFit TM溶液混合，用枪轻轻吹打混匀。

不可V ortex 或离心。

室温孵育20分钟。

有可能出现絮状沉淀物，属正常现象，不会影响转染效率。

7. 将转染复合物逐滴加入到培养皿中，轻轻“8”字形摇晃混匀后，放回培养箱继续培养。

慢病毒载体构建及包装操作手册目录慢病毒收到后的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、慢病毒包装和浓缩四、感染目的细胞附1. 汉恒生物慢病毒质粒列表附2. 慢病毒滴度测定方法简介附3. 慢病毒MOI感染参数附4. 汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较慢病毒安全使用和注意事项➢慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。

2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。

3)操作病毒时特别小心病毒溅出。

如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。

接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。

4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。

5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。

6)实验完毕用香皂清洗双手。

➢慢病毒收到后的注意事项1)慢病毒的储存用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。

注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。

b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。

2)慢病毒的稀释用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。

一、整体实验流程二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLV TM系列质粒。

1、载体信息（见附表1）2、细胞株：我们采用293T作为慢病毒的包装细胞。

该细胞系为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM+10% FBS+双抗。

慢病毒使用操作指南慢病毒是一种常用的实验工具，广泛应用于细胞和分子生物学研究。

本文档旨在提供慢病毒使用的操作指南，帮助研究人员更好地利用慢病毒进行实验研究。

第一部分：慢病毒基本知识1. 什么是慢病毒？慢病毒是一种具有RNA基因组的病毒，属于反转录病毒。

它能够将自身的RNA基因组逆转录成DNA，再与宿主细胞的基因组融合，长期稳定地存在于宿主细胞中。

2. 利用慢病毒进行基因转染的优势相比其他常用的基因转染方法，慢病毒具有以下优势：- 高效性：慢病毒能够高效地转染多种类型的细胞，包括非分裂细胞。

- 长期稳定性：慢病毒转染的基因能够长期稳定地存在于宿主细胞中。

- 遗传稳定性：慢病毒转染的基因可以遗传给后代细胞，因此适用于长期实验研究。

第二部分：慢病毒使用的关键步骤1. 选择合适的慢病毒载体慢病毒载体是慢病毒的基础构建单元，其中包含转录启动子、报告基因等必要的元件。

根据实验需要选择合适的载体。

2. 包装慢病毒慢病毒的包装是将慢病毒载体与包装载体共转染至特定细胞株，通过包装载体中的包装酶，将慢病毒的RNA基因组逆转录成DNA，形成可复制的慢病毒。

3. 提取慢病毒经包装后的细胞培养基中含有包装好的慢病毒。

可通过超速离心等方法，将细胞培养物离心，提取慢病毒。

4. 病毒滴定病毒滴定是用来确定病毒滴度的重要步骤。

通过适当稀释提取的慢病毒，将其感染指定细胞株，计算出感染单位的浓度。

5. 慢病毒感染及筛选将提取的慢病毒添加至目标细胞中，通过细胞培养和筛选，筛选出具有所需基因的细胞株。

第三部分：慢病毒使用的注意事项1. 安全操作慢病毒具有一定的传染性，进行实验时需要遵守生物安全操作规范，佩戴一次性手套、口罩等个人防护装备，避免直接接触慢病毒。

2. 避免交叉感染实验室中使用慢病毒时，应尽可能避免交叉感染。

定期对实验室环境进行消毒，使用一次性材料，避免共享器械等措施可以减少交叉感染的风险。

3. 合理控制病毒滴度对于不同类型的细胞，需要确定合适的病毒滴度，以避免过度感染或感染不足的情况。

慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。

区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

基本概述慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。

该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。

在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。

慢病毒的应用目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。

由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。

采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。

在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。

当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。

U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。

在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。

慢病毒使用操作手册：1 慢病毒使用操作2 慢病毒安全使用规范3 悬浮细胞感染方法概要4 相关专业术语(详情可参考公司网站FAQ)5 细胞培养器皿的相关参数1、慢病毒使用操作手册1.1 慢病毒的储存与稀释:1.1.1 病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）A．病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。

