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293细胞培养293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5 E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系.它是加拿大McMaster University的F。
L.Graham与ey于1976年用DNA转染技术构建而成。
293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型,细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。
293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长,也可生长在血清浓度降低的培养基中。
单层培养细胞在5-10％FBS—DMEM中能生长很好。
一般来讲，1：10传代后,一周可以长满。
严禁过度生长，这点很重要。
因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散.悬浮的293细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293细胞培养特性：1、293细胞明显适应酸性环境，pH值在6。
9～7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基.2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0。
25％Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面，即将其吸除或弃去消化30s,然后吸去,再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s，镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化,反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
磷酸钙转染方法的优化程腾;李佳佳;贺小英;刘希宇;陈珊;李文达;马利兵【摘要】通过比较293T细胞的接种密度、质粒DNA的量以及 CO2浓度对磷酸钙转染方法的影响，确定最佳的转染条件。
以各单因素试验的最适条件为依据，设计三因素三水平的正交试验。
结果表明，磷酸钙介导质粒DNA转染，当293T细胞的接种密度为5×105/mL、质粒 DNA 的量为30μg、细胞培养环境 CO2浓度为3%时，转染效果最佳。
%In this study,the effects of seeding density of 293T cells,as well as the amount of plasmid DNA and the concentration of CO2 in culture environment,on the efficiency of calcium phosphate transfec—tion were compared,optimum transfection condition was confirmed.On the basis of optimum condition obtained from single factor experiments,orthogonal tests in three levels of three factors were designed and performed.The results showed that the highest transfection efficiency was obtained when the seeding den—sity of 293T cells was 5×105/mL,the amount of plasmid DNA was 30μg and the concentration of CO2 in culture environment was 3%.【期刊名称】《内蒙古师范大学学报（自然科学汉文版）》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】5页(P776-780)【关键词】磷酸钙;质粒DNA转染;293T细胞;接种密度【作者】程腾;李佳佳;贺小英;刘希宇;陈珊;李文达;马利兵【作者单位】内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010【正文语种】中文【中图分类】Q987.2近年来关于诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的研究[1-4]是生物技术研究领域的热点之一,在iPSCs的研究中,应用最多的载体是逆转录病毒载体和慢病毒载体,二者都能获得很高的诱导效率.