inhibitor and mimics转染使用说明方法学

注：1）不同细胞的生长速度不同，接种细胞的数量需依经验而定；2）每孔接种的细胞数量尽量相同，使细胞均匀分布。

b. 悬浮细胞：接种1×105~5×105个细胞至含有500μl完全培养基的24孔板。

2）转染步骤对于每个转染样品，请按以下步骤准备：a. 稀释mimic：用50μl 1X ribo FECT TM CP Buffer（v1）稀释1.25μl 20μM miRNA mimic储存液（v2），轻轻混匀，室温孵育5min。

b. 混合液制备：加入5μl ribo FECT TM CP Reagent（v3），轻轻吹打混匀，室温孵育0～15min。

注：1）请不要振荡，溶液可能会有浑浊，但不会影响转染；2）混合液可室温放置一段时间，但不宜超过24h。

c. 将ribo FECT TM CP混合液加入到443.75μl细胞培养基（v4）中，轻轻混匀。

注：混合液加入原细胞培养基，无需移除或更换。

d. （可选）进行其他必要的特殊处理（如加药处理）。

e. 将培养板置于适当的培养条件下培养24~96h（培养时间与实验目的相关）。

表2 使用ribo FECT TM CP转染miRNA mimic用量参考v1: ribo FECT CP Buffer (1X)； v2: 20μM miRNA mimic储存液； v3: ribo FECT CP Reagent； v4: 细胞培养基注： 1）*：实验示例用量参考。

2）表中数据仅供参考，对于部分细胞类型的转染试剂用量可进一步优化。

3）转染质粒时，转染试剂用量可优化至1μl (24孔板)。

3）效果检测miRNA mimic/inhibitor作用效果往往通过功能方面检测，转染完成后24~72小时均可进行检测，最佳检测时间与细胞类型及研究的miRNA有关。

以下为几种常用的miRNA效果检测方法：a. 使用qPCR，基因芯片，新一代测序等方法检测靶基因mRNA转录水平，甚至全基因表达图谱是否发生相应改变；b. 使用Western Blot，蛋白芯片等方法检测靶基因的蛋白水平是否发生相应改变；c. 检测细胞功能（细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移等）是否发生相应变化；d. 通过靶基因siRNA来确认miRNA mimic/inhibitor的作用；e. 通过与miRNA靶基因双荧光素酶报告载体（锐博生物可提供构建服务）共转来验证miRNA mimic/inhibitor的作用。

miR-17-5p靶向PTEN促进非小细胞肺癌吉非替尼耐药罗凯;黎谢梦丹;郑国沛;刘浩;贾小婷;王倩;张志杰;贺智敏【摘要】目的探讨miR-17-5p在NSCLC吉非替尼耐药中的作用.方法 QRT-PCR 法检测miR-17-5p在细胞模型中的表达.MTS法检测细胞过表达或敲低miR-17-5p后的耐药性变化.预测miR-17-5p下游靶基因并通过双荧光素酶报告基因实验、功能阻断实验等证实miR-17-5p通过靶向PTEN基因介导对吉非替尼的耐药.QRT-PCR法检测耐药前后NSCLC患者血清中的miR-17-5p表达.结果 miR-17-5p在耐药细胞中表达增加(P<0.05).敏感与耐药细胞中分别过表达和敲低miR-17-5p后,细胞对吉非替尼耐药性分别增加和降低(P<0.05).发现PTEN为miR-17-5p下游靶基因,敲低PTEN后可逆转敲低miR-17-5p导致的耐药性降低.耐药后NSCLC患者血清中miR-17-5p表达升高.结论 miR-17-5p通过下调PTEN表达促进了NSCLC对吉非替尼的耐药.【期刊名称】《实用医学杂志》【年(卷),期】2019(035)011【总页数】6页(P1717-1721,1726)【关键词】非小细胞肺癌;miR-17-5p;PTEN基因;吉非替尼;耐药性【作者】罗凯;黎谢梦丹;郑国沛;刘浩;贾小婷;王倩;张志杰;贺智敏【作者单位】广州医科大学附属肿瘤医院/广州医科大学肿瘤研究所,广州510095;广州医科大学附属肿瘤医院/广州医科大学肿瘤研究所,广州510095;广州医科大学附属肿瘤医院/广州医科大学肿瘤研究所,广州510095;广州医科大学附属肿瘤医院/广州医科大学肿瘤研究所,广州510095;广州医科大学附属肿瘤医院/广州医科大学肿瘤研究所,广州510095;广州医科大学附属肿瘤医院/广州医科大学肿瘤研究所,广州510095;广州医科大学附属肿瘤医院/广州医科大学肿瘤研究所,广州510095;广州医科大学附属肿瘤医院/广州医科大学肿瘤研究所,广州510095【正文语种】中文肺癌是严重威胁大众健康的重要恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占80% ～85%。

