第三章 荧光分光光度法

荧光分光光度法的名词解释荧光分光光度法是一种常用于分析化学领域的光谱分析技术。

它主要利用物质在受到紫外光激发后吸收能量并发射出可见光的特性进行定量和定性分析。

一、荧光现象解析1. 光激发与光发射在荧光分光光度法中，样品通常处于低能量状态，并能吸收特定波长的紫外光。

当样品受到紫外光激发后，部分激发态的分子会跃迁至高能量的激发态。

而在分子返回低能量态的过程中，会发射出比激发态能级较低的可见光，形成荧光现象。

这可用于分析样品的组成、浓度、结构及化学性质等。

2. 荧光寿命荧光寿命是指物质从受到激发到光发射结束所经过的时间。

荧光分光光度法可通过测量样品中发射的荧光光强随时间的变化，计算出荧光寿命。

荧光寿命与物质的环境、浓度、分子结构等因素有关，因此可以用来定量分析。

二、荧光分光光度法的原理1. 荧光光谱分析荧光分光光度法通过测量样品的荧光光谱来分析物质的成分和性质。

利用荧光光谱可以确定荧光发射的波长范围，并对不同波长处的发射强度进行测量。

这些荧光光谱图可以用来确定物质的定性和定量分析。

2. 荧光光度法荧光光度法利用荧光光度计测量样品的荧光强度和荧光寿命。

荧光光度计通常包含紫外-可见光源、光栅或单色仪、荧光探测器等。

样品受到激发后发射的荧光光通过光栅或单色仪进行分光，然后荧光探测器测量各个波长处的荧光强度。

这种光度计可提供高灵敏度和准确的荧光测量结果。

三、荧光分光光度法的应用1. 化学分析荧光分光光度法广泛应用于化学分析领域。

它可以通过测量荧光光谱和荧光强度，实现对物质浓度的定量测定，如荧光显微分析、荧光光谱分析、化学发光等。

此外，荧光分光光度法还可用于监测环境中的有毒物质和污染物。

2. 生物医学研究荧光分光光度法在生物医学研究中也具有重要应用。

例如，可以利用荧光探针与特定的生物分子结合，实现对DNA、RNA、蛋白质等生物分子的定性和定量分析。

此外，荧光分光光度法在药物研究、生物标记物探测、细胞成像等方面也发挥重要作用。

荧光分光光度法的原理荧光分光光度法是一种常用的分析技术，主要用于测定物质中的荧光发射强度。

它基于荧光物质吸收能量后发生激发态转变的原理，通过测量样品在不同波长下发射的荧光强度来分析物质的成分和浓度。

荧光分光光度法的原理基于荧光现象，即物质在吸收辐射能量后，会从基态跃迁到激发态，然后再发射出荧光。

这种荧光发射的波长和强度与物质的结构和环境有关，因此可以通过测量荧光的特性来获得样品的信息。

荧光分光光度法的基本装置包括激发源、选择性的滤光片或光栅、样品池和荧光检测器。

激发源通常使用紫外光或可见光，其波长可以根据待测样品的特性进行选择。

滤光片或光栅用于选择特定的波长范围，以便测量样品在该波长下的荧光强度。

样品池用于容纳待测样品，并通过光路使激发光和荧光光进入检测器进行测量。

在进行荧光分光光度测量时，首先需要选择适当的激发光源和荧光检测器，以及调节合适的滤光片或光栅。

然后将待测样品放入样品池中，使其与激发光发生作用。

样品吸收激发光后，发生激发态转变，并发射出荧光。

荧光光通过滤光片或光栅进行选择性筛选，然后进入荧光检测器进行测量。

荧光分光光度法的应用十分广泛。

在生物医学领域，它常用于荧光染料的检测和荧光标记的分析。

在环境监测中，荧光分光光度法可以用来检测水中的有机物污染物。

此外，荧光分光光度法还可以用于食品检测、药物分析、环境污染监测等领域。

荧光分光光度法相比于其他分析技术具有许多优点。

首先，它具有极高的灵敏度，可以检测到很低浓度的物质。

其次，荧光分光光度法对样品的破坏较小，可以进行非破坏性分析。

此外，荧光分光光度法还具有选择性和快速性的特点，可以同时测定多个物质。

