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高效液相色谱仪使用中常见故障及解决方法液相色谱常见问题解决方法1 高效液相色谱仪系统液相色谱仪紧要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统构成。
对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的紧要部位。
2 常见问题及解决方法高效液相作为一种高精密仪器，假如在使用过程中不依照正确操作的话，就简单导致一些问题。
其中常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。
1.柱压问题柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要紧密注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分别效果及保留时间等紧密相关。
所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50PSI（3.3 Bar）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。
压力过高、过低都属于柱压问题。
压力过高：这是高效液相在使用中常见的问题，指的是压力蓦地上升，一般都是由于流路中有堵塞的原因。
此时，我们应当分段进行检查。
（1）.首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充分液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，假如液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。
处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。
假如液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查；（2）.打开Purge阀，使流动相不经过柱子，假如压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。
处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。
假如压力降至100PSI （6.7 Bar）以下，过滤白头正常，在检查；（3）.把色谱柱出口端取下，假如压力不下降，则是柱子堵塞。
处理方法：假如是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。
假如是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。
假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。
这时，假如柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很简单造成柱效下降，所以尽量少用。
正相柱还是反相柱特别注意HPLC使用过后的系统清洗：含有缓冲盐溶液的流动相的清洗方法：1、先用100%的纯水冲洗，打开排放阀，用3~5ml/min的流量，洗二十分钟左右后停泵。
此举主要是针对吸液系统、泵头、进出口单向阀等体积较大的空间的清洗2、再用95：5的甲醇/水清洗整个系统，关闭排放阀，用1ml/min的流量，洗30~60分钟后停泵。
此举主要是用水清洗整个系统中的盐，用5%的甲醇主要是为了保护色谱柱。
3、最后用100%的甲醇清洗整个系统，用1ml/min的流量，洗2分钟左右，然后关机。
如果流动相中不含盐，则使用上述第三步清洗即可。
