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实验二荧光分光光度法测定富里酸——一实验目的与要求1、了解荧光分光光度计的基本组成结构，并学会操作使用；2、掌握荧光分光光度法定量分析的基本原理。
二实验原理富里酸（FA）在水中是一种荧光物质，并且在低浓度时，荧光强度与FA浓度呈正比：I f = kc基此，测定一系列已如浓度的富里酸的荧光强度，然后以荧光强度对富里酸浓度作标准曲线，再测定未知浓度富里酸的荧光强度，把它代入标准曲线方程求出其浓度。
图1富里酸的分子结构三仪器、药品及材料F-7000型分子荧光分光光度计，吸收池，容量瓶，移液枪；富里酸，去离子水四实验步骤1．系列标准溶液的配制准确称取0.2500g富里酸，加入少量水溶解，移至250mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。
此富里酸溶液浓度为1.000g·L-1。
取6只100 mL的容量瓶分别加入1.000g·L-1的富里酸标准液0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL,，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。
2．绘制激发光谱和发射光谱在200-500 nm范围内扫描荧光激发光谱。
在300-600 nm范围内扫描荧光发射光谱。
3. 绘制标准曲线荧光激发波长固定在340 nm处，荧光发射波长固定在420 nm处，从发射光谱上测定系列标准溶液的荧光发射强度。
4．未知试样的测定在标准系列溶液同样条件下，测定未知样品的荧光发射强度。
5．绘制荧光强度I f对富里酸溶液浓度c的标准曲线，并由标准曲线求算未知试样的浓度。
五数据处理1．原始数据标准溶液未知液样品编号 1 2 3 4 5 6 x浓度/(mg∙L-1) 0 2 4 6 8 10荧光强度-0.029 0.230 0.462 0.675 0.916 1.122 0.774 2．标准曲线绘制和未知样品含量计算。
得到富里酸荧光强度与浓度的关系曲线为y=0.1147x-0.0106，测得未知液荧光强度为0.774，即0.774=0.1147x-0.0106得：x=6.84所以未知样品浓度为6.84mg∙L-1六实验注意事项1、试液的浓度不要太高。
荧光分光光度法荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。
其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。
通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。
荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190-650nm，发射波长扫描范围是200-800nm。
可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。
荧光分光光度计的工作原理：物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
荧光分光光度计基本结构：①光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故②激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
③发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
④样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。
⑤检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。
荧光分光光度法(Fluorescence Spectrophotometry)前言：•1852年，斯托克斯（Stokes）发现萤石在暗处受到光的照射会发出一种蓝白色的光，他把这种光命名为“荧光”。
•1868年Goppelstroeder发表了利用Al-桑色素绿色荧光来分析微量Al的分析方法，可见荧光分析是一种历史悠久的分析方法。
时至今日，荧光分析在方法上取得了极大的进展。
促进了诸如：时间分辨、相分辨、荧光偏振、荧光免疫、同步荧光等荧光分析新方法的发展，同时促使各种各样新型荧光分析仪器的出现。
在仪器化方面，微机控制的全自动荧光分析仪具有灵敏度高（比紫外-可见分光光度法高2~3个数量级）、选择性好、工作曲线线性范围宽，且能提供激发光谱、发射光谱、发光强度、发光寿命、量子产率、偏振和各向异性诸多信息等优点，已成为一种重要的痕量分析技术。
在生物、医学、医药、环境和石油工业等诸多领域，荧光分析法都有广泛的应用。
不仅能直接和间接地分析众多的有机化合物，而且利用与有机试剂间的反应还能进行许多无机元素的测定。
随着科技的发展进步，荧光这种光致发光（photoluminescence）的本质进一步被揭开：•物质除了受紫外-可见光照射后会发出紫外和可见（UV-Vis）荧光之外，受其它各种不同波长光的照射后，同样也有发光现象。
例如：X-荧光、红外荧光等。
•除了吸收光能使分子激发而发光，根据起始激发形成的方式，可以将荧光同其它的发光类型（例如：生物发光、热发光、化学发光和摩擦发光）区别开来。
•通过化学反应使分子受激而发光称为“化学发光”。
利用化学发光进行分析工作叫“化学发光分析”。
•化学发光分析、荧光分析和磷光分析统称为“分子发光分析(molecular luminescence)”。
•荧光和磷光同属光致发光。
通过测定发光的强度可以定量测定许多痕量的无机物和有机物。
•相对于磷光和化学发光而言，目前荧光法的应用较多。
本章主要讨论荧光分析。