然而，荧光分光光度法也存在一些局限性。

首先，荧光分光光度法对样品的环境要求较高，如温度、pH值等因素都会影响荧光强度。

其次，荧光分光光度法在样品有强荧光背景的情况下，可能会受到干扰。

此外，荧光分光光度法对荧光物质的选择性较差，容易受到其他物质的影响。

荧光分光光度法2015年版《药典》四部通则0405某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的荧光。

物质的激发光谱和荧光发射光谱，可用于该物质的定性分析。

当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系，可以用于该物质的含量测定。

荧光分光光度法的灵敏度一般较紫外-可见分光光度法高，但浓度太高的溶液会发生“自熄灭”现象，而且在液面附近溶液会吸收激发光，使发射光强度下降，导致发射光强度与浓度不成正比，故荧光分光光度法应在低浓度溶液中进行。

测定法所用的仪器为荧光计或荧光分光光度计，按各品种项下的规定，选定激发光波长和发射光波长，并制备对照品溶液和供试品溶液。

通常荧光分光光度法是在一定条件下，测定对照品溶液荧光强度与其浓度的线性关系。

当线性关系良好时，可在每次测定前，用一定浓度的对照品溶液校正仪器的灵敏度；然后在相同的条件下，分别读取对照品溶液及其试剂空白的荧光强度与供试品溶液及其试剂空白的荧光强度，用下式计算供试品浓度：为供试品溶液的浓度；式中 cX为对照品溶液的浓度；cr为供试品溶液的荧光强度；Rx为供试品溶液试剂空白的荧光强度；RXb为对照品溶液的荧光强度；RrRrb为对照品溶液试剂空白的荧光强度。

因荧光分光光度法中的浓度与荧光强度的线性较窄，故（Rx -RXb）/（Rr-Rrb）应控制在0.5～2之间为宜，如若超过，应在调节溶液浓度后再进行测定。

当浓度与荧光强度明显偏离线性时，应改用标准曲线法进行含量测定。

对易被光分解或弛豫时间较长的品种，为使仪器灵敏度定标准确，避免因激发光多次照射而影响荧光强度，可选择一种激发光和发射光波长与供试品近似而对光稳定的物质配成适当浓度的溶液，作为基准溶液。

例如蓝色荧光可用硫酸奎宁的稀硫酸溶液，黄绿色荧光可用荧光素钠水溶液，红色荧光可用罗丹明B水溶液等。

在测定供试品溶液时选择适当的基准溶液代替对照品溶液校正仪器的灵敏度。

荧光分光光度法荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。

其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。

通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。

荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190-650nm，发射波长扫描范围是200-800nm。

可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。

荧光分光光度计的工作原理：物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。

在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。

荧光分光光度计基本结构：①光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故②激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。

