HE染色操作流程

he染色法步骤
HE 染色法呀，那可是病理实验中的大明星呢！咱就来好好唠唠这
个神奇的 HE 染色法步骤。

首先呢，得准备好切片，这就好比要给一个小宝贝打扮，得先把它
摆好位置不是。

切片要切得薄厚均匀，就像切面条一样，不能有的粗
有的细。

然后就是脱蜡啦，这就好像给小宝贝洗个澡，把身上那些脏脏的蜡
质都洗掉，让它干干净净的。

接下来就是水化，让切片充分吸收水分，变得润润的，就像我们人
要多喝水一样，这样才能保持活力呀。

再之后就是染色啦，苏木精就登场咯！它就像个魔法师，能把细胞
核染得蓝蓝的，可神奇啦！你想想，细胞核就像是小宝贝的眼睛，得
炯炯有神才行呢。

染完细胞核，该染细胞质啦，伊红来啦！它能让细胞质变得红红的，这下可好啦，细胞核和细胞质就分得清清楚楚啦，就像白天和黑夜一
样分明。

染完色可还没完事儿呢，还得脱水呀，把多余的水分去掉，不然可
就湿漉漉的不好看啦。

然后是透明，让切片变得亮晶晶的，就像给小宝贝穿上了一件漂亮
的水晶衣服。

最后就是封片啦，把切片保护起来，让它能一直美美的。

你说这 HE 染色法是不是很有意思呀？就像给切片化了个妆，让我
们能更清楚地看到细胞的结构和形态。

这可是病理诊断的重要手段呢！如果没有它，我们怎么能知道细胞有没有生病呀？是不是很重要呢？
所以呀，一定要好好掌握这个 HE 染色法的步骤，这样才能让我们更好地了解病理世界呀！。

he染色流程(一)he染色简介•什么是he染色?•为什么需要he染色?流程1. 样本制备•获取组织样本(如组织切片)•将样本固定在载玻片上•进行脱水和透明化处理2. 血液片制备•获取新鲜血液样本•密度离心分离白细胞•将细胞悬液涂布在载玻片上•进行干燥和固定处理3. 染色液制备•准备hematoxylin溶液和eosin溶液•根据需要进行稀释4. he染色•将载玻片浸入hematoxylin溶液中，染色一段固定时间•洗去多余溶液•将载玻片浸入eosin溶液中，染色一段固定时间•再次洗去多余溶液•干燥载玻片5. 倒置显微镜观察•将he染色载玻片放置在倒置显微镜上•调整镜头和光照条件以观察染色效果•进行细胞组织结构的分析和判定结论•he染色是一种常用的细胞和组织染色方法•它可以用于观察细胞和组织的形态结构•he染色广泛应用于病理学和组织学领域，有助于疾病的诊断和治疗参考文献•[论文/reference]•[书籍/reference]注意：此处所提供的流程仅为示例，实际操作中可能存在差异。