当固定相的极性大于流动相的极性时，可称为正相分配色谱或简称正相色谱.若固定相的极性小于流动相的极性时，可称为反相分配色谱或简称反相色谱.在用于正相色谱时，可使用如正己烷的低极性流动相，在用于反相色谱时，可使用甲醇或水的强极性流动相.正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica）以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2，APS）和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。
这种填料做成的柱子就称为正相柱.反向色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相,常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等.这种填料做成的柱子就称为反相柱.正相柱和反相柱缘于，柱上固定相与流动相之间极性的对比。
若固定相极性大于流动相，为正相柱，反之，为反相柱。
通常为反相柱应用较多。
所有色谱均适用，包括纸色谱和薄层。
现在一般都用反相，正相在样品对水敏感等特殊情况下才使用。
正相的固定性是极性的，流动相是非极性的，适于分离强极性物质。
反相的固定性是非极性的，流动相是极性的，适于分离弱极性物质。
正相色谱柱与反相色谱柱的区别本质上是填料(固定相)的不同,正相色谱柱填料极性强,洗脱顺序由弱到强；反相色谱柱填料极性弱，洗脱顺序由强到弱。
以下是详细说明：1、正相色谱正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica）以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2，APS）和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。
正相柱反相柱的使用特别注意HPLC使用过后的系统清洗：含有缓冲盐溶液的流动相的清洗方法：1、先用100%的纯水冲洗，打开排放阀，用3~5ml/min的流量，洗二十分钟左右后停泵。
此举主要是针对吸液系统、泵头、进出口单向阀等体积较大的空间的清洗2、再用95：5的甲醇/水清洗整个系统，关闭排放阀，用1ml/min的流量，洗30~60分钟后停泵。
此举主要是用水清洗整个系统中的盐，用5%的甲醇主要是为了保护色谱柱。
3、最后用100%的甲醇清洗整个系统，用1ml/min的流量，洗2分钟左右，然后关机。
如果流动相中不含盐，则使用上述第三步清洗即可。
当固定相的极性大于流动相的极性时，可称为正相分配色谱或简称正相色谱.若固定相的极性小于流动相的极性时，可称为反相分配色谱或简称反相色谱.在用于正相色谱时，可使用如正己烷的低极性流动相，在用于反相色谱时，可使用甲醇或水的强极性流动相.正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica）以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2，APS）和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。
这种填料做成的柱子就称为正相柱.反向色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相,常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等.这种填料做成的柱子就称为反相柱.正相柱和反相柱缘于，柱上固定相与流动相之间极性的对比。
若固定相极性大于流动相，为正相柱，反之，为反相柱。
通常为反相柱应用较多。
所有色谱均适用，包括纸色谱和薄层。
现在一般都用反相，正相在样品对水敏感等特殊情况下才使用。
正相的固定性是极性的，流动相是非极性的，适于分离强极性物质。
反相的固定性是非极性的，流动相是极性的，适于分离弱极性物质。
正相色谱柱与反相色谱柱的区别本质上是填料(固定相)的不同,正相色谱柱填料极性强,洗脱顺序由弱到强；反相色谱柱填料极性弱，洗脱顺序由强到弱。