将逆转录病毒载体和包装质粒一起转染到293T细胞后培养一段时间即可制备逆转录病毒颗粒.采用质粒DNA 转染293T细胞的方法有多种,应用较为广泛的有脂质体法、磷酸钙法、电穿孔法等.用以转染的脂质体多为商业化的脂质体,性质稳定,转染效率高,但价格昂贵.电穿孔法操作简单,但是需要对相应实验条件进行摸索,同时细胞在转染时的致死率大.磷酸钙应用成本低,对具体的体系加以优化后也能获得比较高的转染效率和病毒滴度.本实验采用磷酸钙转染的方法,从293T细胞的接种密度、质粒DNA的量及CO2浓度三方面进行研究,确定最佳的转染条件,以便为后续诱导人的iPS细胞进行准备.1.1 试剂和溶液试剂:胰蛋白酶、台盼蓝购于Amresco公司,EDTA,胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购于杭州四季青公司,DMEM(高糖)培养基购于Gibco公司,青霉素、链霉素购于华北制药,其余试剂均购于国药集团化学试剂有限公司,重组逆转录病毒载体p EYK-E4由内蒙古科技大学王建英教授惠赠,其病毒包装载体p LP1、p LP2、p LP/VSVG购于Invitrogen公司.溶液:D-Hanks液、胰蛋白酶消化液(0.25%胰蛋白酶、0.05%EDTA)、0.4%台盼蓝染液、含10%FBS的DMEM(高糖)培养液(青霉素100IU/m L、链霉素100μg/m L)、含不同浓度FBS的各种培养液、细胞冷冻液.除非特别说明,文中所用相应溶液的配制方法均参见文献[5].1.2 磷酸钙介导质粒DNA转染和包装病毒的生产、收集转染前24 h,通过胰酶消化收集对数期生长的293T细胞,以适宜的密度接种于100 mm培养皿.加入10 m L完全培养液,于5%CO2、饱和湿度、37℃的培养箱过夜培养细胞.取适量超螺旋质粒DNA溶于0.5 m L 0.25 mol/L CaCl2,混匀,然后将其加至0.5 m L 2×BES缓冲液中,室温下孵育10～20 min.重组逆转录病毒载体质粒和包装质粒的比为p EYK-E4∶p LP1∶p LP2∶p LP/VSVG=1∶0.45∶0.45∶0.8.滴加CaCl2-DNA-BBS溶液于细胞中,轻轻旋转以混匀.放入适宜CO2浓度、饱和湿度、37℃的培养箱中培养细胞12～16 h.吸去培养液,用培养液洗涤细胞2次.加10 m L新鲜的完全培养液.于5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱培养32～36 h.转染48 h后细胞培养液中已含有病毒,可以收集含病毒的培养液.1.3 转染条件的优化1.3.1 磷酸钙介导质粒DNA转染中293T细胞的接种密度对病毒包装效率的影响以5×104,1×105, 5×105,10×105,50×105个/m L将293T细胞接种于100 mm 培养皿中,每皿加10 m L细胞悬液,转染时质粒DNA量为30 g、CO2浓度为5%.转染后测定滴度,以确定转染时293T细胞的最优接种密度.1.3.2 磷酸钙介导质粒DNA转染中质粒DNA的量对病毒包装效率的影响采用1.3.1中所得的最佳接种密度,设置细胞培养环境CO2浓度为5%,质粒DNA的量为10,20,30,40,50μg,转染后测定滴度,以确定转染时质粒DNA的最佳用量.1.3.3 磷酸钙介导质粒DNA转染中细胞培养环境CO2浓度对病毒包装效率的影响采用上两步骤中所得的最佳接种密度和最佳质粒DNA的量.转染时细胞培养环境CO2浓度设置1%、2%、3%、4%、5%5个梯度.转染后测定滴度,确定转染时最优的细胞培养环境CO2浓度.1.3.4 磷酸钙介导的质粒DNA转染条件中影响病毒包装效率因素的正交实验根据最优条件设计三因素三水平的正交实验,以确定三因素中的主次关系及病毒包装的最优化转染条件.1.4 逆转录病毒颗粒滴度的测定将收集的含病毒的培养基,转入15 m L离心管中,4℃4 500 r/min离心5 min沉淀细胞碎片,吸取上清液,以0.45μm滤膜的滤器过滤上清液.取相应体积的液体进行病毒滴度的测定.其他的则以2 m L的量分装在冷冻管里,置于-80℃下保存备用.提前24 h在6孔板中接种293T细胞,每孔接种2×105个,培养过夜汇合度达到20%～50%.取病毒上清液分别加入新鲜的培养液稀释102、103、104、105、106倍,同时加入Polybrene浓缩液,使Polybrene浓度达到6μg/m L.移去孔中的培养基,以D-Hanks溶液冲洗两次后,每孔加入1 m L稀释液,并设置不加病毒上清液的空白对照孔.置于5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱中吸附5 h,移去培养液,加入10%FBS的DMEM (高糖)完全培养液,同时向全部的孔中加入博莱霉素浓缩液,终浓度为200μg/m L.每2～3 d换液一次,同时观察处理孔和对照孔的细胞状态,包括细胞死亡的状况和抗性集落的出现.第13 d对各孔中的集落数目进行计数.