请严格按照实验室标准操作，并遵循相关实验室安全规定。

he染色简介•什么是he染色?–he染色是一种常用的细胞和组织染色方法，用于观察细胞和组织的形态结构。

•为什么需要he染色?–he染色可以帮助病理学家和研究人员观察细胞和组织的结构，对疾病的诊断和治疗起到重要的作用。

流程1. 样本制备•获取组织样本(如组织切片)。

•将样本固定在载玻片上，保持其原始形态。

•进行脱水和透明化处理，以去除组织中的水分，便于染色。

2. 血液片制备•获取新鲜血液样本。

•密度离心分离白细胞，得到富含白细胞的细胞悬液。

•将细胞悬液涂布在载玻片上，形成血液片。

•进行干燥和固定处理，以保持细胞形态。

3. 染色液制备•准备hematoxylin溶液和eosin溶液，用于染色。

•根据需要进行稀释，以调整染色液的浓度。

4. he染色•将载玻片浸入hematoxylin溶液中，染色一段固定时间。

HE染色试剂配置A：~1%的伊红酒精溶液：称取伊红~1g,加少量蒸馏水溶解后,再滴加冰醋酸直至浆糊状;以滤纸过滤,将滤渣在烘箱中烤干后,以95%酒精即工业酒精,如果不怕浪费,用无水乙醇配制也可100毫升溶解;B：苏木素染液配方：配制3000ml,可按比列减少苏木精6g无水乙醇100ml硫酸铝钾150g蒸馏水2000ml碘酸钠冰醋酸120ml甘油900ml配制方法：将苏木素溶于无水乙醇,再将硫酸铝钾溶于蒸馏水,溶解后将甘油倾入一起混合,最后加入冰醋酸和碘酸钠;C：1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可;染色流程1二甲苯Ⅰ15min2二甲苯Ⅱ15min3二甲苯：无水乙醇=1:12min4100%乙醇Ⅰ5min5100%乙醇Ⅱ5min680%乙醇5min7蒸馏水5min8苏木精液染色5min9流水稍洗去苏木精液1-3s101%盐酸乙醇1-3s11稍水洗10-30s12蒸馏水过洗1-2s13%伊红液染色1-3min14蒸馏水稍洗1-2s1580%乙醇稍洗1-2s1695%乙醇Ⅰ2-3s1795%乙醇Ⅱ3-5s18无水乙醇5-10min19石炭酸二甲苯5-10min20二甲苯Ⅰ2min21二甲苯Ⅱ2min22二甲苯Ⅲ2min23中性树胶封固注：①第11、12步可省去,13步冲水时间需延长至20-30min;②第21步如果不用石炭酸二甲苯,可改用无水乙醇;冷冻切片HE染色步骤：1冰冻切片固定10～30s2稍水洗1～2s3苏木精液染色60℃30～60s4流水洗去苏木精液5～10s51%盐酸乙醇1～3s6稍水洗1～2s7促蓝液返蓝5～10s8流水冲洗15～30s9%曙红液染色30～60s10蒸馏水稍洗1～2s1180%乙醇1～2s1295%乙醇1～2s13无水乙醇1～2s14石炭酸二甲苯2～3s15二甲苯Ⅰ2～3s16二甲苯Ⅱ2～3s17中性树胶封固;注：第14步如果不用石炭酸二甲苯,可改用无水乙醇;染色结果：细胞核蓝色,胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色;4．12切片脱水透明切片经HE染色后,要彻底脱水透明,才能用中性树胶封盖;如果脱水不彻底,封片后呈白色雾状,镜下观察模糊不清,且容易褪色;切片1-2级无水乙醇脱水,也可使用石碳酸二甲苯进行脱水;石碳酸有较强脱水能力,但长时间可使切片脱色,因此要经过多次二甲苯以使石碳酸完全除去;染色评定标准：1切片完整,厚度4-6微米,厚薄均匀,无皱褶无刀痕；2染色核浆分明,红蓝适度,透明洁净,封裱美观;4 染色结果编辑细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色,软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色,粘液呈灰蓝色;细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色,胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色;胶原纤维呈淡粉红色,弹力纤维呈亮粉红色,红血球呈橘红色,蛋白性液体呈粉红色;着色情况与组织或细胞的种类有关,也随其生活周期及病理变化而改变;例如,很多细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱,当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染;胶原纤维在老化和出现透明变性时,伊红着色由浅变深;Masson染色,用于显示组织中纤维的染色方法之一;试剂：Regaud 氏苏木精：苏木精1g,95%酒精10ml,甘油10ml,蒸馏水80ml;将苏木精加入蒸馏水内加温溶解,冷却后加入酒精和甘油,放数日后即可应用;Masson丽春红酸性复红液：丽春红,酸性复红,蒸馏水99ml,冰醋酸1ml; %冰醋酸水溶液：冰醋酸 ml,蒸馏水100 ml;1%磷钼酸水溶液：磷钼酸1g,蒸馏水100 ml;苯胺蓝水溶液：苯胺蓝2g,蒸馏水98 ml,冰醋酸2 ml;1%光绿水溶液：光绿 1g,蒸馏水100 ml;Masson三色法步骤1．石蜡切片脱蜡至水;2．铬化处理或去汞盐沉淀甲醛固定的组织此步可略;3．依次自来水和蒸馏水洗;4．用Regaud苏木精染液或Weigert苏木精液染核5-10min;5．充分水洗,如过染可盐酸酒精分化;6．蒸馏水洗;7．用Masson 丽春红酸性复红液5-10min;8．以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻;9． 1%磷钼酸水溶液分化3-5min;10. 不经水洗,直接用苯胺蓝或光绿液染5min;11．以%冰醋酸水溶液浸洗片刻;12．95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固;结果：胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色如光绿液染色为绿色,胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色,胞核黑蓝色;体会与说明：1．控制好染色步骤;2．组织固定起着很重要的作用,根据不同的固定液可延长或缩短染色时间; 3．%冰醋酸水溶液洗,可使色调清晰鲜艳;4．