拟除虫菊酯类农药降解酯酶EstA融合蛋白表达质粒的构建和诱导条件优化

收稿日期：２０１３－０８－１２基金项目：国家８６３计划项目（２０１１ＡＡ１０Ａ２０５）作者简介：刘　娜（１９８７－），女，四川成都人，在读硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕｎａ＿５１８＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ＊通讯作者：许　雷（１９６４－），男，江苏常州人，研究员，博士，主要从事农药生物降解研究。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｕｌｅｉ＠ｍａｉｌ．ｃａａｓ．ｎｅｔ．ｃｎ拟除虫菊酯类农药降解酯酶ＥｓｔＡ融合蛋白表达质粒的构建和诱导条件优化刘　娜１，２，徐汉卿２，崔　健１，茆灿泉１，许　雷２＊（１．西南交通大学生命科学与工程学院，四川成都６１００３１；２．中国农业科学院研究生院，北京１０００８１）摘要：以前期克隆得到的拟除虫菊酯类农药降解基因ｅｓｔＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＱ９０６１４３）为出发基因，构建表达系统，获得可溶性融合蛋白，并通过优化诱导表达条件，获得具有实际应用价值的相关应用参数。

结果表明，成功构建了重组表达载体ｐＭａｌ－ｃ２Ｘ－ｅｓｔＡ并转化至宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３），获得酯酶ｅｓｔＡ基因诱导表达系统；通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳、以α－乙酸萘酯为底物的酶活性检测及Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ方法，确认外源蛋白ＥｓｔＡ在大肠杆菌宿主菌中成功表达并具有酯酶活性。

重组基因工程菌可溶性原核表达诱导条件的优化试验表明，其最佳诱导表达条件是：Ｃａ２＋浓度１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、诱导初始ＯＤ６００值０．７、诱导剂ＩＰＴＧ浓度０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、诱导初始ｐＨ值７、诱导温度２６℃、诱导时间１７．５ｈ，优化后的酯酶活性（９２．０３Ｕ／ｍｇ）较优化前（４４．６４Ｕ／ｍｇ）提高了１倍多。

关键词：拟除虫菊酯类农药；生物降解；酯酶；ｅｓｔＡ基因；可溶性蛋白；原核表达条件优化中图分类号：Ｓ４８２．３＋５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００４－３２６８（２０１４）０２－００７２－０８Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｕｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｏｆ　Ｐｙｒｅｔｈｒｏｉｄ　Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　Ｅｓｔｅｒａｓｅ　ＥｓｔＡ　ａｎｄＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓＬＩＵ　Ｎａ１，２，ＸＵ　Ｈａｎ－ｑｉｎｇ２，ＣＵＩ　Ｊｉａｎ１，ＭＡＯ　Ｃａｎ－ｑｕａｎ１，ＸＵ　Ｌｅｉ　２＊（１．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００３１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｇｒａｄｕａｔｅ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００８１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ａｉｍ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｗａｓ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ａｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｂｙ　ｌｉｇａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｓｔｅｒａｓｅｇｅｎｅ　ｅｓｔＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＱ９０６１４３）ｃｌｏｎｅｄ　ｂｅｆｏｒｅ，ｗｈｉｃｈ　ｃｏｕｌｄ　ｄｅｇｒａｄｅ　ｐｙｒｅｔｈｒｏｉｄ　ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ，ｉｎｔｏｔｈｅ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＭａｌ－ｃ２Ｘｔｏ　ａｔｔａｉｎ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｏｐｔｉ－ｍｉｚｅｄ　ｔｏ　ａｃｈｉｅｖｅ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，ｗｈｉｃｈ　ｈａｄ　ｇｒｅａｔ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｉｎ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＭａｌ－ｃ２Ｘ－ｅｓｔＡ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｈｏｓｔ　ｓｔｒａｉｎ　ＢＬ２１（ＤＥ３），ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ｅｓｔＡｇｅｎｅｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｓｓａｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅα－ｎａｐｈｔｈｙｌａｃｅｔａｔｅ　ａｓ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ，ｉｔ　ｗａｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｔａｒｇｅｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＥｓｔＡ　ｗａｓ　ｅｘ－ｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ａｎｄ　ｈａｄ　ｅｓｔｅｒａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓ－ｓｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａ２＋ｗａｓ　１．０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｔｈｅ　ｉｎｉｔｉａｌ　ＯＤ６００ｖａｌｕｅ　ｗａｓ　０．７，ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＰＴＧ　ｗａｓ　０．１ｍｍｏｌ／Ｌ，ｔｈｅ　ｉｎｉｔｉａｌ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ｗａｓ　７，ｔｈｅ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｗａｓ２６℃，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｗａｓ　１７．５ｈ．Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ　ｄｏｕｂｌｅ　ｅｘ－ｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｂｅｆｏｒｅ（ｔｈｅ　ｅｓｔｅｒａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗａｓ４４．６４Ｕ／ｍｇ　ｂｅｆｏｒｅ　ａｎｄ　９２．０３Ｕ／ｍｇ　ａｆｔｅｒ）．　河南农业科学，２０１４，４３（２）：７２－７９　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｎａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ＳｃｉｅｎｃｅｓＫｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｙｒｅｔｈｒｏｉｄ　ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ；ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ；ｅｓｔｅｒａｓｅ；ｅｓｔＡｇｅｎｅ；ｓｏｌｕｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ｏｐｔｉｍｉｚａ－ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ 拟除虫菊酯类农药是目前生产中广泛使用的有机农药之一。

