高效液相色谱柱基础知识
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高效液相色谱(HPLC)基础知识我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表:方法项目数量1985年版1990年版1995年版2000年版HPLC法鉴别9 34 150 检查12 40 160 含量测定7 60 117 387鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多,因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。
I.概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是:溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时,由于与固定相(stationary phase)发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同,在固定相中滞留时间不同,从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特(Tswett)在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的,色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相,称为经典液相色谱法,此方法柱效低、时间长(常有几个小时)。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography,HPLC)是在经典液相色谱法的基础上,于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力,需用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography,HPLC)。
又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography,HSLP)。
也称现代液相色谱。
二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点:高压——压力可达150~300 Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速——流速为0.1~10.0 ml/min。
一、基本原理高效液相色谱(HPLC)法是以高压下的液体为流动相,并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。
高效液相色谱对样品的适用性广,不受分析对象挥发性和热稳定性的限制,因而弥补了气相色谱法的不足。
在目前已知的有机化合物中,可用气相色谱分析的约占20%,而80%则需用高效液相色谱来分析。
高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同,它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。
二、高效液相色谱分析原理(1)、高效液相色谱分析的流程:由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统,然后输出,经流量与压力测量之后,导入进样器。
被测物由进样器注入,并随流动相通过色谱柱,在柱上进行分离后进入检测器,检测信号由数据处理设备采集与处理,并记录色谱图。
废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。
这和气相色谱的程序升温类似,不同的是气相色谱改变温度,而HPLC改变的是流动相极性,使样品各组分在最佳条件下得以分离。
(2)、高效液相色谱的分离过程:同其他色谱过程一样,HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
开始样品加在柱头上,假设样品中含有3个组分,A、B和C,随流动相一起进入色谱柱,开始在固定相和流动相之间进行分配。
分配系数小的组分A不易被固定相阻留,较早地流出色谱柱。
分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长,较晚流出色谱柱。
组分B的分配系数介于A,C之间,第二个流出色谱柱。
若一个含有多个组分的混合物进入系统,则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱,达到分离之目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况,首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异,这是热力学平衡问题,也是分离的首要条件。
其次,当不同组分在色谱柱中运动时,谱带随柱长展宽,分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。
高效液相色谱柱高效液相色谱柱是一种在分析化学领域中广泛使用的技术。
它的原理是通过溶液在色谱柱中的流动过程中,对溶质进行分离和纯化。
高效液相色谱柱的优点是分析速度快、分离效果好、操作简便等。
本文将介绍高效液相色谱柱的原理、种类、应用以及未来的发展趋势等内容。
高效液相色谱柱的原理主要包括固定相和移动相两个基本要素。
固定相负责分离溶质,常用的固定相有疏水相、离子相、亲合相等。
移动相则是将溶质带动在柱子中流动的溶剂,通常是有机溶剂和水的混合物。
这样,在溶液在色谱柱中流动过程中,不同溶质会在固定相的作用下发生分离,从而实现对混合物的分析和纯化。
高效液相色谱柱根据固定相的不同可以分为几种不同的类型。
例如,疏水相色谱柱广泛应用于有机物的分离和分析,它的固定相表面通常具有疏水性,可以对有机物进行选择性的吸附和分离。
离子相色谱柱则适用于进行离子化合物的分离和分析,例如酸和碱等。
亲合相色谱柱主要是基于生物大分子与其他化合物之间的生物亲和性进行分析。
高效液相色谱柱在实际应用中有着广泛的用途。
在生命科学研究领域,高效液相色谱柱可以用于对蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在药物分析领域,高效液相色谱柱经常被用于药物的纯化和质量控制。
在环境监测方面,高效液相色谱柱可以用于对环境污染物的检测和分析。
此外,高效液相色谱柱还被广泛应用于食品安全、农药残留检测、天然产物分析等领域。
随着科学技术的不断进步,高效液相色谱柱也在不断发展和完善。
目前,研究人员正在努力提高高效液相色谱柱的分离效率和分离速度,使其更加适用于复杂物质的分离和分析。
同时,也在研发新的固定相和移动相,以满足不同类型化合物的分析需求。
此外,一些新的检测技术和装置也被引入到高效液相色谱柱中,提高对溶质的灵敏度和准确性。
总之,高效液相色谱柱是一种重要的分析技术,具有广泛的应用前景和发展空间。
它在生命科学、药物分析、环境监测等领域都有着重要的作用。
随着科学技术的不断进步,相信高效液相色谱柱在未来会发展出更多的新技术和新应用,为我们的科研和生产提供更多的支持和帮助。
1 液相色谱基础知识1.1 液相色谱名词术语Mobile phase:流动相,在色谱柱中存在着相对运动的两相,一相为固定相,一相为流动相。
流动相是指在色谱过程中载带样品(组分)向前移动的那一相。
Stationary phase:固定相,柱色谱或平板色谱中既起分离作用又不移动的那一相。
Gradient elution: 梯度洗脱,一个分析周期中,按一定程序不断改变流动相的浓度配比, 使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。
Detection wavelength:检测波长,retention time:保留时间,被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间Peak:峰Peak Base:峰基线,经流动相冲洗,柱与流动相达到平衡后,检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴Peak Height:峰高,色谱峰顶点至峰底的距离。
Peak Width:峰宽,色谱峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点间的距离Peak Width at Half Height:半峰高宽Peak Area:峰面积Tailing Peak: 后沿较前沿平缓的不对称峰Leading Peak:前沿较后沿平缓的不对称峰Ghost Peak: 假峰,并非由试样所产生的峰Baseline Drift:基线漂移Baseline Noise:基线噪音Band Broadening:组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象. 1.2 流动相1.2.1 流动相类型正相液相色谱流动相:一般正相色谱固定相极性大于流动相极性,采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相);流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷),常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等),极性小的组分先出柱。
反相液相色谱流动相:一般用非极性固定相(如C18、C8);流动相为水或缓冲液,常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
此帖与GC版的对应,是为了让大家更好的学习和了解LC主要内容包括:1.高效液相色谱法(HPLC)的概述2. 高效液相色谱基础知识介绍(1——13楼)3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类4. 液相色谱的适用性5.应用高效液相色谱法(HPLC)的概述以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法(HPLC)。
其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱,经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器,由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。
由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用X围广(样品不需气化,只需制成溶液即可)、色谱柱可反复使用的特点,在《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用该法,已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法;按色谱原理不同可分为分配色谱法(液-液色谱)和吸附色谱法(液-固色谱)等。
目前,化学键合相色谱应用最为广泛,它是在液-液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上,形成的固定相称为化学键合相,不易流失是其特点,一般认为有分配与吸附两种功能,常以分配作用为主。
C18(ODS)为最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同,液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法,当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法,主要用于极性物质的分离分析;当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法,主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
在中药制剂分析中,大多采用反相键合相色谱法。
系统组成:(一)高压输液系统由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。
1.贮液罐由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。
贮液罐的放置位置要高于泵体,以保持输液静压差,使用过程应密闭,以防止因蒸发引起流动相组成改变,还可防止气体进入。