磷钼酸水溶液对丽春红、酸性复红有分化作用,分化时镜下控制, 肌纤维和纤维素呈红色,胶原纤维呈淡粉红色即可;天狼猩红染色试剂配制1天狼星红饱和苦昧酸液 O．5％天狼星红10ml,苦味酸饱和液90ml;2天青石蓝液天青石蓝B1．25g．铁明矾1．25g,蒸馏水250ml;溶解煮沸、待冷却过滤加入甘油30ml,然后再加入浓盐酸0．5ml;染色步骤1中性甲醛液固定组织,石蜡切片,常规脱蜡至水;2人大青石蓝液染5一lOmin;3蒸馏水洗3次;4天狼星红饱和苦昧酸浓染15-30min5无水乙醇直接分化与脱水;Devil二甲苯透明,中性树胶封固;注意事项1细胞核里染色可以用Harris苏木素染色液谈染;2染色封固后的切片,须及时用偏光显微镜进行观察和照相已保持鲜艳的色彩注：在偏光显微镜下可以观察到四种类型的胶原纤维;l型胶原纤维：紧密排列,显示很强的双折光性,呈黄色或红色的纤维oll型胶原纤维：显示弱的双折光,呈多种色彩的疏松网状分布;皿型胶原纤维：显示弱的双折光,呈绿色的细纤维;lv型胶原纤维：显示弱的双折光的基膜,呈淡黄色;免疫组化步骤ABC法1;4%多聚甲醛常规灌注固定,取材并置20%蔗糖溶液4℃中过夜;蜡块制作;切片,贴片;清洗5min×3后；2;加入配好的%的过氧化氢甲醇溶液甲醇80ml＋ 100ml＋30%过氧化氢30min,以消除内源性过氧化物酶的影响,清洗5min×3；3;加入配好的% Triton X10030% Triton X100＋ 100ml30min,以增加细胞的通透性,清洗5min×3；4;加入用血清稀释液牛血清白蛋白＋ 100ml＋叠氮纳稀释的一抗,4℃存放24-48h；吸去抗体,洗5min×3；5;加入稀释的的二抗,室温孵育2h;洗5min×3；6;加入ABC复合物之类的抗体,室温孵育2h,洗5min×3；蒸馏水迅速冲三次；7;加入显色液,进行免疫组织化学显色,时间一般不超过30min,可不时在显微镜下进行观察,待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液,用蒸馏水迅速冲三次后加入终止反应；8;梯度酒精脱水之后,封片,拍照;免疫组化SP法步骤：SPstreptavidin-perosidase法,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法.按标记物质的种类,如荧光染料、放射性同位素、酶主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶、铁蛋白、胶体金等,可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等;按染色步骤可分为直接法又称一步法和间接法二步、三步或多步法；按结合方式可分为抗原—抗体结合,如过氧化物酶-抗过氧化物酶PAP法和亲和连接,如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物ABC法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结SP法等,其中SP法是最常使用的方法;一般的sp法步骤啊,具体如下：1.烤片,68℃,20分钟,2. 常规二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水；二甲苯I 20min --二甲苯II 20 min--100%酒精I 10min --100%II 10min --95% 5min-- 80% 5min-- 70% 5min3.阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10min,PBS冲洗3X5min；4. 抗原修复:置枸橼酸缓冲液PH 中用煮沸95℃,15－20min,自然冷却20min 以上,再用冷水冲洗缸子,加快冷却至室温,PBS冲洗3X5min;5. 正常羊血清工作液封闭,37℃10 min,倾去勿洗.6. 滴加一抗4℃冰箱孵育过夜,PBS冲洗3X5min用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照；滴加生物素标记二抗, 37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液,37℃孵育30min, PBS 冲洗3X5min;8. DAB/ H2O2反应染色,自来水充分冲洗后,苏木素复染,常规脱水,透明,干燥,封片;免疫组化Elivision二步法：1石蜡切片置于67℃烘箱中,烘片2小时,脱蜡至水,用的PBS冲洗三次,每次3分钟3×3’;2取一定量pH=柠檬酸盐缓冲液,加入微波盒中,微波加热至沸腾,将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,中档微波处理10分钟,取出微波盒流水自然泠却,从缓冲液中取出玻片,先用蒸馏水冲洗两次,之后用PBS冲洗2×3’;注：不是所有的抗体都需要微波修复的,视具体情况而定3每张切片加1滴3% H2O2,室温下孵育10分钟,以阻断内源性过氧化物酶的活性;PBS冲洗3×3’;4除去PBS液,每张切片加1滴相应的第一抗体相应稀释倍数,室温下孵育2小时;5PBS冲洗3×5’;除去PBS液,每张切片加1滴聚合物增强剂试剂A,室温下孵育20分钟;PBS冲洗3×3’;6除去PBS液,每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物试剂B,室温下孵育30分钟;PBS冲洗3×5’7除去PBS液,每张切片加1滴新鲜配制的DAB液,显微镜下观察5分钟;8苏木素复染,%HCl分化,自来水冲洗,蓝化,切片经梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固,晾干后观察;注：即用型第二代免疫组化Elivision plus广谱试剂盒,购自福州脉新生物技术开发有限公司;包括：生物素化抗兔二抗、亲和素Reagent A、生物素－辣根过氧化物酶Reagent B、二氨基联苯胺DAB脱钙剂的配置10%EDTA的配置：1加热水浴锅到65℃2称取NaOH11g加到900mlddH2O中3再加入EDTA-Na2100g至水中；4水浴加热,搅拌至透明溶解5加入Na2HPO46g,NaH2PO4,NaCl9g;蒸馏水定容至1000ml 6调节pH值至~,室温或4度保存。