取数量适中且细胞集落比较清晰的孔的数据进行计算:病毒滴度(CFU/m L)=细胞集落个数×稀释倍数/加入的病毒液体积.2.1 293T细胞接种密度对病毒包装效率的影响以5×104,1×105,5×105,10×105, 50×105个/m L接种293T细胞,转染时质粒DNA量为30μg、细胞培养环境CO2浓度为5%,所获得的病毒的滴度如图1所示.由图1可知,293T细胞的接种密度对病毒包装效率具有一定影响.在接种密度达到5×105个/m L时,所获得的病毒的滴度是最大的,能达到6 500 CFU/m L;接种密度在1×105个/m L、10×105个/m L时,所获得的病毒的滴度分别为6 100 CFU/m L和5 900 CFU/m L,相比之下差异显著(P＞0.05);接种密度为5×104个/m L和50×105个/m L时,病毒的滴度不理想,只能达到4 700 CFU/m L和4 200 CFU/m L.因此在进行磷酸钙介导的质粒DNA转染时,293T细胞的接种密度以5×105个/m L为宜.2.2 质粒DNA的量对病毒包装效率的影响采用5×105个/m L的293T细胞接种密度,设置CO2浓度为5%,转染时质粒DNA的量设置为10, 20,30,40,50μg,转染后测定滴度,所获得的病毒的滴度如图2所示.由图2可知,质粒DNA用量从10μg到20μg,病毒滴度有上升的趋势,在20μg时病毒的滴度最大,为7 300 CFU/m L,而10μg时仅能达到5 900 CFU/m L,虽然质粒DNA量为30μg时病毒的滴度有所下降,但是也能达到6 900 CFU/m L,与前一个梯度差异不显著(P＞0.05).继续加大质粒DNA的量时,病毒的滴度呈现比较大幅度的下降.当质粒DNA量为40μg和50μg时,病毒的滴度分别为5 300 CFU/m L和5200 CFU/m L,二者差异不显著(P＞0.05),说明此时质粒DNA量并不再足以影响病毒的包装效率.因此质粒DNA的量在20μg时比较适宜.2.3 细胞培养环境CO2浓度对病毒包装效率的影响293T细胞的接种密度以5×105个/m L、质粒DNA的量为20μg,转染时细胞培养环境CO2浓度设置1%、2%、3%、4%及5%,转染后测定的病毒滴度,结果如图3所示.由图3可知,细胞培养环境CO2浓度对对病毒包装效率的影响是比较明显的,从1%到3%呈现快速上升的态势,在细胞培养环境CO2浓度为3%时,病毒的滴度达到了最大值,为1.46×104CFU/m L,随后细胞培养环境CO2浓度逐渐增高,所获得的病毒的滴度也在下降.细胞培养环境CO2浓度为1%时病毒滴度只能达到5 600 CFU/m L,为最低值;细胞培养环境CO2浓度为2%可达到9600 CFU/m L,低于细胞培养环境CO2浓度为4%时的1.20×104CFU/m L,但要比细胞培养环境CO2浓度为5%时的7000 CFU/m L要高.因此比较适宜的范围为2%～4%,本文选择3%为适宜条件.2.4 正交实验根据各单因素试验(293T细胞的接种密度、细胞培养环境CO2浓度、质粒DNA 的量)的最适条件为依据,设计三因素三水平的正交试验,见表1,所得结果如表2所示.由表2中的极差分析可知,影响病毒包装效率的磷酸钙介导质粒DNA转染三个因素的主次关系为B＞C＞A,即细胞培养环境CO2浓度＞质粒DNA的量＞293T细胞接种密度,最优水平的组合为A2B2C3,即转染的最佳条件为293T细胞的接种密度5×105个/m L、细胞培养环境CO2浓度3%、质粒DNA的量30μg.使用磷酸钙介导的质粒DNA转染293T细胞制备逆转录病毒颗粒时,最佳的条件为293T细胞的接种密度为5×105个/m L、细胞培养环境CO2浓度为3%、质粒DNA的量为30μg,此条件下可获得1.9×104CFU/ml的病毒滴度.本实验参照的是文献[6]中改进型的磷酸钙介导质粒DNA转染真核细胞的方法,这种方法相对于传统方法的效率要高出很多.本实验以转染中最为关键的影响因素对转染体系做了相应的优化.293T细胞是本次实验中所使用的包装细胞系.这种细胞是最适合磷酸钙法转染的细胞之一,在优化后的转染条件中能达到很高的病毒滴度.而293T细胞接种密度对本实验的影响不仅仅限于转染的进行,还包括病毒生产的过程.Kotani等[7]认为逆转录病毒的滴度和使用的包装细胞数量是相关的,而杨生玺等[8]的研究称逆转录病毒的滴度随包装细胞(PA317)密度上升而上升.但本实验使用的100 mm培养皿的最适的接种密度为5×105个/m L,细胞的接种密度过小或过大都会影响实验结果.低的接种密度在进行转染时,细胞的绝对数量达不到,相应的被转染的细胞数量也就少;由于293T细胞生长很迅速,当接种密度过大时,在进行转染时,细胞的汇合度就会很大,细胞的生长活动会受到抑制,同时293T细胞的贴壁性不强,汇合度大的细胞在转染和病毒制备的过程中会成片的浮起,极大影响病毒的制备.而且293T细胞的生长状态也很重要,进行转染和病毒生产的细胞一般都要是生长旺盛的细胞,而293T细胞汇合度很高时,其细胞的生长状态会受到抑制,长满后的细胞明显衰退,抑制了病毒的生产.有研究[9]使用无CO2和低温的环境来减缓已经长满后的细胞的衰退,从而提高病毒分泌效率.