以下是详细说明：1、正相色谱正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica）以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2，APS）和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。
反相HPLC色谱柱的推荐再生步骤是什么？1. 取下色谱柱，然后重新连接到色谱仪上，让液体/气体反方向流过色谱柱。
2. 用HPLC 级水冲洗掉盐/缓冲液。
以1毫升/分钟的速度把25 毫升水泵入色谱柱。
3. 用25 毫升异丙醇冲洗色谱柱。
4. 用25 毫升二氯甲烷冲洗色谱柱。
5. 用25 毫升正己烷冲洗色谱柱。
6. 再次用25毫升二氯甲烷冲洗色谱柱。
7. 用25毫升异丙醇冲洗色谱柱。
8. 按正确的流动方向，把色谱柱重新连接到色谱上。
用不含缓冲液的流动相冲洗色谱柱，然后重新倒入缓冲液。
9. 用25 到50 毫升流动相平衡色谱柱。
10. 注入标准物或样品，检查性能是否恢复。
色谱柱的保养在正常情况下，色谱柱至少可以使用3—6个月，能完成数百次以上的分离。
但是，若操作不慎，将使色谱柱很易损坏而不能使用。
因此为了保持柱效、柱容量及渗透性，必须对色谱柱进行仔细地保养。
1．色谱柱极易被微小的颗粒杂质培塞，使操作压力速升高而无法使用，因此必须将流动相仔细地蒸馏或用0.45μm孔径的滤膜过滤。
在流动相组贮槽与色谱柱间，安装0.45μm 孔径的过滤器。
在柱子上端接头处装上多孔过滤片，以防止固体颗粒进入色谱柱中。
在水溶液流动相中，细菌容易生长，可能堵塞筛板加入0.01％NoHa能防止能防止细菌生长。
2．最好使用进祥阀进样，以防止注射器进样时、注射隔膜碎屑堵塞柱子入口。
3．对硅胶基键合相填科，水溶液流动相的PH值不得超出2—8．5的范围，使温度不宜过高。
柱子在酸性或碱性条件下使用之后，。
应依次用水、甲醇清洗，对暂时不用而需要较长时间保存的柱子，要用纯甲清洗，柱子两端用金属螺帽封闭，保存于干净的有机溶剂中。
4．要防止色谱柱被振动或撞击，否则柱内填料床层产生裂缝和空隙，会使色谱峰出现“驼峰”或“对峰”。
5．要防止流动相逆向流动，否则将使固定相层位移，柱效下降。
6．使用保护柱。
连续注射含有未被洗脱样品时，会使柱效下降，保留值改变。
色谱柱冲洗方法（最新版4篇）篇1 目录1.色谱柱冲洗的必要性2.色谱柱冲洗的方法2.1 水冲洗法2.2 有机溶剂冲洗法2.3 缓冲盐冲洗法2.4 反冲法3.色谱柱冲洗的注意事项篇1正文色谱柱是液相色谱系统中的核心部件，它在样品分离过程中起着至关重要的作用。
然而，在色谱柱使用过程中，柱内可能会积累一些脏物或盐析物，影响色谱柱的分离效果。
因此，对色谱柱进行定期冲洗是非常必要的。
下面我们将介绍几种常见的色谱柱冲洗方法。
首先，水冲洗法是最常用的色谱柱冲洗方法。
此方法操作简便，只需将色谱柱连接到水流系统上，使用纯水进行冲洗。
篇2 目录一、色谱柱冲洗的必要性二、色谱柱冲洗的方法1.水冲洗法2.纯有机相冲洗法3.缓冲盐冲洗法4.反冲法5.专用清洗剂冲洗法三、不同类型色谱柱的冲洗方法1.反相色谱柱2.正相色谱柱3.离子交换色谱柱4.凝胶渗透色谱柱四、色谱柱冲洗的注意事项篇2正文色谱柱是高效液相色谱系统中的核心部件，其在样品分离过程中起到关键作用。
然而，在长时间的使用过程中，色谱柱内部可能会积累一些脏物，影响色谱柱的分离效果。
因此，对色谱柱进行定期冲洗是非常必要的。
色谱柱冲洗的方法有很多种，下面我们分别进行介绍：1.水冲洗法：这是一种最常用的色谱柱冲洗方法。
使用纯水或含有少量缓冲盐的水进行冲洗，可以有效去除色谱柱内部的脏物。
对于反相色谱柱，可以使用纯水或甲醇/水混合溶液进行冲洗。
2.纯有机相冲洗法：在冲洗色谱柱时，可以使用纯有机溶剂（如乙腈、甲醇等）来代替水相。
这种方法适用于具有疏水性的色谱柱，如 C18、C8 等。
3.缓冲盐冲洗法：在冲洗过程中，可以加入一定浓度的缓冲盐，以保持色谱柱内部的离子强度。
这种方法适用于离子交换色谱柱和凝胶渗透色谱柱。
4.反冲法：这是一种比较彻底的冲洗方法，可以有效去除色谱柱内部的沉淀物。