(13)蒸惚水过洗 1-2 S80%乙醇常规HE 染色步骤(1)二甲苯(I ) 5-10 min(2)二甲苯(H) 5-10 min⑶95%乙醇(1 ) 1-3 min(4) 95%乙醇(11)1-3 min(6) 裁馆水 1 min(7) 苏木液染色 5-15 min(8 ) 流水稍洗去苏木液 1-3 S(9) 1%盐酸乙醇 (10)稍水洗 10-30 S(11)促蓝液返蓝 10-30 S(12)流水冲洗 10-15 min(14) 0.5%曙红液染色1-3 min1 min（1）冰冻切片固定 10 〜30 S95%乙醇（I ）注：①第（10） . （11）步可省去，（12）步冲水时间需延长至20-30mino ②第（20）步如果不川石炭酸二甲苯，可改川无水乙醇。

(16) 80%乙种稍洗1-2 S(18) 95%乙醇（11） 3-5 S(19) 无水乙醇 5-10 min(20) 石炭酸二屮苯 5-10 min(21) 二甲苯（I ） 2 min(22) 二甲苯（II ） 2 min(23) 二甲苯（m ） 2 min(24) 中性树胶対尚2-3 S*冷冻切片HE染色步骤:（2）稍水洗1-2 S （1）冰冻切片固定10 〜30 S(16) 二甲苯（II ） 2—3 S苏木粘液染色（60・C ）30 〜60 S流水洗去苏木耕液 5~10 S(6) (8) 1%盐酸乙醇 稍水洗促蓝液返蓝流水冲洗 （9） 0.5%曙红液染色 （10）熬他水稍洗 (11) 80%乙醇 (12) 95%乙醇 (13) 无水乙醇 (14) 石炭酸二甲苯(15) 二甲苯（I ）1~3 S5 〜10 S15 〜30 S30 〜60 S(17) 中性树胶封固。

注：第（14）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。

染色结果：细胞核蓝色、胞质、肌纤维、胶療纤维和红细胞呈深浅不一的红色。

4. 12切片脱水透明切片经11E染色后.要彻底脱水透明，才能用中性树胶封盖，。

1：取材固定，一定彻底！
2：60% 4小时、70%过夜、80%、90%、95% I各4小时、95% II过夜，100% I、II各1小时，二甲苯I 10分钟，II、III各5分钟，蜡I、II 各2小时；最后制成蜡块。

（AF液2小时、95% I乙醇过夜、95% II乙醇30分钟，100%乙醇 I、II各1小时，二甲苯I 、II各 20分钟，蜡I一小时、蜡II 2小时、蜡III一小时）
3：切片机，5 微米。