1.1.2 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。

1.2 慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞1.2.1 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invabio提供的慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。

如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）1.2.2 慢病毒感染目的细胞预实验1.2.2.1 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项A．测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。

B．在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。

C． Invabio提供的病毒单位为TU/ml, 即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。

IPS操作指南第四版IPS简介：iPS细胞是通过基因转染技术（gene transfection）将某些转录因子导入动物或入的体细胞使，体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonic stemcell,ESC）细胞样的多潜能细胞。

现在大多是通过病毒携带特定的转录因子进入体细胞内，来获得多能性干细胞。

2006年日本京都大学Shinya Yamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。

他们把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。

现分别介绍一下小鼠的和人的iPS的诱导步骤。

一、实验材料慢病毒包装体系：慢病毒表达质粒plvx-OCT4、plvx-SOX2、plvx-KLF4和plvx-c-MYC；辅助质粒PSPAX2和PMD2；病毒包装细胞：293T细胞；ES Feeder细胞：MEF（C57）。

二、实验仪器和耗材（一）实验仪器二级安全柜、37度培养箱、4度冰箱、液氮储存器、倒置显微镜、低温离心机。

（二）实验耗材PBS、无菌水、明胶粉、DMEM培养基、FBS、非必须氨基酸、β-巯基乙醇、胰酶、血清替代物（SR）、mTESR1、T75培养瓶、无菌水、15ml离心管、50ml离心管，巴氏管等。

三、ips诱导方法（一）Feeder细胞1、Feeder细胞的分离（MEF）取妊娠13.5-14.5d的孕鼠，在无菌情况下取出胎鼠，去除鼠头，尾，四肢及内脏，然后用PBS进行冲洗。

将胎体剪碎成小于1mm2的组织块，1000rpm，3min，去掉上层PBS，加入0.25%胰酶-0.04%EDTA2~3ml浸泡组织块，常温消化2~3min。

轻微吹打，待较多细胞溢出后，加入等量的10%FBS DMEM终止消化，通过100目滤网过滤后，将获得的液体离心，1000rpm，5min。

资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。

所以要在细胞购进时就进行冻存。

2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。

4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。

5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。

6. 细胞计数。

7.将细胞离心，1000rpm，2min。

8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。

10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。

二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。

2. 消化细胞，方法同上。

3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。

密度为3×105个/ml。

4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。

三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。

2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。

3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。

4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。

5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。

慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。

以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。

二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pHBLV TM系列质粒。

1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。

贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。

用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。

为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。

在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。

3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。

计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。

计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n万/mL 细胞浓度。

4、细胞离心，1000rpm，5min。

慢病毒使用操作指南1. 引言1.1 目的本文档旨在提供关于慢病毒使用的详细操作指南，以确保实验室人员能够正确、安全地处理和利用该种类病毒。

2. 概述2.1 定义与特点- 慢病毒是一类具有复制缓激活机制并且感染后可长期存在于寄主体内的RNA或DNA 症候群相关性（SAR）等多个领域中发挥重要作用。

3. 实验前准备工作在进行任何涉及到潜在危险生物材料如此类型之前, 快速评估风险，并采取适当措施来最小化这些风险。

4 . 材料清单：下面列出了完成所需任务时可能需要的基本设备和试剂: - 生物安全柜级别II (BSL-2) 或更高级别环境下进行所有步骤；- 防护手套、防护眼镜/面罩和实验服;...5 . 实验流程：进行以下步骤以成功执行您对操纵蠕虫样品库存的需求:5.1 准备工作- 确保实验室环境符合慢病毒操作所需要的生物安全级别；- 检查所有设备和试剂是否齐全并处于良好状态。

5.2 培养基准备：...6 . 安全注意事项与风险评估7 . 应急措施及处理方法8 . 相关法律名词及注释：在本文档中，以下是一些常见使用到的法律名词以及其相应解释说明。

a) 生物安全柜 (Biosafety Cabinet, BSC):是用来提供对人员、产品和环境进行防护，并且在其中进行微生物学或细胞培养等活动时，提供无菌条件下能够有效地限制有害因素扩散传播而又不影响正常运行过程。