而本实验中,生长状态好的293T细胞接种24 h汇合度能达到50%左右,进行转染、病毒生产后,细胞则基本长满培养皿底部,细胞状态和数量均能达到最佳状态.质粒DNA的量会影响磷酸钙-DNA沉淀的性质.实验中只有质粒DNA量在20μg 和30μg时转染效率和病毒的包装效率比较高.DNA的量在实验中是以质粒DNA 的浓度来体现的,DNA最佳浓度的范围较窄,合适的DNA浓度形成的磷酸钙-DNA 沉淀会更易形成细致的沉淀,利于转染.同时质粒DNA的纯度、形式也会对转染效率有影响.由于细菌污染的抑制作用,不纯的质粒DNA转染的效率极低;线性质粒DNA转化效率的也是很低的,因为其与磷酸钙形成沉淀的速度慢,DNA与胞内核酸酶接触时间比较长[10-11].所以本实验中使用的质粒DNA都是使用高纯度质粒DNA提取试剂盒提取的,其的值都在1.8～1.9,经过电泳检测抽提到的质粒基本上都是超螺旋状态的.CO2浓度对病毒包装效率的影响是通过影响培养液p H环境而实现的.也有研究[9]使用了无CO2培养条件和32℃的低温,称获得的病毒滴度能提高10倍,而这种条件影响的不仅包括p H,还有细胞的生长状态,与普通的磷酸钙转染体系差别很大.一般细胞培养使用的培养液中都会有Na HCO3,通过HCO-3/CO2缓冲系统维持p H于7.2～7.4之间的稳定,而与之相配的CO2气体环境一般在5%才能补偿外溢的CO2,以防止其碱化.但磷酸钙-DNA沉淀形成的缓慢过程中,则需要微酸的p H,最佳的p H为6.96[6].所以2×BES的在配制的时候,p H值严格要求在6.96,然后就要采用适宜的CO2浓度来维持p H的稳定.从实验结果来看,1%CO2浓度则显然过低,其获得的病毒滴度也是最低的.最为常用的5%CO2浓度并不适合于磷酸钙介导的质粒DNA转染,其维持的培养液的p H相对来说还是偏碱性的.最适条件3%CO2浓度中所能获得病毒的滴度是5%CO2浓度环境中的2倍以上,低CO2浓度的培养,能显著的提高病毒的包装效率.本实验确定的最优化的转染条件所获得的病毒滴度是较高的,达到了1.9×104CFU/m L,并不低于其他报道[8,9,12-13]中逆转录病毒载体包装时所得到的病毒滴度.有研究称单个质粒转染的效率要高于多质粒共转染,采取单个质粒分批次转染的方式有时可以获取更高的病毒滴度.本实验采用的多质粒共转染的方式,这主要是因为单质粒分批转染时间长、操作环节多,加之293T细胞生长速度快、细胞贴壁性不好,转染操作也会对其造成损伤,使得后续质粒转染效果会受到影响,也易对细胞培养体系造成污染.【相关文献】[1] Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult 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大鼠Smad6慢病毒干扰载体的构建与鉴定林在俊;肖建如;罗剑;黄权;周振华;陈素;杨兴海;吴志鹏【摘要】目的构建大鼠Smad6基因的慢病毒干扰载体,并在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)中验证其基因沉默效率.方法针对大鼠Smad6基因设计、合成两对Smad6-shRNA干扰序列,并将其重组到pLKO.1质粒载体中.测序验证后在HEK293T细胞内组装慢病毒.最后体外分离培养大鼠BMSC,通过慢病毒感染将Smad6干扰序列转导到细胞内,实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)及Western蛋白印迹法检测其对Smad6基因的干扰效率.结果成功构建并包装2个大鼠Smad6基因干扰的慢病毒载体和慢病毒.与阴性对照组比较,重组慢病毒感染大鼠BMSC后经实时荧光定量PCR验证,2种重组病毒的干扰效率分别达到92.5％和93.4％,Western蛋白印迹法显示Smad6基因被干扰后蛋白表达明显下降.结论成功构建出可有效干扰大鼠Smad6基因的慢病毒载体,为进一步研究其功能及应用提供有效工具.%Objective To construct lentiviral RNA interference(RNAi) vectors of rat Smad6 gene and evaluate the effects of Smad6 gene silencing in rat bone mesenchymal stem cells(BMSCs). Methods Two pairs of Smad6-shRNA sequences were designed and synthesized toward rat Smad6 gene, and cloned into pLKO. 1 vector. They were verified by DNA sequencing and assembled in HEK293T cells. After transduced the Smad6 shRNA sequences into BMSCs in vitro, the expression of Smad6 was determined by real-time quantitative polymerase chain reaction(PCR) and Western Blot, respectively. Results Two lentiviral RNAi vectors of rat Smad6 gene were successfully designed and constructed. Compared to negative control, the silence effect of viruses with shRNA sequence were 92. 