捞片、烤干24小时。

4：二甲苯梯度脱蜡，至自来水洗。

彻底！
5：苏木素染色5分钟；
6：自来水洗。

7：1%盐酸酒精分化，蘸两下即可。

8：自来水洗。

9：伊红染色1 分钟。

10：自来水洗。

11：碱水返蓝，蘸两下即可。

12：自来水洗。

13：酒精梯度脱水，至二甲苯。

树胶封片。

如果伊红染色太深的话，解决办法：先把带有二甲苯的片子放入100% II酒精5分钟，然后再把切片放入低浓度酒精中（70%）3—5分钟,依次脱水至二甲苯，重新封片。

HE染色法HE染色法整个染色过程包括五个内容：脱蜡,染色,脱水,透明和封固。

(一)脱蜡:1.从温箱中取出烤干的切片,立即投入二甲苯中脱蜡5～10min(可在二瓶中进行),脱蜡时间长短取决于蜡是不彻底溶解。

气温低可延长时间,气温高可适当缩短时间或在温箱中加速脱蜡。

2.移入无水酒精(100%)(二瓶)中,约2min。

3.移入90%酒精中(二瓶),约2min。

4.移入80%酒精中(二瓶),约2min。

5.移入70%酒精中,约2min。

6.移入水中,洗去酒精,约2～3min。

7.移入蒸馏水中,约2min。

(二)染色:1.移入苏木素中,浸染8～15min,一般以稍深染为宜。

2.移入水中,洗去苏木素和浮色,约1～2min。

3.移入分化液(1%盐酸酒精)中,分化几秒至30秒钟, 使切片褪色至淡兰红色即可。

分化的作用,可使细胞浆兰色脱去,而细胞核更加清晰,鲜丽,分化不足时,胞浆带兰,胞核过染,分化过度时,胞核太淡,难以辩认,可再退回苏木素染液, 延长一定时间。

4.移入流水中,洗涤30～60min,使组织呈鲜兰色或天兰色(兰化)。

5.移入伊红液中,浸染2～5min,如着染缓慢 , 可在伊红液中加入冰醋酸 (100ml伊红液加1～2滴冰醋酸)以助染。

6.移入水中,洗去伊红浮液,并用纱布擦净玻片上的多余染料。

(三)脱水:1.吸去玻片上的水分后多入80%酒精中,(二瓶)脱水,约1～2min, 如在酒精中褪色很快时,可迅速移入90%酒精或返回伊红液中复染。

2.移入90%酒精中(二瓶)脱水,约2～4min。

3.移入无水酒精(100%酒精)(二瓶)彻底脱水,约4～8min。

(四)透明1.移入二甲苯Ⅰ中透明3～5min。

2.移入二甲苯Ⅱ中透明5～10min。

(五)封固:用树胶封固,先从二甲苯Ⅱ中取出切片,将组织外围的二甲苯迅速擦去,在滴上一滴树胶于组织片上,然后取干净的盖玻片,仔细加在封固剂上,慢慢压平, 使盖片位置适中。

切片封固后,放在温箱中烤干,或平置凉干后装盒。

he染色流程步骤HE 染色啊，这可是病理实验中的一项重要技术呢！就好像是给组织细胞精心打扮一番，让它们能更好地展现在我们眼前。

首先得准备好切片，这就像是给模特准备好展示的舞台。

切片要切得薄而均匀，就像裁衣服一样，得有好手艺。

然后把切片放到烤片机上稍微烤一下，让它能稳稳地待在那儿，就像给它定个型。

接下来就是染色的关键步骤啦！先把切片放到苏木精溶液里泡一泡，这苏木精就像是神奇的魔法药水，能让细胞核变得蓝汪汪的，特别好看。

就好像给细胞核穿上了一件蓝色的漂亮衣服。

染完细胞核，就得让细胞质也美起来呀。

这时候就要用到伊红溶液啦，把切片放进去，细胞质就会染上那鲜艳的红色，哇，一下子就生动起来了，就像给细胞质化了个美美的妆。

染完色可还没完事儿呢！还得经过一系列的脱水、透明步骤。

就好像给化好妆的模特做最后的整理，让一切都更加完美。

脱水呢，就像是把多余的水分挤出去，让切片变得更清爽。

透明呢，则像是给切片罩上一层薄薄的面纱，让它更有朦胧美。

最后一步就是封片啦！把切片用盖玻片封起来，就像是给模特穿上了一件华丽的外套，保护好它。

你说这 HE 染色是不是很神奇呀？就这么一步步的，把那些原本我们肉眼很难看清的组织细胞变得清晰又漂亮。

它就像是一个小小的魔法，让我们能更好地了解身体内部的奥秘。

想想看，如果没有 HE 染色，我们怎么能那么清楚地看到细胞的结构和形态呢？怎么能对疾病做出准确的诊断呢？它可是病理诊断的重要手段之一呢！所以啊，一定要好好掌握 HE 染色的流程步骤，这可关系到我们对生命的探索和了解呢！可不能马虎哟！这就像是学一门手艺，得用心去学，才能学好。

你说是不是呢？你要是学会了这一手，那可就厉害了，感觉就像掌握了打开生命奥秘大门的钥匙呢！。

细胞HE染色的标准操作规程（SOP）SOP编号：SOP-YK-QT-019-1 页数：4制定人：审核人：批准人：（签名、日期）（签名、日期）（签名、日期）生效日期：颁发日期：修订登记：审查登记：一、目的是细胞水平的实验研究的基础。

