葡萄籽中原花青素(OPC)的提取与纯化

生研1002班 姚远 学号：2010001225

葡萄籽中原花青素(OPC)的提取与纯化

一、原花青素简介

原花青素是一种水溶性色素，可以随着细胞液的酸碱改变颜色。细胞液呈酸性则偏红，细胞液呈碱性则偏蓝。花青素(Anthocyanins)是构成花瓣和果实颜色的主要色素之一。花青素为植物二级代谢产物，在生理上扮演重要的角色。花瓣和果实的颜色可吸引动物进行授粉和种子传播。常见于花、果实的组织中及茎叶的表皮细胞与下表皮层。

花青素属于酚类化合物中的类黄酮类(Flavonoids)。基本结构包含二个苯环，并由3碳的单位连结(C6-C3-C6)。花青素经由苯基丙酸路径和类黄酮生合成途径生成，由许多酵素调控催化。以天竺葵色素(Pelargonidin)、矢车菊素(Cyanidin)、花翠素(Delphinidin)、芍药花苷配基(Peonidin)、矮牵牛苷配基 (Petunidin)及锦葵色素(Malvidin)六种非配醣体(Aglycone)为主。花青素因所带羟基数(-OH)、甲基化(Methylation)、醣基化(Glycosylation)数目、醣种类和连接位置等因素而呈现不同颜色。[9]颜色的表现因生化环境条件的改变，如受花青素浓度、共色作用、液胞中pH値的影响 (Clifford)。橙色和黄色是胡萝卜素的作用。1910年在胡萝卜中发现了β-胡萝卜素，以后共发现另外2种胡萝卜素异构体，分别是：α、β、γ三种异构体。1958年β-胡萝卜素获得专利，目前主要从海洋中提取，也可人工合成。[1]

食品中几种重要花青素的结构 自然界有超过300种不同的花青素。他们来源于不同种水果和蔬菜如紫甘薯、越橘、酸果蔓、蓝莓、葡萄、接骨木红、黑加仑、紫胡罗卜和红甘蓝、颜色从红到蓝。这些花青素主要包含飞燕草素（Delchindin）、矢车菊素（Cyanidin）、 牵牛花色素（Petunidin）、芍药花色素（Peonidin）。

花青素颜色随PH值发生变化，从当PH值为3时的覆盆子红到当PH值为5时的深蓝莓红。在大多数应用中，这些色素具有良好的光、热和PH稳定性，并且能够承受巴氏和UHT热处理。花青素广泛地应用在饮料、糖果、果冻和果酱中。紫甘薯花青素在不同PH值下的颜色变化见右下图：

花青素在不同pH下的颜色变化

OPC的制备方法主要有化学合成法、生物合成法和植物提取法。化学合成法的副产物较多，产物的异构体难以分离，产品纯度不高，影响了其在各领域的应用；生物合成法是在酸性条件及酶的催化作用下，将前体物质转化成OPC，此种反应对酶的要求条件苛刻，目前技术还不成熟：植物提取法是利用一定的手段和方法将OPC从植物中提取出来并分离纯化，得到具有一定纯度的此类物质，是主要的制备方法，其大致可分为提取和分离两步工序。

二、原花青素提取纯化具体方法

1、原花青素的提取

提取OPC的方法很多，接下来我们一一介绍。

(1)溶剂提取法[1、2]

溶剂提取法是提取葡萄籽中原花青素的最常用的方法。目前，多数研究者都是采用此方法对葡萄籽中原花青素进行粗提，得到的产品纯度在50％---70％左右，产品得率在2.2％---7.8％之间。采用石油醚脱脂的干葡萄籽为原料，以乙醇为溶剂热提取后，通过调节pH值除去杂质性蛋白，再用乙酸乙酯萃取分离粗提物，石油醚沉淀精制得原花青素产品；同时，通过对各影响因素的实验，在中心组合实验基础上，运用响应面分析法确定出提取低聚原花青素的最优工艺条件：乙醇水溶液浓度为61.4％，料液比为1:7，提取温度为48.6℃，提取时间30 min，提取3次，在此条件下提取率达95％以上。用含8％水、3％磷酸的乙酸乙酯溶液为提取剂，室温下搅拌提取lOh，所得产物颜色淡，水溶性好，聚合度值为3.8±0.2，其低聚原花青素质量分数大于70％，得率达2.2％。用常规溶剂提取青、红两种葡萄籽中的原花青素，采用搅拌方式提取的最优工艺参数为：料液比1：20，提取2 h，50℃，青葡萄籽提取剂为丙酮水溶液，浓度60---80％，产物纯度和得率达67.35％和7.86％；红葡萄籽提取剂为乙醇水溶液，浓度为80％，产物纯度和得率达55.20％和5.36％。