9. 结束语本文档涵盖了详尽的慢病毒使用操作指南，旨在确保实验室人员正确理解并遵循相关规定以最大程度上降低任何可能存在的危险性。

10. 文档涉及附件：请参考随信发送之文件列表。

慢病毒操作资料说明慢病毒操作资料说明1、Hexadimethrine bromide.pdf：这是Hexadimethrine bromide（别名Polybrene）的说明书，该试剂用于提高慢病毒的感染效率，在病毒滴度测定和病毒感染实验中均需使用；2、Lenti-X™ Concentrator.pdf：这是Lenti-X Concentrator的说明书，该试剂用于病毒粒子的浓缩纯化；3、Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf：这是过表达慢病毒（用于基因过表达）的操作说明书4、Lenti-X™ shRNA Expression Systems User Manual.pdf：这是干扰慢病毒（用于基因干扰）的操作说明书5、pLVX-shRNA1 Vector Information.pdf：pLVX-shRNA1慢病毒干扰载体说明书6、pLVX-IRES-Neo Vector Information.pdf：pLVX-IRES-Neo 慢病毒过表达载体说明书7、慢病毒（Lentivirus）载体.pdf：慢病毒载体介绍8、Lenti-X™ Lentiviral Packaging Systems FAQs.pdf：慢病包装系统常见问题介绍9、病毒纯化-PEG6000.doc：病毒纯化方法10、病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc：病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒；11、病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc：病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒；12、Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.pdf：慢病毒包装、纯化、滴度测定操作指南，供理论学习；13、C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf：磷酸钙转染方法；14、慢病毒实验方法.doc：慢病毒包装报告单；15、慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染.doc：慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染操作指南；。

慢病毒使用操作手册简介：慢病毒（Lentivirus）是一种常用于生命科学研究中的病毒载体，其具有较强的基因转染能力和稳定的基因表达特性。

本操作手册旨在向研究者提供一个详细的慢病毒使用指南，帮助他们顺利进行慢病毒基因转染实验并获得准确可靠的研究结果。

一、慢病毒基本原理慢病毒属于反转录病毒，其基因组为单链RNA。

慢病毒在寄主细胞内通过逆转录过程将RNA转录为DNA，随后将DNA插入宿主基因组中。

这使得慢病毒成为将外源基因稳定集成到宿主基因组中的理想工具。

二、慢病毒使用前准备1. 实验室条件准备：确保工作台面干净整洁，并准备好所需的培养物、培养器具和试剂。

2. 慢病毒载体制备：根据实验需要，选择合适的慢病毒载体，并通过慢病毒包装系统将目标基因插入载体中。

三、慢病毒转染实验步骤1. 细胞培养：将目标细胞接种在培养皿中，并选择合适的培养基进行细胞培养。

2. 慢病毒感染：将预制的慢病毒悬液加入培养皿中，控制感染浓度和时间，以实现最佳的感染效果。

3. 筛选标记：根据实验需要，在感染后适当的时间点添加筛选标记物，如抗生素或荧光标记剂。

4. 选择和扩增：将受筛选标记影响的细胞单克隆分离，扩增和保存。

5. 验证表达：使用合适的实验方法，如western blot或PCR等，来确认目标基因的表达情况。

6. 结果分析：对实验结果进行统计学分析，并绘制适当的图表。

四、注意事项和常见问题解决方案1. 实验前应认真阅读文献，了解慢病毒的基本原理和实验操作流程。

2. 制备慢病毒载体时，应仔细验证目标基因的序列和正确插入。

3. 慢病毒感染时应注意控制感染浓度和时间，避免细胞毒性和非特异性感染。

4. 筛选标记物的选择应根据实验需要和细胞类型进行合理选择。

5. 实验过程中，注意严格遵守实验室安全和生物安全操作规范。

6. 常见问题解决方案：如遇到感染效率低或细胞毒性问题，可以尝试优化感染条件或调整细胞培养条件。

如果基因表达不稳定，可以尝试选择合适的筛选标记物或优化基因载体。

慢病毒用户使用手册1.慢病毒概述慢病毒（Lentivirus）是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它可以感染分裂细胞和非分裂细胞，可有效地感染包括几乎所有的哺乳动物细胞、干细胞和原代细胞。