5% and93. 4% respectively, and the protein expression of Smad6 were also significantly decreased. Conclusions We had successfully constructed lentivial RNAi vectors of rats Smad6 gene, and provided an effective toolfor further study of the function and clinical application of Smad6 gene.【期刊名称】《国际骨科学杂志》【年(卷),期】2011(032)006【总页数】4页(P386-388,391)【关键词】Smad6基因;慢病毒;RNA干扰;基因重组;骨髓间充质干细胞【作者】林在俊;肖建如;罗剑;黄权;周振华;陈素;杨兴海;吴志鹏【作者单位】200003,上海长征医院骨肿瘤外科;200003,上海长征医院骨肿瘤外科;200241上海,华东师范大学生命医学研究所;200003,上海长征医院骨肿瘤外科;200003,上海长征医院骨肿瘤外科;200003,上海长征医院骨肿瘤外科;200003,上海长征医院骨肿瘤外科;200003,上海长征医院骨肿瘤外科【正文语种】中文骨髓间充质干细胞（BMSC）在向成骨细胞分化过程中受到多种细胞信号转导通路的调节，其中转化生长因子（TGF）－β／骨形态发生蛋白（BMP）信号通路最早发现，也是最重要的一条通路。
HEK293 PEAK瞬转快速表达抗体蛋白平台的建立颜为海;赵清霞;陈红岩【期刊名称】《安徽大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(038)002【摘要】This research established engineering cell line for transient transfection for antibody by adapting with Gibco ® FreeStyleTM 293 expression medium and limited dilution. The ratio of antibody plasmid and PEI( transfection reagent ) was optimized to be that the ratio of1:2(antibody plasmid: PEI) is the best result. The molecular weight of antibody expressed in HEK293 PEAK cells is about 150 kD, and the biological activity was similar to control antibody( Herceptin). In summary we successfully established the platform for rapidly expressing antibody in HEK293 PEAK cells cultured in serum-free medium.%将HEK293 PEAK细胞用Gibco FreeStyleTM 293表达培养液进行无血清悬浮驯化培养,获得无血清悬浮培养的HEK293 PEAK细胞,并经有限稀释法获得细胞亚克隆,建立抗体瞬转表达的工程细胞株。
用转染试剂PEI将质粒转入该细胞株中表达抗体。
Lipo293转染试剂是一种高效的转染试剂，特别适用于贴壁生长的HEK293、HEK293T、HEK293A、293FT等293系列细胞的转染。
以下是Lipo293转染试剂的使用说明书：适用范围：Lipo293转染试剂适用于贴壁生长的HEK293、HEK293T、HEK293A、293FT等293系列细胞的转染。
转染步骤：（1）准备转染试剂和DNA：按照推荐的DNA用量，将DNA溶解在无菌水中，然后与Lipo293转染试剂按照1:1的比例混合。
（2）细胞处理：将细胞按照推荐的培养条件在细胞培养箱中培养至适宜的密度。
（3）转染：将DNA-Lipo293复合物与细胞混合，并轻轻摇晃，使复合物均匀分布。
（4）培养：将转染后的细胞继续培养，期间注意观察细胞的生长状态。
注意事项：（1）使用高质量的DNA：为了获得最佳的转染效果，建议使用高质量的DNA。
