硕士学位论文第一章ＳＬＣ２６Ａ４基因的突变检测
３７。Ｃ孵育６０ｍｉｎ，８０。Ｃ１５ｍｉｎ灭活虾碱性磷酸酶和核酸外切酶，４＂Ｃ保存。１．２．５序列分析
１．２．５．１测序结果分析
测序结果用ＤＮＡＳＴＡＲ软件中的ＥｄｉｔＳｅｑ、ＳｅｑＭａｎ程序分析。
１．２．５．２剪接位点分析
利用在线剪接位点分析软件（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮ．ｈｔｍｌ）对查及的剪接位点突变或改变进行分析。
１．２．５对照组检测
取２０个不伴有ＥＶＡ之遗传性耳聋家系和１５０名健康人的基因组ＤＮＡ对经测序证实的突变位点进行对照检测。
１．２．６观察患者电子耳蜗植入术的术中和术后效果
术中所有电极均顺利插入，并经术中检测电极完好，电阻测试效果满意，在有突变３例中术中出现“镫井喷”现象，２例无突变则无此现象。将耳蜗造孔用软组织，耳脑胶封堵后停止。１月后开机均成功，重建听力。
１．３结果
１．３．１临床相关结果
双侧前庭导水管扩张、内淋巴囊扩张如图２－３。
囤１．１：影象学检查结果．ａ，颞骨水平ＣＴ：箭头示双翎前庭导水管扩张；ｂ，颞骨水平
Ｍｉｌｌ：箭头示双侧内淋巴囊扩张。
１．３．２突变检测结果
在突变检测研究中，所有患者中共发现４个不同类型的ＳＬＣ２６Ａ４基因突变，包括：ＩＶＳ７．２Ａ＞Ｇ、ＩＶＳｌ０－１２Ｔ＞Ａ、７５４Ｔ＞Ｃ、１２２９Ｃ＞Ｔ。其中在家系Ａ中发现的［ＶＳｌ０－１２Ｔ＞Ａ为新的突变类型。在有突变３例中术中出现“镫井喷”现象，２例无突变则无此现象。针对这种新突变，选择１５０个遗传无相关正常人进行相关位点的检测，均未发现相应改变。
各突变的测序图及相关分析见图１．２、１．３、１．４、ｌ一５
家系Ａ图１－２：突变７５４Ｔ＞Ｃ（Ｓ２５２Ｐ）测序图．Ⅱ，野生型；ｂ，突变杂合子．
家系Ｂ
圈１．３：突变ＩＶＳ７—２Ａ＞Ｇ测序困．ａ，野生型；ｂ，突变杂合子；ｃ，突变纯合子．
图１－４：突变１２２９Ｃ＞Ｔ（Ｔ４１０Ｍ）划序图．口。野生型；ｂ，突变杂舍子
图１－５：突变ＩＶＳｌ０—１２Ｔ＞Ａ反向测序图．口，野生型；ｂ，突变杂合子．
９
硕士学位论文第一章一个新的耳聋基因克隆的研究
的区间比较大，而且耳聋的遗传异质性很强，我们很难收集别的耳聋家系来缩小定位区域。我们通过查找ＯｎｉＧｅｎｅ、ＯｅｎｅＣａｒｄ等基因表达相关数据库，从人或老鼠的耳蜗中分离到的特异表达的基因作为耳聋的侯选基因，一共１７个基因（图２－４）。
图２－３Ｉ（ｎｏｗｇｅｎｅａｎｄＲｅｆｓｅｑ
图２－４耳聋侯选基因
续图２－４耳聋侯选基因
２．３．３ＰＣＲ扩增
２．３．３．１ＰＣＲ扩增引物
１６个基因外显子扩增引物采用加拿大生物研究所提供的ｐｒｉｍｅｒ３在线软件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ—ｇｅＩｌｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｃｇｉ／）设计。为了使ＰＣＲ扩
表２－２虾碱．巨磷酸酶和核酸外切酶处理的试剂组成