此外，慢病毒具有嗜核性，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而可以在体内较长期表达。

慢病毒的多种优点，使它成为基因传递的强大而有效的工具，获得了广泛的应用。

2.慢病毒安全操作规范锐赛生物提供的是第三代的慢病毒载体系统，包括1个慢病毒表达载体和3个包装辅助质粒，大大降低了发生同源重组的概率，降低了产生复制能力病毒的可能性。

同时，本系统的慢病毒颗粒是自身失活型（SIV）病毒，即病毒感染靶细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒，从而提高了安全性。

尽管如此，该病毒仍然具有潜在的生物学危险，因此建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假病毒进行生物学实验。

此外，建议将本系统生产的慢病毒视为二级生物安全水平的生物，使用时请参照如下基础规范进行实验：1.在进入实验室工作时，穿着实验服或隔离服，戴上手套和口罩。

2.操作病毒时请尽量使用生物安全柜，小心不要产生气雾或液体飞溅。

3.如果使用普通超净工作台操作病毒，请在打开含有病毒的容器盖子前关闭超净台的风机（由于超净台风向外排，有可能将病毒吹向操作者），并尽快操作；尽量缩短开盖后的病毒在关闭了排风机的超净台中停留的时间，封闭所有含有病毒的容器、耗材、废液后，再打开超净台风机。

4.如果操作时台面有病毒污染，请立即用75%酒精加1%的SDS 溶液擦拭。

接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请用75%酒精加1%的SDS 溶液或于84 消毒液浸泡过夜后弃去。

5.如需离心，应使用密封性好的离心管，或用封口膜封口后离心。

6.实验结束，脱掉手套前先消毒再摘除手套，随后用肥皂洗手。

LipoFiter TM 转染试剂操作说明保存条件：4℃保存，一年有效（避免反复冻融）。

LipoFiter TM 简介LipoFiter TM 脂质体转染试剂( LipoFiter TM Liposomal Transfection Reagent )是一种适合于把质粒或其它形式的核酸,以及核酸蛋白复合物转染到培养的真核细胞中的高效阳离子脂质体转染试剂。

LipoFiter TM 优点1、转染效率高，重复性好，操作简单。

2、无明显细胞毒性，用LipoFiter TM 转染细胞后，对于大多数细胞72 小时内不更换培养液无明显细胞毒性。

3、LipoFiter TM 对于贴壁细胞和悬浮细胞都适用，并且可以用于稳定表达细胞株的筛选。

LipoFiter TM 使用说明1.细胞培养：以293T 细胞为例，转染前一天(20-24 小时) ~0.4×106 细胞(具体的细胞数量据细胞大小和细胞生长速度而定)铺到六孔板内，使第二天细胞汇合度（confluent）能达到约50%~70%。

注1：汉恒生物LipoFiter TM 对细胞毒性极小，因此无需通过增大细胞汇合度来抵抗转染试剂毒性，我们实验证明，50%~70% confluent 时细胞的转染效率可以达到最优。

注2：其它培养板或培养皿参考六孔板进行操作，其他培养介质如培养板，培养皿的详细细胞接1种数目请按照比例自行换算。

2.在进行下述转染步骤前，把六孔板每孔内换成新鲜细胞培养液。

培养液的体积约为2 ml。

注：其他培养介质培养液体积参见《各种培养介质下LipoFiter TM 转染DNA 详表》，抗生素、Glutamine 等对LipoFiter TM 转染并无影响。

如果LipoFiter 对目的细胞毒性较大，建议去除转染体系内的抗生素。

3.把LipoFiter TM 脂质体转染试剂轻轻混匀。

4.对于待转染的六孔板中一个孔的细胞，取一只洁净无菌离心管，加入4 μg 质粒DNA（其他培养介质DNA 用量参见附表）到250 μl DMEM 溶液，用枪轻轻吹打混匀。