（2)微波法[3]

近年来，微波(Microwave)技术在人们的生产生活中应用越来越广泛。它的原理是利用磁控管所产生的每秒24.5亿次超高频率的快速震动，使植物内分子间相互碰撞、挤压，从而有利于其有效成分的浸出。以葡萄籽为原料，研究微波对葡萄籽原花青素的浸出和结构的影响。结果表明，以70％乙醇水溶液为介质，葡萄籽整粒料液比(g:mL)l:11，微波功率180 w处理10

s，然后在50℃水浴浸提30 min，原花青素浸提量为4.109 mg/g，较不用微波处理同等水浴条件浸提量增加1.715 mg/g。通过对微波联合水浴浸提和单纯水浴浸提的原花青素的紫外图谱显示，短时微波处理对原花青素的分子结构没有破坏作用。另外，微波对从葡萄籽中提取低聚原花青素的影响，实验结果为：以蒸馏水为溶剂，功率为500 w，料液比为1:9，时间为15 min，提取率达到38％，超过传统水煮法。

（3）超临界C02萃取法[4]

超临界CO2萃取技术是利用临界温度状态下，CO2能够溶解多种物质的特点；同时，超临界CO2萃取技术具有纯净、安全、保持生物活性，不易受热分解、稳定性强，色味纯正及提取率高等优点，因而成为天然产物研究与开发工业中一种具有相当发展潜力的提取分离方法。由于纯CO2本身的非极性特点，限制了CO2的应用范围，通常要加入夹带剂，以改变CO2流体的极性，从而更有效地提取那些非脂溶性的、强极性的天然产物中重要的有效成分。利用超临界CO2萃取装置对提取原花青素放大工艺实验方法的确定和使用静态夹带剂的超临界CO2萃取原花青素放大工艺研究，得出超临界CO2萃取原花青素的工艺放大条件，在35 MPa、65℃下，萃取收率能够达到8.38％，而此时用分光光度法测量产品的纯度大于95％，满足出口要求。

2、原花青素的分离纯化

(1)大孔树脂吸附法[5]

大孔吸附树脂(Macroporous absorption resin)属于功能高分子材料，是近30余年来发展起来的一类有机高聚物吸附剂。大孔树脂的表面积较大、交换速度较快、机械强度高、抗污染能力强、热稳定好，在水溶液和非水溶液中都能使用；同时它具有物理化学稳定性高、吸附选择性独特、不受无机物存在的影响、再生简便、解吸条件温和、使用周期长、宜于构成闭路循环，节省费用等诸多优点，避免了用有机溶剂分离而造成的有机溶剂回收难、损耗大、成本高、易燃易爆、对环境污染严重等缺点。

对大孔树脂对于葡萄籽原花青素的吸附洗脱性能环选实脸中，发现NKA树脂是比较好的吸附剂。樊丽华[8]在前人对葡萄籽原花青素提取方法研究的基础上，采用大孔树脂和聚酰氨柱层析的双重纯化，省去了许多复杂烦琐的工艺过程，提取出的葡萄籽中原花青素纯度可达99.37％，收率为3.82％．张峻等人以AB-8大孔吸附树脂对葡萄籽中原花青素粗提物进行了分级分离，所得乙酸乙酯洗脱产物总酚含量为9l％。经高效液相色谱检测，酚类物质中单体约占28％，低聚原花青素占64％，多聚体仅为8％。Horiishoji等人提出将含有原花青素的溶液通过聚苯乙烯吸附树脂得到低极性的溶液，继而可以快速地从富含原花青素的溶液中提取高纯度的原花青素。另外，用聚酰胺树脂分离纯化葡萄籽中原花青素粗提物后，得到2个纯度高的二聚体化合物，并经其结构表征确证。可见，用大孔树脂吸附法对葡萄籽中原花青素粗提物进行纯化和进一步分离，可以获得较好的效果。