③发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。

筛选出特定的发射光谱。

④样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。

测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。

⑤检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。

荧光分光光度法原理荧光分光光度法是一种基于物质吸收与发射荧光的分析技术。

它利用物质在吸收紫外光能量后，发生电子从基态跃迁到激发态，再经过热辐射和无辐射跃迁的复合过程，从激发态退回基态，释放出的能量以荧光形式发射出来。

通过测量荧光的强度和波长分布，可以对样品中的化合物进行定量和定性分析。

1.激发：激发光源照射样品溶液，激发光源通常为紫外光和可见光，其波长需要与所研究的物质的激发波长匹配。

激发光源经过滤波器选择特定波长的光线，然后通过光导纤维引导到样品室中。

2.激发态产生：样品中的物质吸收光能量，使得物质的电子由基态跃迁到激发态。

激发态的产生取决于样品中的化合物种类，以及激发光源的能量和波长等因素。

3.荧光发射：激发态的物质经过热辐射和无辐射跃迁的复合过程，返回基态。

在这个过程中，部分能量以荧光的形式发射出来。

发射的荧光波长与激发光的波长不同，可以通过光栅或者单色仪分离出来。

4.荧光光谱测量：通过荧光光谱仪对荧光进行测量，荧光光谱仪通常由光栅、检测器（如光电倍增管）和数据采集系统组成。

荧光光谱仪能够选择特定波长范围的荧光进行测量，并将荧光信号转化为电信号。

5.信号处理：荧光信号经过光电器件转换为电信号后，通过放大、调理和滤波等处理，最终通过数据采集系统记录和分析。

荧光分光光度法的优势在于其高灵敏度、高选择性和广泛的应用范围。

它可以应用于环境、食品、制药、生物化学等领域的定量分析和荧光标记分析。

此外，荧光分光光度法还可以结合其他技术，如高效液相色谱、毛细管电泳等，提高其分析的准确性和灵敏度。

荧光分光光度法的一些应用包括：药物分析、痕量元素测定、蛋白质分析、环境污染物检测、核酸分析、生物标记等。

在荧光分析中，还有一些常用的技术方法，如荧光共振能量转移（FRET）、荧光探针和荧光染料等，这些方法进一步扩展了荧光分光光度法的应用范围和分析手段。

总之，荧光分光光度法基于物质的吸收与发射荧光原理，通过测量荧光的强度和波长分布，实现对物质的定量和定性分析。

简述荧光分光光度法的原理荧光分光光度法（Fluorescence Spectrophotometry）是一种分析化学技术，利用物质在荧光激发下发出更长波长的荧光辐射来测定物质的含量或性质。

与紫外-可见分光光度法相比，荧光分光光度法对于具有天然或人工诱导荧光性质的分析物具有更高的灵敏度和选择性。

荧光分光光度法的原理基于分子的电子能级结构和电荷转移的量子化学过程。

当物质吸收辐射能量而处于激发态时，其分子内的电子会跃迁至高能级的激发态轨道，而随后又会返回到基态。

返回基态时，分子会通过非辐射跃迁散失能量，部分以辐射形式释放出来，即发出荧光。

荧光的波长通常较原始激发辐射能量的波长长，一般在可见光或近紫外光区域。

荧光分光光度法的基本设备包括激发源、选择性的滤光片或光栅、样品室、接收器和数据处理器。

光源通常是一个Xe闪光灯、汞灯或激光器，可提供适当波长的辐射。

这些辐射经过选择性的滤光片或光栅进行波长选择，然后照射到样品上。

样品与激发光发生作用后，会发射出荧光，其中一部分被收集并导入接收器中。

接收器随后将荧光信号转换为电信号，并通过数据处理器进行进一步分析和处理。

荧光分光光度法具有以下优点：1.高灵敏度：荧光信号的检测灵敏度远高于吸收光度法。

这是因为荧光信号的检测不受激发光波长影响，而仅受物质的荧光效率影响。

2.高选择性：由于荧光分光光度法是通过分子特征的电子能级来分析样品，因此具有较高的选择性。

可以通过设计适当的荧光探针或使用特异性荧光标记物来分析特定物质。

3.宽测量范围：荧光信号的测量范围通常宽于吸收光度法。

这是因为吸收光度法所测量的信号是来自于激发光的吸收，而荧光信号的测量是来自于荧光发射。

4.低背景噪声：相对于吸收光度法，荧光分光光度法的背景噪声通常较低。

这是因为背景荧光的产生通常很少，且荧光信号较强烈，很容易与背景噪声区分开来。

5.可检测多组分：荧光分光光度法可以使用不同的激发波长和荧光波长来分析多组分样品。