二、准备1.器材：手术刀、剪、镊、止血钳、空针、解剖针和不锈钢或泥龙筛网、培养皿、小烧杯、吸管、离心管、三角瓶、棉球、血细胞计数板。

2.消毒：2.1工作台的消毒：操作前用紫外线照射30分或消毒液、酒精棉球擦拭消毒。

2.2器材的消毒：对解剖器械和器具高温高压消毒，对取材过程中要用到的培养液、平衡盐溶液以及蛋白酶消化液等用微孔滤膜过滤除菌。

2.3操作者的消毒：按外科手术要求洗手和着装。

肥皂水洗手后，消毒液洛本清擦拭，穿衣，戴帽子口罩和手套。

实验过程中怀疑被污染可用酒精擦拭。

3.取材及制备培养材料的基本步骤∶3.1切取或摘取欲培养的动物器官或大块组织，在培养液或平衡盐溶液中洗涤去除血污，剔除附带的脂肪组织、被膜结蒂组织及坏死组织。

必要时可借助显微镜，操作过程中不断给组织块滴加培养液或平衡盐溶液以保持湿润。

3.2将所取的组织块放在盛有培养液的培养皿中，解剖显微镜下将组织切成1mm3左右的小块用于植块培养。

3.3分离细胞培养，先在培养液或平衡盐溶液中剪碎组织，将组织连同培养液用吸管吸至离心管中静置，组织下沉后吸去上清。

加蛋白酶消化液密封，置37度或其他温度条件下消化15～45分，中途用手摇匀数次。

消化结束后吸去含酶溶液，加蛋白酶抑制剂或含血清的培养液终止蛋白酶活性。

用吸管或空针吸取液体吹打组织，以组织块刚好消散为宜。

3.4将制备好的细胞悬液用不锈钢网筛过滤，收集滤液。

如果未滤过的组织过多，可重复上述步骤3)然后再次过滤。

3.5离心滤过液，转速为800～1000r/min，时间为5～10min。

3.6弃上清，将细胞沉淀用少量细胞培养液重新制备为细胞悬液。

3.7细胞计数板计数细胞密度。

常规HE染色步骤（1）二甲苯（Ⅰ）5-10 min(2) 二甲苯（Ⅱ）5-10 min(3) 95%乙醇（Ⅰ）1-3 min （4）95%乙醇（Ⅱ）1-3 min （5）80%乙醇 1 min （6）蒸馏水 1 min （7）苏木精液染色5-15 min(8 ) 流水稍洗去苏木精液1-3 s(9) 1%盐酸乙醇1-3 s(10) 稍水洗10-30 s(11)促蓝液返蓝10-30 s(12) 流水冲洗10-15 min （13）蒸馏水过洗1-2 s(14) 0.5%曙红液染色1-3 min(15) 蒸馏水稍洗1-2 s(16) 80%乙醇稍洗1-2 s(17) 95%乙醇（Ⅰ）3-5min(18) 95%乙醇（Ⅱ）3-5 min(19) 无水乙醇5-10 min(20) 无水乙醇5-10 min(21) 二甲苯（Ⅰ）3-5 min(22) 二甲苯（Ⅱ）2-5 min(23) 二甲苯（Ⅲ）3-5 min(24) 中性树胶封固结果：细胞浆红色，细胞核蓝紫色。

一、操作方法及步骤：①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。

②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。

小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。

③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。

④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。

二、冰冻切片时的注意事项：①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。

有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。

因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。

②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。

he染色步骤 HE实验步骤动物病理切片小结[样本处理]动物麻醉后，开胸，暴露心脏，头皮针插入左心室尖，打开37?生理盐水输液装置，从右心耳下沿剪开右心房，灌洗至流出的生理盐水无血(20min)，换4%多聚甲醛固定液灌注(约5min)[固定]4%多聚甲醛固定。

[石蜡切片]取样从固定中取出待切组织，用手术刀切成2mm厚度的小样，装入脱水小盒中，铅笔标号纸条同放入小盒后流水洗30min，蒸馏水浸洗处理Mice:脱水50%乙醇 2-3h170%乙醇 1-2h80%乙醇 1h95%乙醇 2h(1h+1h)100%乙醇 2h(1h+1h)透明二甲苯 35min+35min浸蜡 1h+1h+1h (62?蜡)[HE染色]脱蜡二甲苯? 15min二甲苯? 15min二甲苯:无水乙醇(1:1) 2min无水乙醇? 2min无水乙醇? 2min95%乙醇 2min85%乙醇 2min70%乙醇 2min50%乙醇 2min蒸馏水 5min(如果是DAB染色要抗原修复)HE染色苏木素 6-8min (时间可以延长，现在10-30min)冲洗 1min(反向将载玻片反向冲洗，注意不要脱片)2含1%盐酸的乙醇进行分色(用75%乙醇配)2-3s动作要快氨水反蓝 >10min伊红 10s冲洗固定脱水95%乙醇 2min100%乙醇? 2min100%乙醇? 2min二甲苯? 2min二甲苯? 2min 树胶封片组织浸蜡-常规石蜡切片制作组织经过透明剂的完全透明后，被移放于65?左右熔化的石蜡中，于65?的电热恒温箱中浸渍的过程称为浸蜡。