mimics和inhibitor原理1.概述在化学和生物学领域，m im ic s（模拟物）和in hi bi to r（抑制剂）是两个常用的概念。

它们在研究和应用中发挥着重要的作用。

本文将介绍m i mi cs和i nh ib ito r的基本原理，以及它们在不同领域的应用。

2. mi mics的原理m i mi cs，即模拟物，是指具有某种结构或功能的化学物质或生物分子，可以模拟某个天然物质在生物体内的作用方式或机制。

它们可以是天然存在的物质，也可以是通过合成得到的人工物质。

m i mi cs主要通过以下几种方式实现其原理：2.1结构相似性m i mi cs通过拥有与目标物质相似的结构，来模拟目标物质的作用。

在生物学中，结构相似的分子可能会与相同的受体结合，触发相似的生物反应或拥有类似的生物效应。

2.2功能相似性m i mi cs可以通过模拟目标物质的功能来发挥作用。

例如，在药物研发中，研究人员可以设计并合成与目标分子具有相似作用的分子，以期望达到相同或类似的治疗效果。

2.3替代作用m i mi cs还可以通过替代目标物质的作用，起到一种替代或代替的效果。

例如，一些环境科学研究中，替代物质被用来取代对环境有害的化学物质，以减少对生态系统的影响。

3. mi mics的应用m i mi cs广泛应用于不同领域，包括医药、农业、化学工业、环境科学等。

以下是一些常见的应用领域：3.1医药领域在药物研发中，研究人员常常利用mi mi cs的原理设计和合成新药。

通过模拟目标分子的结构或功能，Mi mi cs可以具有类似的药效，完成特定的治疗任务。

例如，抗生素是一类模拟细菌生物代谢途径的化合物，通过破坏细菌的代谢过程来杀死细菌。

3.2农业领域在农业上，m im ic s被用于设计和合成农药，来模拟对抗害虫或病原体的天然防御機制。

这种方法可以帮助农民更有效地对抗农作物的病害，提高农作物产量和质量。

3.3化学工业化学工业中，mi mi cs的原理常被用于设计和合成新型催化剂。

miR-24-3p对猪颗粒细胞雌二醇合成的作用时胜洁;王立光;高磊;蔡传江;何伟先;褚瑰燕【期刊名称】《畜牧兽医学报》【年(卷),期】2024(55)1【摘要】旨在探究miR-24-3p对猪颗粒细胞雌二醇合成的影响。

本试验收集180日龄健康母猪的卵巢组织,每次试验取20对卵巢进行颗粒细胞的分离培养,将miR-24-3p的mimics及inhibitor转染进颗粒细胞,通过ELISA、RT-qPCR、Western blot、双荧光素酶报告试验等技术探究miR-24-3p对猪颗粒细胞雌二醇合成的作用。

结果表明,过表达miR-24-3p可显著促进雌二醇的合成(P<0.01),并加快StAR、CYP19A1和CYP11A1的转录和翻译(P<0.05);而干扰miR-24-3p则显著抑制雌二醇的合成(P<0.05),并显著下调CYP11A1、CYP19A1的mRNA和蛋白水平(P<0.05)。

进一步研究发现,TOP 1是miR-24-3p的直接靶基因,过表达miR-24-3p可显著抑制TOP1的表达(P<0.05),干扰miR-24-3p可显著上调TOP1的表达(P<0.05)。

而过表达TOP 1则可减弱miR-24-3p对颗粒细胞雌二醇合成的促进作用(P<0.05)。

综上所述,miR-24-3p通过靶向TOP 1抑制其mRNA和蛋白水平,促进雌二醇合成相关基因的表达水平从而促进颗粒细胞的雌二醇合成。

鉴于颗粒细胞的雌二醇合成能力直接影响卵巢卵泡的发育状态,因此本研究为筛选提高母猪繁殖性能的miRNA提供理论依据。

【总页数】10页(P169-178)【作者】时胜洁;王立光;高磊;蔡传江;何伟先;褚瑰燕【作者单位】西北农林科技大学动物科技学院;齐全农牧集团股份有限公司【正文语种】中文【中图分类】S828.3【相关文献】1.γ-GABA对大鼠离体培养颗粒细胞生成雌二醇的影响及作用机制2.FSH处理对猪颗粒细胞中类固醇合成酶基因的表达及其调控区组蛋白H3修饰的影响3.甲状腺素对猪卵巢卵泡颗粒细胞类固醇激素合成及增殖的影响4.原花青素B2对猪颗粒细胞氧化损伤的保护作用及机制研究5.α-亚麻酸对猪颗粒细胞胆固醇合成、类固醇激素合成和凋亡的影响因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