大孔树脂吸附法实验步骤：原料---乙醇浸提---过滤---离心---回收乙醇---花青素提取液---AB-8树脂吸附---乙醇洗脱---回收乙醇---石油醚萃取---回收石油醚---干燥---称重。

(2)超过滤法[6]

超过滤技术是在近20年内发展起来的一种膜分离技术。由于食品中的各种水溶性物质非常适合采用超过滤技术进行分离和浓缩，因此超过滤技术在食品分离中得到了广泛应用。Ariga Toshiaki将原花青素含量≥100 mg/L的乙醇溶液，通过一个相对分子截面量≤5000的超滤膜或是阻盐率≤30％的反渗透膜进行过滤。使用相对分子截面量为500---5000的超滤膜可以得到高纯度的原花青素，所得产品可以用作食品和化妆品等的抗氧化剂，或是作为广泛领域的配药的原料。目前超过滤技术在葡萄籽中原花青素分离上的应用研究虽不多，但其优越性充分表明了该技术的可行性，所以在葡萄籽中原花青素的分离工艺上具有很大的应用价值。

三、总结[7]

目前提取葡萄籽中原花青素采用的工艺主要是传统的溶剂提取法，这是由于溶剂提取法操作简单、所用溶剂毒性小、副作用小、提取率较高。但是该方法得到的产品纯度较低；采用微波技术，则可进一步提高提取率；采用超临界C02萃取技术，不仅能提高原花青素的收率，还可以提高产品的纯度。因此，后两种方法将是今后葡萄籽中原花青素提取研究的主要方向。大孔树脂吸附法由于其分离速度快、效果好、所得产品纯度高等优点已广泛用于天然产物的纯化方面，将葡萄籽中原花青素粗提物经大孔树脂分离纯化，将是获得高纯度的天然葡萄籽原花青素的十分有效的方法之一。此外，用超过滤法处理原花青素的粗提物，不急可以得到高纯度的产品，而且可以将产品按分子量分级，所以该方法是精制、纯化葡萄籽中原花青素产品，并进行进一步分离单位的有效的前期处理方法。近年来随着研究方法和分离技术的发展，人们对原花青素的药理作用越来越清楚，对原花青素的纯度和单体的分离要求也越来越高。因此采用溶剂提取法和大孔树脂吸附法相结合、或溶剂提取法和超过率法相结合，尽早得到花青素的最优的提取、分离纯化方法与工艺，将有着十分重要的理论和现实意义。可以预见，通过这些方法提取、分离纯化得到的原花青素将能更好的应用到医药、化妆品及食品等各相关领域中去。

四、参考文献

[1] 王辉宪，姜晖霞，王仁才，等.葡萄籽油及原花青素研究与开发利用[J].果树学报，2005，22(5):652-547.

[2] 魏福祥，韩菊，于宝莉.葡萄籽中活性成分提取工艺的研究[J].精细化工，2001，18(7):394-395,400. [3] 吕丽爽，曹栋.脱脂葡萄籽中低聚原花青素的提取[J].无锡轻工大学学报，2001，20(2):208-210.

[4] 欧阳建文.超临界CO2萃取技术提取刺葡萄籽油的研究[D].长沙:湖南农业大学，2006.

[5] 李润丰，吕晓玲，王青华，等.葡萄籽中原花青素提取和分离的初步研究[J].粮油加工与机械，2003(6):67-70.

[6] 陈磊，王军.山葡萄籽中原花青素的提取[J].中国野生植物资源，2008(2):58-60.

[7] 孙健霞，张燕，胡小松，吴继红，廖小军.花青素的提取、分离以及纯化方法研究进展[J].中国农业大学学报，2008(8):111-117.

[8] 李莹.采用大孔吸附树脂纯化马尾松树皮原花青素及其抗氧化性研究[J].食品与发酵工业.2006,32(12):145-149.

[9] 孙芸，徐宝才，谷文英等.原花青素的聚合度与抗氧化活性关系[J].食品与发酵工业，2006，32(10):41-46.