在反冲过程中，需要将色谱柱的流动相改为反向，并提高流速。
然而，反冲过程可能会对色谱柱造成一定程度的损伤，因此需要谨慎操作。
色谱柱的使用说明:（1）色谱柱使用前注意事项:色谱柱的储存液无特殊说明, 均为评价报告所示的流动相。
在使用前, 一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。
在反相色谱中, 如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂,应先用10％左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下, 否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出, 堵塞色谱柱。
（2）流动相:流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯, 配流动相的水最好是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。
如果将所配得流动相再经过0.45μm的滤膜过滤一次则更好, 尤其是含盐的流动相。
另外, 装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。
以常规硅胶为基质的键合相填料通常的PH值适用范围是2.0-8.0, BDS C18适合于碱性化合物, PH值适用范围为2.0-10.0。
当必须要在PH值适用范围的边界条件下使用色谱柱时, 每次使用结束后立即用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗, 并完全置换掉原来所使用的流动相。
（3）样品:样品也要尽可能清洁, 可选用样品过滤器或样品预处理柱（SPE）对样品进行预处理；若样品不便处理, 要使用保护柱。
在用正相色谱法分析样品时, 所有的溶剂和样品应严格脱水。
2.色谱柱的保存（1）反相色谱柱每天实验后的保养:使用缓冲液或含盐的流动相, 实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟, 洗掉色谱柱中的盐, 再用甲醇冲洗30分钟。
注意: 不能用纯水冲洗柱子, 应该在水中加入10%的甲醇, 防止将填料冲塌陷。
（2）长期保存色谱柱:如色谱柱要长时间保存, 必须存于合适的溶剂下。
对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中, 正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中, 离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中, 并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。
储存的温度最好是室温。
3.色谱柱的再生因为色谱柱是消耗品, 随着使用时间或进样次数的增加, 会出现色谱峰高降低, 峰宽加大或出现肩峰的现象, 一般来说可能是柱效下降。
如何清洗和保存反相色谱柱？如何清洗和保存反相色谱柱？怎样处理新买来的色谱柱？用水来冲洗色谱柱有什么后果？分析结束后如何冲洗？这些问题是HPLC分析人员常常面对的。
本文就这些问题介绍一些色谱柱的维护和保养经验。
新色谱柱的处理对于新购买的色谱柱，首先应该做些什么呢？几乎所有的色谱柱在出厂时都保存在它们测试时的溶剂中，通常是60-80%的甲醇/水，这与在反相色谱中使用的流动相是兼容的，所以可以直接转换到所要使用的流动相。
另外，也可以先用20-30ml流动相中的强溶剂甲醇、乙腈或者四氢呋喃冲洗色谱柱，然后再转换到所需流动相。
需注意的是，在冲洗或平衡色谱柱时，重要的是溶剂的体积而不是冲洗时间。
提高流速可以缩短冲洗平衡时间。
如果使用有机溶剂和水或缓冲溶液，10倍柱体积的流动相可以使色谱柱达到冲洗平衡。
如果流动相使用离子对试剂，则需20-50倍柱体积的流动相。