组织在脱水时，组织中的脂类和类脂等物质在脱水剂的作用下被溶解掉，留下了许多腔隙，许多管腔组织和血管，也有许多腔隙，这些都严重地影响了切片。

组织浸蜡时，由于诱导剂(二甲苯)的作用，石蜡进入到组织的各个角落，并在各个角落中保存下来。

当石蜡包埋后冷却时，这浸入到里3面的石蜡便可起到支撑的作用，而且使组织不致于变形，塌陷等现象，使切片能完整的切出，便于镜下观察。

HE染色操作常规流程1.实验前准备：1.1收集待染色的样本（如组织切片、细胞涂片等），确保样本保存完整和无污染。

1.2准备好所需的染色试剂：包括有水洗试剂（如去离子水）、染色试剂（如伊红、伊红酒精和亚甲蓝）、染色剂工作液（如伊红酒精和亚甲蓝溶液）等。

2.试片处理：2.1将组织切片或细胞涂片分别放入热腺管或玻璃片上。

2.2连续经过苯酚甲酸苯酯脱脂、乙醇梯度洗脱等步骤，去除样本中的脂肪和碱性物质，以减少后续染色的干扰。

2.3用去离子水洗涤样本，使其充分湿润，除去残存的试剂。

3.染色操作：3.1把处理好的样本放入腺管或玻璃片，倒入伊红酒精溶液中，用大约15-30分钟染色，使细胞和组织成为红色。

3.2轻轻用清水漂洗试品，去掉多余染色液。

3.3加入亚甲蓝液，使样本转为蓝色，使细胞核染色成深蓝色，时间为1-2分钟。

3.4再次用清水将试品漂洗干净。

4.固定和封片：4.1用醋酸纤维素或氯仿等溶剂固定染色后的试片，使试样中的颜色得以固定。

4.2在试片上加一滴封片剂（如封片胶）。

4.3将盖玻片缓慢地放在试片上，使封片剂均匀地覆盖整个样本。

4.4将封片剂封住，使细胞和组织样本能够在显微镜下观察。

5.显微镜观察：5.1将染色好的试片放在显微镜下，调整镜头，适当调节光线强度和聚焦位置，以便观察样本的细节。

5.2观察细胞和组织的形态、染色强度和细胞核的染色情况，并进行必要的记录和照片拍摄。

以上就是HE染色操作的常规流程。

通过此流程，我们可以对细胞和组织样本进行染色，从而得到对染色体分辨和鉴定的结果。

这一技术使我们能够更好地了解细胞和组织样本中的结构和功能，对于生物学和遗传学的研究具有重要意义。

He染色切片制作（各动物、全过程、操作要点、注意事项）石蜡切片制备基本步骤一、准备工作（一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗）1、用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷2、将器皿在自来水下冲洗干净3、将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12~24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3次烘干备用。

（二）配制：硫酸洗液的配制清洁液（洗液）的配制：成分强酸液次强酸液弱酸液浓硫酸（ml） 1000 200 100重铬酸钾（mg） 63 120 100蒸馏水（ml） 200 200 1000重铬酸钾1200g蒸馏水 2000ml将2000ml浓硫酸缓缓倒入上述溶液中，边倒边用木棒轻轻搅拌（三）载玻片与盖玻片的处理1. 将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24小时2. 流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍3. 95%~100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用注：在将载玻片与盖玻片放入清洁液中时，要一片片地投入，使其不致重叠。

二、常用液体的配制（一）缓冲溶液：1．磷酸盐缓冲液A液：0.1mol/L磷酸二氢钠B液：0.1mol/L磷酸氢二钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（3：7≈PH7.0）2．枸椽酸缓冲溶液A液：0.1mol/L枸椽酸B液：0.1mol/L枸椽酸钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（6.2：42.8≈PH6.2）（二）固定剂：1．甲醛：10%甲醛福尔马林 100ml蒸馏水 900ml注：实际甲醛含量只有3.6~4.0%但习惯上都将其视为10%。