试剂（Ｒｅａｇｅｎｔｓ）
体积（Ｖｏｌｕｍｅ）
５ｘＳＡＰＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ
ＳＡＰ（１Ｕ／¨１）
ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ（１０Ｕ／ｐ１）ｄｄＨ２０
ＰＣＲ产物
０．２ｐｌ０．８ｌａｌ
０．４ｋｔｌ０．６ｕｌ８．０ｕｌ
３７＂Ｃ孵育６０ｍｉｎ，８０＂Ｃ１５ｍｉｎ灭活虾碱性磷酸酶和核酸外切酶，４＂Ｃ保存。
２．３．６序列分析２．３．６．１测序结果分析
测序结果用ＤＮＡＳＴＡＲ软件中的ＥｄｉｔＳｅｑ、ＳｅｑＭａｎ程序分析。
２．４
结果
本研究发现３个碱基改变，这些碱基改变与家系、疾病并没有实现共分离，
所以这些碱基改变是３个多态，其中ＨＳＰＡ９Ｂ基因ＩＶＳ２＋７９
８１ｄｅｌ
ｔｅｔ为新的
多态。本研究尚未找到疾病的致病基因，有待进一步扩大检测范围。多态见下图。
２．４．１
ＰＣＤＨＢ５基因
２３７５Ｔ＞Ｃ
表２－３ＰＣＤ强５基因
２３７５Ｔ＞Ｃ
Ｍ１９０９
１ｅｘｏｎ
９．Ｍ１９０９９Ｆ９Ｆ是
ＧＡＧＣＡＧＧＧＣＧＧＣＣＴ，Ｃ
２３７５１＿＞Ｃ
纯
是
患９．Ｍ１９０９９Ｒ
９ＲＣＧＧＴＣＣ面ＴＣ
合
Ｓｅｔ＞Ｐｒｏ
者Ｍ１９２２ｌｅｘｏｎ９．Ｍ１９２２９Ｆ
９Ｆ是患者Ｍ１９０９，Ｍ１９０７，１９１０，２３７５Ｔ＞Ｃ
纯
是
患９．Ｍ１９２２９Ｒ
９Ｒ
Ｍ１９３０．Ｍ１９２２均纯合Ｓｅｔ＞Ｐｒｏ
者
口
已知多态ｒｓ４００５腔ｌｒｓｌ７８４４８９３）
图２－５ＰＣＤＩ－ＩＢ５基因
２３７５Ｔ＞Ｃ
２．４．２ＴＧＦＢＩ基因ＩＶＳｌ４．７１Ａ＞Ｇ
表２叫ＴＧＦ＇ＢＩ基因ＩＶＳｌ４—７１Ａ＞Ｇ
Ｍ１９０７ｅｘｏｎｌ４１４ｆ／１４ｒ是ａｇｔａａａｃａｃｔｔｇｃｔｇａａ／ｇⅣＳ一７ｌ纯己知多态
合ｒｓｌ３１６８５０６
ｔｇａａｔａａａａｔａａ＞ｇ
Ｍ１９０９ｅｘｏＲｌ４１４ｆ／１４ｒ是ＩＶＳ－７ｌ纯已知多态
合ｒｓｌ３１６８５０６
ａ＞ｇ
Ｍ１９ＩＯｅｘｏｎｌ４１４ｆ／１４ｒ是患者Ｍ１９０７，Ｍ１９０９，ⅣＳ－７Ｉ纯己知多态
Ｍ１９１０均纯合ａ＞ｇ合ｒｓｌ３１６８５０６
Ｍ１９３０ｅｘｏｎｌ４１４仃１４ｒ否家系内正常人已知多态正常
Ｍ１９３０无突变ｒｓｌ３１６８５０６人
Ｍ１ｅｘｏｎｌ４１４ｆ／１４ｒ是家系外正常人ＭＩ杂ⅣＳ．７ｌ杂己知多态家系
台
合ｒｓｌ３１６８５０６外正
ａ＞ｇ
为已知多态常人
ｒｓｌ３１６８５０６
图２－６ＴＧＦＢＩ基因ＩＶＳｌ４－７１Ａ＞Ｇ
２．４．３ＨＳＰＡ９Ｂ基因ＩＶＳ２＋７９８１ｄｅｌｔｃｔ
表２－５ＨＳＰＡ９Ｂ基因ＩＶＳ２＋７９—８１ｄｅｌｔｃｔ
ＨＳ队９ＢＭ１９０７Ｅｘｏｎ２ｇｔｇａｔｔａｔｔｃｔｔｃｔｃｔｇｔａａｔｔａｔｔｔⅣＳ２＋７９８１杂患
ｄｅｌｔＣｔ合者１７ｅｘｏｎｓＭ１９０９患者Ｍ１９０７，Ｍ１９０９杂合，患杂患
者Ｍ１９１０纯合，家系内正合者Ｍ１９１０常人Ｍ１９３０纯合纯患
ＳＮＰｂｌａｓｔ查不到，新的多态合者Ｍ１９３０纯患
合者
９