对于直径4.6mm的色谱柱，其柱体积可以按下式估算：Vm=0.1L其中，Vm为柱体积（ml），L为色谱柱的长度（cm）。
故一个15cm x 4.6mm色谱柱大概的柱体积为1.5ml。
直径2.1mm的色谱柱的柱体积大约为4.6mm的20%，所以5cm x 2.1mm 的色谱柱含溶剂为100uL。
对于B型高纯硅胶基质填料的色谱柱，色谱柱的再现性很规范，这与15年前普遍使用的、不是很纯的A型硅胶基质填料的色谱柱形成鲜明对比，但很多用来分析产品和原料的“流传”下来的HPLC方法仍沿用这种色谱柱。
有的时候，新的色谱柱需要运行几针分析样品才能使保留时间和峰面积保持稳定。
这种情况对于新型的色谱柱比较好一些，但仍需一段时间的磨合。
有时可以通过运行高浓度的样品或对照品来加速最初的色谱柱平衡。
例如，如果你看到运行了几针50ng的对照品，其保留时间和峰面积有所飘移，试一试运行1ug的对照品。
这种方法常常可以加速柱平衡的时间。
用水冲洗色谱柱我们常常会被问到这样一些问题：“我的样品是水溶性的，流动相中含有缓冲盐和甲醇，我不能用水来冲洗所有水溶性的污染物吗？”回答是：“不可以”。
hplc反相色谱柱活化
HPLC反相色谱柱活化是指将已使用过的反相色谱柱恢复至其最初的分离性能的过程。
活化的目的是去除柱上的杂质和残留样品，以提高分析的准确性和重复性。
常用的HPLC反相色谱柱活化方法包括：
1. 水/有机溶剂洗脱：将色谱柱用水/有机溶剂进行洗脱，去除残留的物质。
通常使用的溶剂包括乙酸甲酯、乙醇等。
2. 酸/碱洗脱：使用酸或碱溶液对色谱柱进行洗脱，去除残留的盐类或有机物。
常用的酸包括盐酸、硫酸等，常用的碱包括氨水、氢氧化钠等。
3. 有机溶剂洗脱：使用高极性有机溶剂如甲醇、乙腈等对色谱柱进行洗脱，去除残余的极性物质。
4. 温度洗脱：在一定温度下用溶剂对色谱柱进行洗脱，以加速残留物的洗脱。
5. 反流洗脱：将残留物反向通过色谱柱，以彻底去除残留物。
需要注意的是，活化柱的方法应根据柱材质、分析物种类和纯度来选择，以避免对色谱柱造成损害或降低柱寿命。
反相高效液相色谱柱的清洗与再生Ronald E. Mayors, Agilent Technologies, Wilmington DelaWare, USA.本月的”Column Watch”介绍一些实用的使被污染的色谱柱性能恢复或接近恢复至初始水平的方法。
Ron Majors也会讨论一些键合硅胶和其他类型的反相色谱柱的清洗方法。
迄今为止，反相色谱是高效液相色谱中使用最广泛的技术，它能普及的原因是其能适用于绝大多数非极性化合物，很多可解离和离子化合物的分析。
反相色谱中使用的固定相大多是天然存在的疏水化合物，因此，被分析物因它们与固定相之间相互作用的不同而被分离开来，同时，极性表中疏水性接近的化合物也表现出相似的色谱行为。
表1列出了与硅胶键合的最常用的固定相，固定相的亚种，比如混合固定相（如苯基-已基混合），终端封尾以及其变种和极性包合固定相也被统计在了这些硅胶键合相之中，多种其他包合材料也被用在了反相色谱中，包括高分子聚合物，聚合物包裹硅胶，氧化铝，无机-有机混合物和石墨化碳。
第一种固定相都有它的优势和不足。
反相色谱柱被用于多种使用各种流动相和添加物的应用中，有一些应用中使用的添加物会改变填料的表面性质，有时这些添加物本身硅胶会污染填充物表面或键合相。
由于疏水键合相的存在，键合硅胶颗粒的表面会有一些特性。
残留的硅醇会存在于所有键合硅胶颗粒的表面。
图1显示了硅醇可能存在的多种形式。
在弱酸性环境中，这些硅醇能和特定的化合物和基质成分特别是碱性化合物发生相互作用。
因为硅醇的PKa大约为4.5，在中等PH条件下会发生解离，因此有可能与阳离子组分发生静电相互作用。
传统的A型硅胶的金属离子含量会很高（有时高达100ppm甚至更高），这些金属离子会将酸性更强的物质引入到硅胶表面中，也会与金属螯合物或清洁剂发生相互作用。
残留硅胶对非终端封尾和像C2或C4这样的短链键合相的影响会更大。
用户必须清楚他们所使用的固定相的表面性质以及被分析物与固定相表面的相互作用，这样在他们开发和使用反相方法时，就可以把这些因素考虑进去，例如，像玉米油，高级芳香化合物和蜡这样的样品基质会粘附在反相填料表面并改变其性质，含有蛋白质成分的生物样品也会吸附在填料颗粒表面，即使分析师采用最好的方法来避免外来物质的污染以保护色谱柱，最终待分析物-基质仍然会影响固定相。