mmu-miR-125a-5p研究策略Standard 报价Standard 报价2ng 350 RMB 5ng 600 RMBmicr ON™ mmu-miR-125a-5pmimic2ng 300 RMB 5ng 500 RMBmicr OFF™ mmu-miR-125a-5pinhibitor,转染mmu-miR-125a-5p mimic(24孔板为例)1．联系锐博公司合成mmu-miR-125a-5p mimic和mmu-miR-125a-5p inhibitor;2．合成的2ng mmu-miR-125a-5p mimic用1000ul RNase-free water配制成20uM的储存液,分装成5ul每管放-30或-80冻箱冻存(mimic的工作浓度为50nM);3．转染前一天，胰酶消化细胞并计数1X105 c-kit-，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。

细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中;4．对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释1.25ul mmu-miR-125a-5p mimic 存储液;5．对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ无血清培养基稀释1μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。

Lipofectamine 2000稀释后室温5分钟（在30分钟内同稀释的RNA混合。

室温时间过长会降低活性。

）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。

如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合6．混合稀释的RNA（第4步）和稀释的Lipofectamine 2000（第5步）。

在室温保温20分钟。

注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。

复合物可以在室温保持6小时稳定7．直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀,加入500ul培养基,混匀。

RNAinhibitor细胞转染实验步骤
下面以Entranster-R4000试剂为例，说一下RNA inhibitor转染步骤（24孔板）
1.提前1天细胞种植
贴壁细胞：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度（Confluence）在30％左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。

悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。

如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那么就用2×105的细胞进行转染。

2.转染过程
⑴取0.67ug(50pmol)的RNA mimic，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μl。

注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。

⑵取1ul的EntransterTM-R4000，然后加入24ul无血清稀释液体，充分混匀，制成EntransterTM-R4000稀释液，终体积为25μl。

室温静置5分钟。

⑶将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合（可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上）混合，室温静置15分钟。

转染复合物制备完成。

⑷将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基（可含10%血清和抗生素）的细胞上，前后移动培养皿，混合均匀。

注意：对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。

⑸转染后6小时观察细胞状态，如状态良好可不必更换培养基，继续培养24-96小时得到结果。

miRNA 及其inhibitor 转染方法1 对mimics、mimics control 、inhibitor 、inhibitor control 进行稀释和分装(终浓度为100 nmol/ 卩l)。

(1)Mimics加入250卩l DEPC处理的水；(2)Mimics control 加入125 卩l DEPC 处理的水；(3)inhibitor加入250卩l DEPC处理的水；(4)inhibitor control 加入125 卩l DEPC 处理的水；对以上进行分装：mimics 20卩l每管，mimics control 10卩l每管，inhibitor 20卩l 每管，inhibitor control 10 卩l 每管。

分装后于—80 C保存。

2经过调整，细胞状态较好。

晚上铺细胞，4个60 mm培养皿，每皿7.0 x 105细胞。

做好标记，( 1 )为mimics( 2)为mimics control( 3)为inhibitor( 4)为inhibitor control。

3 上午八点对昨天晚上的细胞进行转染。

(1) a 用500卩l opti-MEM 稀释20 卩l mimics，作用 5 minb 用500卩l opti-MEM 稀释20 卩l mimics control，作用5 minc 用500卩l opti-MEM 稀释20 卩l inhibitor，作用5 mind 用500卩l opti-MEM 稀释20 卩l inhibitor control，作用5 min(2) a 用500卩l opti-MEM 稀释10 卩l lip 2000，作用5 minb 用500卩l opti-MEM 稀释10 卩l lip 2000，作用5 minc 用500卩l opti-MEM 稀释10 卩l lip 2000，作用5 mind 用500卩l opti-MEM 稀释10 卩l lip 2000，作用5 min( 3)分别将( 1 )、( 2)对应的a、b、c、d 混合，轻轻吹打均匀后室温作用20 min。

HiPerFect转染试剂的使⽤在做miRNA的相关实验中，在验证靶基因⽅⾯，通常是向靶细胞转染miRNA mimics，或者是构建稳定过表达的miRNA的细胞株，然后做WB即可。

我的靶细胞是RAW264.7，但向这种细胞株转染miRNA mimics时，使⽤lipo2000或lipo3000的效率没那么⾼，不太容易做出结果（⽂献中有⼈使⽤的，效果很好，但我实验中总是做不出来）。