由于其具有高效、低残留和中等毒性的优势，取代了有机氯、有机磷和氨基甲酸酯类农药，于２０世纪７０－８０年代迅速崛起［１］。

我国农业生产对拟除虫菊酯类农药的依赖程度与日俱增，其直接结果是导致由该农药残留所引起的环境问题日益严重，因此，拟除虫菊酯类农药的生物降解已成为环境生物技术领域的研究热点。

目前，国内外已报道的研究多集中于农药降解微生物的筛选和工程菌株的构建，而关于降解酶方面的研究较少。

本实验室（中国农业科学院研究生院生物化学实验室）前期克隆了可降解拟除虫菊酯类农药的酯酶基因ｅｓｔＡ，本研究拟通过构建其可溶性表达系统，直接获取可溶性目的蛋白，并摸索出其最佳诱导表达条件，对后期获得具有实际应用价值的基因工程酶产品和相关生产应用参数具有重要意义和价值。

１　材料和方法１．１　主要材料与试剂１．１．１　菌株和质粒　大肠杆菌ＪＭ１１０、ＢＬ２１（ＤＥ３）和质粒载体ｐＥＴ－ｅｓｔＡ为本实验室保存；克隆载体ｐＧＥＭ－Ｔ购自天根公司；表达载体ｐＭａｌ－ｃ２Ｘ由华大基因公司刘国正教授馈赠。

１．１．２　主要试剂　质粒提取试剂盒购自ＯＭＥＧＡ公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自博迈德生物公司；限制性内切酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶购自ＴａＫａＲａ公司；Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自天根公司；抗ＥｓｔＡ多克隆抗血清由北京华大蛋白质研发中心有限公司合成；辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记山羊抗兔ＩｇＧ购自北京文成变异化学研究室；ＩＰＴＧ、辣根显色剂（ＤＡＢ）购自Ｓｉｇｍａ公司；α－萘酚、α－乙酸萘酯、固兰Ｂ盐购自中国医药集团上海化学试剂有限公司；牛血清白蛋白（ＢＳＡ）购自Ａｍｒｅｓｃｏ公司。

１．２　试验方法１．２．１　ｅｓｔＡ基因的ＰＣＲ扩增　在ＧｅｎＢａｎｋ中获得ｅｓｔＡ基因的全长序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＤＱ９０６１４３），设计ＰＣＲ引物时，在引物５′端引入ＸｂａⅠ酶切位点，３′端引入ＨｉｎｄⅢ酶切位点。

ｅｓｔＡ－Ｆ：ＴＣＴＡＧＡＡＴ－ＧＧＧＴＧＴＧＴＡＴＧＡＣＴＡＣＡＡＧＡＡＣＴＴＣＧ；ｅｓｔＡ－Ｒ：ＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＧＣＧＡＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＴＣＧ。

以含ｅｓｔＡ基因的ｐＥＴ－ｅｓｔＡ质粒为模板进行ＰＣＲ扩增。

ＰＣＲ扩增条件如下：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，５８℃退火４５ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，３５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。

ＰＣＲ　２０μＬ反应体系如下：灭菌二次纯水１５．４μＬ、ｐＥＴ－ｅｓｔＡ质粒１μＬ、１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（含２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ２＋）２μＬ、ｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）０．４μＬ、正向引物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）０．４μＬ、反向引物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）０．４μＬ、Ｔａｑ酶（２．５Ｕ／μＬ）０．４μＬ，阴性对照将ｐＥＴ－ｅｓｔＡ质粒替换为灭菌的二次纯水。

ＰＣＲ扩增完成后，用１％琼脂糖凝胶电泳检验。

１．２．２　ｅｓｔＡ基因的克隆及鉴定　将ｅｓｔＡ基因的ＰＣＲ产物回收纯化，与ｐＧＥＭ－Ｔ载体在４℃下连接过夜，转化至大肠杆菌ＪＭ１１０感受态细胞并进行蓝白斑筛选。

经ＰＣＲ及限制性内切酶ＸｂａⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切鉴定后，阳性克隆送公司测序。

１．２．３　表达载体的构建与鉴定　回收测序正确的克隆载体（ｐＧＥＭ－Ｔ－ｅｓｔＡ）的双酶切产物（ｅｓｔＡ基因片段），与经同样双酶切处理的ｐＭａｌ－ｃ２Ｘ载体用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），蓝白斑筛选后，经ＰＣＲ及限制性内切酶ＸｂａⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切鉴定。

１．２．４　ｅｓｔＡ基因的诱导表达　挑取鉴定正确的重组菌株（含ｐＭａｌ－ｃ２Ｘ－ｅｓｔＡ）及空载体ｐＭａｌ－ｃ２Ｘ菌株，接种于含有氨苄青霉素（Ａｍｐ，１００ｍｇ／Ｌ）的ＬＢ液体培养基中，２００ｒ／ｍｉｎ、３７℃条件下培养过夜；以１％的接种量接种于含Ａｍｐ（１００ｍｇ／Ｌ）的新鲜ＬＢ液体培养基中，２００ｒ／ｍｉｎ、３７℃条件下摇菌培养；待菌液ＯＤ６００达到０．４时，取１ｍＬ菌液于ＥＰ管中，余下菌液加入ＩＰＴＧ，使ＩＰＴＧ终浓度分别达到０．１、０．３、０．５、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ，２００ｒ／ｍｉｎ、１８℃条件下进行诱导表达；２０ｈ后，取１ｍＬ菌液于ＥＰ管中，连同诱导前样品，经处理后用于ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。