色谱柱在被污染后，它的色谱表现会不同于未被污染的色谱柱。
本期的”Column Watch”会介绍一些使色谱柱恢复或接近恢复其初始状态的实用方法。
由于硅胶键合色谱柱使用最广泛，我会特别重点介绍这一方面，在本文结束的时候，我也会讨论其他类型的反相色谱柱的清洗规程。
反相色谱柱是如何被污染的？通常，样品基质中会含有一些与目标分析物无关的物质。
在使用过程中，盐，酯类，脂肪化合物，有机酸，疏水蛋白和其他生物组分是一部分可能与色谱柱发生相互作用的物质。
与目标分析物相比，这些物质的保留能力可能更强，保留能力较弱的化合物，如盐，通常在死体积内被冲出色谱柱，这些预料之外的干扰可被检测器检测到，表现为色谱峰分叉，基线波动甚至是负峰。
如果样品基质成分在色谱柱上的保留能力很强，而流动相的洗脱能力从来都没有强到足以将这些化合物冲出来，那么在多次进样后，这些吸附在色谱柱上的基质组分就会聚集，当足够多时，它们就会像新的固定相一样表现出性质，被分析物与这些污染物的相互作用会影响分离机制，可能导致保留时间波动和峰拖尾。
如果污染物更多，则柱压可能升至很高的水平，甚至超过柱压上限，也可能造成色谱柱坍塌并形成死体积，这取决于堵塞形成的位置。
冲洗硅胶键合色谱柱复原一根被污染的色谱柱的关键是知晓污染物的性质并找到能够将其清除的适当的溶剂。
当污染来自于重复生进样后强保留物质的积累时，一些简单的能将这些物质清除的处理方法通常能恢复色谱柱的性能。
有时用相同的操作，即用20个柱体积的90%~100%B相（双通道色谱中洗脱能力更强的溶剂）冲洗色谱柱。
表2列出了多种规格的色谱柱柱体积，这样读者在用非水溶剂如甲醇，乙腈或四氢呋喃冲洗色谱柱时就能很容易确定适当的冲洗体积。
如果你的流动相为缓冲盐溶液，不要直接过渡到强溶剂，直接过渡到高浓度的有机溶剂会使缓冲盐在HPLC流路系统中析出结晶。
这会导致更严重的后果，比如筛板堵塞，接头连接处堵塞，柱塞杆初始化失败，柱塞杆磨损或进样阀转动失败。
相反，用5~10个柱体积的不含缓冲盐的流动相（即用水来替代缓冲盐）冲洗色谱柱后就可以用洗脱能力更强的溶剂来冲洗色谱柱了。
很多时候，流动相中洗脱能力更强的溶剂仍不足以清除色谱柱上的污染物，这时为了清除色谱柱上的污染物就需要使用一种或多种洗脱能力更强的溶剂了。
如果这些污染物是非生物性的，那么使用者可以用一种或多种有机溶剂来冲洗色谱柱以清除掉这些污染物。
可以使用的溶剂或混合溶剂有很多种，可访问一家或数家色谱柱生产厂商的网站以获取各种关于溶剂系统的建议和提醒。
总体而言，所有的清洗过程都遵循相似的原则，即所使用的溶剂的洗脱能力越来越强，常常以一种极性非常低的溶剂（比如乙酸乙酯甚至是碳氢化合物）结束，这种溶剂对清除像蜡类，油酯这样的非极性化合物很有帮助。
确保冲洗过程中任何相邻的两种溶剂的混溶性是非常重要的。
在冲洗完后，应当用适当的溶剂过渡后再使用初始流动相来冲洗色谱柱。
举个例子，异丙醇就是一种优良的过渡溶剂，因为它既可以与像正已烷或二氯乙烷这样的有机物混溶，也可以与水溶性试剂相混溶。
由于异丙醇的粘度很大，注意控制其流速以免系统压力超过压力上限。
同时，如果使用了紫外检测器，则应避免使用在紫外区有吸收的溶剂，否则就需要用大量的溶剂来清除掉这些溶剂以得到稳定的基线。
对于普通的硅胶键合色谱柱并且使用的流动相中不含盐时，可用下面的程序进行清洗：·100%甲醇·100%乙腈·75%：25%乙腈甲醇混合液·100%异丙醇·100%二氯甲醇和·100%正已烷如果使用二氯甲烷或正已烷冲洗了色谱柱，由于溶剂的不相溶性，在恢复至水溶性流动相之前，必须用异丙醇过渡。
每一种用来清洗色谱柱的溶剂至少需要10个柱体积，对于规格为250mm×4.6mm的分析柱来说，分析员可以用典型的1~2ml/min的流速来进行冲洗。
为了恢复至最初使用的流动相，分析员没有必要将清洗时的整个程序反着来一遍，建议使用异丙醇过渡，然后用不含缓冲盐的溶液，最后使用最开始的流动相来冲洗色谱柱。