后来在QIAGEN官⽹上搜到了⼀个转染试剂，HiPerFect，看介绍这个转染试剂是专门⽤于转染miRNA的。

以下是实验流程，具体实验我还没做，只是翻译了说明书中的内容。

1. 将2.5x10e5个RAW264.7细胞铺在6孔板中，培养基体积为2.3mL，含FBS与双抗。

2. 转染时，将150ng的miRNA稀释到100uL的不含⾎清的培养基中（通常使⽤OPTI-MEN培养基），如果是miRNAinhibitor，剂量增加10倍，使miRNA的终浓度为5nM，这个浓度根据实验⽽定，⽂献中使⽤lipo2000或3000转染miRNA mimcs时的终浓度是20nM-100nM，但QIAGEN的说明书中提到，这个转染试剂的优点在于能在低浓度⽔平上进⾏miRNA的转染。

加⼊12uL的HiPerFect到OPTI-MEM中，混匀。

说明书中还提到，在正式实验前，最好根据⾃⼰实验室的条件与靶细胞，优化⼀下剂量。

miRNA mimics的储备浓度通常是20uM，如果要使终浓度为100nM，那么就要加10uL的储备液。

3. 在常温下孵育5到10minj。

4. 将上述的转染复合物逐滴加到6孔板中，轻轻混匀。

5. 将细胞培养板放到孵箱中，在24到72⼩时后检测基因表达量（我觉得等细胞长到80%密度的时候就⾏），如果细胞数⽬过少，中间记得更换新培养基。

以下是说明书中提供的参考数据（6孔板的⼀个孔）：。

mimics和inhibitor原理-回复mimics和inhibitors是生物学和医学领域中常见的概念。

它们在研究和开发新药物、治疗疾病和了解生物过程等方面起着重要的作用。

本文将详细介绍mimics和inhibitors的原理，展示它们在科学研究中的应用。

通过一步一步的解释，我们可以更好地理解这些概念。

首先，让我们从mimics（模拟物）开始。

在生物学中，mimics是指具有与某种生物分子或生物过程相似的特征或功能的物质。

这些物质可以是化合物、分子、药物或其他类型的生物分子。

通过模拟目标分子或过程，mimics能够模仿其作用方式并与其相互作用。

那么，为什么要使用mimics呢？有几个原因。

首先，mimics可以用于研究生物分子的作用机制。

通过设计和合成具有与目标分子相似特征的mimics，研究人员可以深入了解目标分子如何与其他分子相互作用以及其所起的生物作用。

其次，mimics还可以用于开发新药物。

通过了解目标分子的作用机制，研究人员可以设计和合成具有类似作用的mimics，用作潜在的药物分子。

这种策略有助于发现新的治疗方法和更有效的药物。

接下来，让我们转向inhibitors（抑制剂）。

与mimics相反，inhibitors 是指能够减弱或阻止某种生物分子或生物过程的活性或作用的物质。

在生物学和医学研究中，抑制剂被广泛用于研究和治疗各种疾病。

抑制剂的工作原理有多种方式。

首先，抑制剂可以与目标分子结合，阻止其与其他分子的相互作用。

这种结合可以是可逆的或不可逆的，具体取决于具体的分子和研究目的。

其次，抑制剂还可以影响目标分子的活性。

它们可以阻断目标分子的活性中心或与其结合的底物结合点，从而干扰其正常的生物作用。

抑制剂在药物开发和治疗中发挥着重要的作用。

例如，一些疾病的发展与某些酶的过度活化有关。

通过设计和合成特定的酶抑制剂，研究人员可以干扰过程并阻止疾病的进展。

此外，抑制剂也可以用于研究生物过程的调节机制。

miRNA及其inhibitor转染方法1 对mimics、mimics control、inhibitor、inhibitor control进行稀释和分装（终浓度为100 nmol/μl）。

（1）Mimics加入250 μl DEPC处理的水；（2）Mimics control加入125 μl DEPC处理的水；（3）inhibitor加入250 μl DEPC处理的水；（4）inhibitor control加入125 μl DEPC处理的水；对以上进行分装：mimics 20 μl每管，mimics control 10 μl每管，inhibitor 20 μl每管，inhibitor control 10 μl每管。

分装后于－80 ℃保存。

2经过调整，细胞状态较好。

晚上铺细胞，4个60 mm培养皿，每皿7.0×105细胞。

做好标记，（1）为mimics（2）为mimics control（3）为inhibitor（4）为inhibitor control。

3上午八点对昨天晚上的细胞进行转染。

（1）a 用500 μl opti-MEM稀释20 μl mimics，作用5 minb 用500 μl opti-MEM稀释20 μl mimics control，作用5 minc 用500 μl opti-MEM稀释20 μl inhibitor，作用5 mind 用500 μl opti-MEM稀释20 μl inhibitor control，作用5 min（2）a 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 minb用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 minc 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 mind 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 min（3）分别将（1）、（2）对应的a、b、c、d混合，轻轻吹打均匀后室温作用20 min。