2．10％中性福尔马林钙固定液甲醛液 10ml蒸馏水 90ml加碳酸钙至过饱和(以容器底部碳酸钙沉淀1~2cm厚为适度)充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。

3．4%多聚甲醛：8%多聚甲醛多聚甲醛8g蒸馏水 100ml加温至60℃左右，不时搅拌，成为乳白色溶液。

HE染色，全称为苏木精-伊红染色（Hematoxylin and Eosin Staining），是生物学和医学领域中常用的一种细胞和组织染色方法。

它主要用于观察细胞核的形态结构、染色体的分布以及细胞质的成分。

HE染色方法简单、结果清晰，因此在病理学、细胞学和遗传学等领域得到了广泛的应用。

HE染色的原理是通过化学反应使细胞和组织中的特定成分着色，从而呈现出不同的颜色。

在HE染色过程中，首先使用苏木精（Hematoxylin）对细胞核进行染色，使其呈现出深蓝色或紫蓝色；然后使用伊红（Eosin）对细胞质进行染色，使其呈现出粉红色或红色。

通过对比两种颜色的分布，可以清晰地观察到细胞核和细胞质的结构。

HE染色的主要步骤如下：1. 切片制备：将组织切成薄片，通常厚度为4-10微米。

切片的质量直接影响到染色结果的准确性和清晰度。

2. 固定：将切片放入固定液中，使细胞内的蛋白质凝固，防止后续染色过程中细胞结构的破坏。

3. 脱水：将固定后的切片依次放入不同浓度的酒精溶液中，使水分逐渐减少，有利于染料的渗透。

4. 渗透：将切片放入含有苏木精的染液中，使染料渗透到细胞内。

此时，细胞核内的DNA 与苏木精结合，呈现出深蓝色或紫蓝色。

5. 清洗：将切片从染液中取出，用清水冲洗，去除多余的染料。

6. 分化：将切片放入含有酸性溶液的染液中，使细胞核内的苏木精与酸性溶液反应，呈现出不同的深浅程度。

这一步骤有助于区分细胞核的不同区域。

7. 清洗：将切片从染液中取出，用清水冲洗，去除多余的酸性溶液。

8. 脱水：将切片依次放入不同浓度的酒精溶液中，使水分逐渐减少，有利于染料的渗透。

9. 渗透：将切片放入含有伊红的染液中，使染料渗透到细胞质中。

此时，细胞质内的蛋白质与伊红结合，呈现出粉红色或红色。

10. 清洗：将切片从染液中取出，用清水冲洗，去除多余的染料。

11. 透明：将切片放入透明剂中，使切片透明化，便于观察。

12. 封片：将透明后的切片放在载玻片上，用封片胶封住，避免水分蒸发和污染。

HE染色及组化步骤
组织固定及HE染色步骤
1、固定：刚取的新鲜组织块经福尔马林溶液固定48小时（一般固定2天）
2、用镶子取出放到大的蜡盒上，用刀片切成1*0.5厘米的小块，用小白蜡盒包上，放入80%
的乙醇中过夜
3、脱水：第二天早上8点，把蜡盒依次放入95% I的乙醇中（3h）— 95%II的乙醇中（3h）
—100% I的乙醇中（3h）— 100%II的乙醇中（过夜）
4、透明：第二天早8点从100%11的乙醇中取出小蜡盒放到二甲苯1、二甲苯II中各30 分钟
5、浸蜡：放入蜡缸中I、II、IIL中各浸泡30分钟
6、包埋
7、切片
8、烤片
HE染色
二甲苯I （30min）—二甲苯II （30min）一100% I 的乙醇中（lOmin）一 100%II 的乙醇中（lOmin） 95%的乙醇中（5min）—90%的乙醇中（5min）—80%的乙醇中（5min）—自来水缸中浸泡5min —苏木精染核5min —水洗一1%的盐酸酒精分化一水洗一弱氨水返蓝一水洗一镜下观察一伊红染质（15min）—水稍洗一80%的乙醇、95%的乙醇I、95% 的乙醇II中各过一下即可一100% I的乙醇中（5min）— 100%II的乙醇中（lOmin）—二甲苯I （lOmin）一二甲苯II （lOmin）一中性树胶封片
免疫组化步骤
切片常规脱蜡至水洗预处理（热修复或酶消化）阻断3%的H202 PBS洗封闭加一抗（鼠或兔抗人）PBS洗加二抗（生物素标记IgG鼠或兔））PBS洗加三抗（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）PBS洗
DAB（AEC或BCIP/NBT）显色水洗复染核水洗弱氨水返兰水洗脱水透明封片。

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