四氢呋喃也是一种常用于清洗污染色谱柱的溶剂，如果用户怀疑存在严重污染，也可以用二甲亚砜（DMSO）或二甲基甲酰胺与水以50：50比例混合，然后以小于0.5ml/min的流速冲洗色谱柱，成功的反相色谱柱再生是一个特别耗时的过程，可以在夜间来运行这种梯度冲洗程序。
有一个值得考虑的问题是在冲洗过程中能否反冲色谱柱。
由于绝大多数保留能力强的组分通常保留在色谱柱柱头，因此，反冲色谱柱可以大大缩短污染物离开色谱柱所需经过的距离。
这时就需要考虑填充柱柱床的稳定性了，大多数现代的色谱柱是在比日常使用压力更高的条件下充填的，因此，它们的柱床通常不会被反冲的溶剂所影响。
然而，如果前端筛板的孔径比后端大，这种反冲显然是不恰当的，举个例子，如果后端筛板的孔径为2μm，就足以拦截住平均粒径为5μm（粒径差异在±2μm）的柱填料颗粒，但有些厂商为了防止样品或流动相中的微粒堵塞前端筛板，就使用了更大孔径的前端筛板，如果这种孔径比粒径分布曲线上最小的填料颗粒大，那么显而易见，在反冲时有一些填料会穿过前端筛板离开色谱柱，以至形成死体积。
如果色谱柱上有一个箭头来指示流动相方向，那么在反冲这根色谱柱之前，我会查看手册，技术指南，官网或咨询技术支持团队以确定能否反冲这根色谱柱。
无论你是否反冲色谱柱，为了避免色谱柱上的污染物或颗粒进入流通池从而污染检测器，请断开色谱柱与检测器之间的连接。
对反相柱进行柱清洗的频率取决于强保留性物质进入到色谱柱的多少。
由于反相柱在表现出分离度下降或释放异常物质之前能够耐受住较大量的污染，因此，用户趋向于等观察到异常后才会注意。
然而，更多污染物的聚集会使清洗工作变得更为困难。
基于这个原因，如果你知道有的脏样品进入色谱柱中，我建议你对色谱柱进行定期清洗，你清洗的频率越高，你所需的清洗程序就会越简单。
冲洗反相键合硅胶柱的残留蛋白质如果生物杂质比如血浆或血清在反相色谱柱上聚集，为了清除这些物质，色谱工作者必须使用不同的冲洗程序。
在大多数情况下，像乙腈或甲醇这样的纯有机溶剂难以溶解多肽和蛋白质，因此，对冲洗反相柱是无效的。
然而，有机溶剂与缓冲盐、酸，有时也可以是离子对试剂形成的混合溶剂是有效的。
开始的时候，应该试图使用更高比例的流动相中洗脱能力更强的溶剂（溶剂B）来冲洗色谱柱。
Freiser和合作者发现反复使用不同比例的三氟乙酸水溶液与三氟乙酸-异两醇溶液来冲洗色谱柱也可以再生色谱柱。
Bhadwaj和Day发现对于规格为250mm×4.6mm的色谱柱，进100μL的三氟乙醇也会有作用。
如果这些努力都失败了，那么为了清除蛋白质，可以使用Cunico和同事建议的洗脱能力更强的溶剂和增溶剂（见表3）。
然而，在用这些试剂冲洗色谱柱之前，请参考色谱柱说明书或向厂商咨询以确认色谱柱能够耐受这些试剂。
通常以硅胶为基质的色谱柱是能够耐受的，但是以高分子聚合物为基质的色谱柱在与某些溶剂接触后，这些聚合物可能会发生溶解或膨胀，继而使色谱柱性能受到影响。
在使用上述溶剂冲洗色谱柱时，请确保相邻的两种溶剂是混溶的，丙醇是一种优良的过渡溶剂。
每一种用来冲洗色谱柱的溶液至少使用20个柱体积。
有一些溶剂的粘度很高，需要适当调整系统流速以免压力超过上限。
在使用含胍或尿素的试剂冲洗色谱柱后，应该再用至少40~50个柱体积的色谱级纯化水来冲洗色谱柱。
对于反相色谱柱，不建议使用诸如十二烷基磺酸钠（SDS）和聚乙二醇烃醚之类的清洁剂。
因为这些物质本身会牢牢地吸附在键合硅胶填料上以致很难被清除掉，清洁剂会改变填料的表面性质。
然而，Separations Group的研究表明，被合成多肽的保护基团和降解产物污染的色谱柱可以通过在流速为1ml/min的条件下进100μL的1%SDS的方式进行清洁，如果随后使用含有0.1%三氟乙酸（v/v）的乙腈以5%-95%的梯度冲洗色谱柱并在最后用初始流动相对色谱柱进行平衡，那么色谱柱对多肽的分离能力就可以恢复。
一些特殊的用来清洗反相键合硅胶柱的方法有时用有机溶剂无法清除掉色谱柱上的污染物，当硅胶或键合相上有金属离子吸附时尤为如此。
这时，可以使用金属螯合剂比如0.05M乙二胺四乙酸（EDTA）来冲洗色谱柱。
EDTA 可以与很多金属离子结合并清除它们，在用EDTA处理后，分析员就可以直接用水来冲洗色谱柱了。