（2）细胞密度和状态：转染前，细胞需要处于良好的生长状态，密度适宜。
（3）保存条件：Lipo293转染试剂应保存在4℃或-20℃的条件下，避免反复冻融。
（4）过敏反应：对于过敏体质的用户，建议在使用前进行皮肤过敏试验。
一种高效稳定的磷酸钙转染293T细胞方法的建立及评价华进;程志彬;林春霖;戴起宝;朱广伟【摘要】目的:探讨2种磷酸钙转染法转染293 T细胞的效果,建立一种实现高效稳定磷酸钙转染293 T细胞的方法.方法:荧光显微镜观察采用2种磷酸钙转染方法(传统磷酸钙转染法和改良磷酸钙转染法)转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞的转染效率.采用Real-time PCR法和Western blotting法分别检测2种磷酸钙转染方法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞后,肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)mRNA和flag蛋白表达水平.结果:荧光显微镜下观察,与传统磷酸钙转染法比较,改良磷酸钙转染法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞24和48 h后的转染效率明显升高(P<0.01);Real-time PCR法和Western blotting法检测,与传统转染方法比较,磷酸钙转染改良法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞24和48 h后,TRAF6 mRNA和flag蛋白表达水平均明显升高(P<0.01).结论:本研究建立的改良磷酸钙转染方法是一种高效、稳定的DNA转染方法.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2019(045)005【总页数】6页(P1177-1181,前插5)【关键词】磷酸钙转染;293T细胞;肿瘤坏死因子受体相关因子6;flag蛋白【作者】华进;程志彬;林春霖;戴起宝;朱广伟【作者单位】福建医科大学附属第一医院胃肠外科二区,福建福州 350005;福建医科大学附属第一医院胃肠外科二区,福建福州 350005;福建医科大学消化道恶性肿瘤教育部重点实验室,福建福州350005;福建医科大学附属第一医院胃肠外科二区,福建福州 350005;福建医科大学附属第一医院胃肠外科二区,福建福州 350005;福建医科大学附属第一医院胃肠外科二区,福建福州 350005;福建医科大学消化道恶性肿瘤教育部重点实验室,福建福州350005【正文语种】中文【中图分类】Q819目前，将质粒DNA导入动物细胞的方法有很多，最常用的方法包括脂质体转染、电转法、显微注射法和磷酸钙共沉淀法等[1]。
专利名称：一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用
专利类型：发明专利
发明人：陈泽建,周文婷,熊梓辰,吴珊珊,姜菊玲
申请号：CN202210356001.4
申请日：20220406
公开号：CN114591889A
公开日：
20220607
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用，为避免慢病毒生产细胞培养过程中使用成分不明的培养基组分和动物来源的生产物料，本悬浮驯化方法流程简便，驯化时间短，成本较低；采用无血清培养基成分明确，安全风险可控，减少了工艺杂质，质量控制相对简单；生产工艺易于放大，对人力耗费较低；经扩大培养驯化所得悬浮细胞建立悬浮细胞原始细胞库(PCB)、主细胞库(MCB)、工作细胞库(WCB)，使用该悬浮系统工作细胞库(WCB)应用于慢病毒制备与生产，慢病毒粗毒液产量至少可达1‑10*107TU/mL。
申请人：湖南远泰生物技术有限公司
地址：410221 湖南省长沙市长沙高新开发区林语路239号厂房202、302、501
国籍：CN
代理机构：长沙轩荣专利代理有限公司
代理人：张勇
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710602248.9(22)申请日 2017.07.21(71)申请人 上海恒润达生生物科技有限公司地址 201210 上海市浦东新区张江路1238弄恒越国际大厦1号楼9楼(72)发明人 黄飞 金涛 王海鹰 何凤 史子啸 (51)Int.Cl.C12N 5/073(2010.01)C12N 5/02(2006.01)(54)发明名称一种悬浮驯化293T细胞的方法(57)摘要本发明提供了一种制备低血清培养的悬浮293T细胞系的方法，该方法包括：(1)复苏并培养哺乳动物细胞，得到贴壁培养的该293T细胞，用胰酶消化；(2)用添加了一定量血清的无血清培养基培养该贴壁培养的293T细胞，连续培养该293T细胞至适应该添加了一定量血清的无血清培养基；以及(3)重复步骤(2)中的该连续培育程序，逐渐降低该无血清培养基中的血清添加量至血清浓度为0，得到该悬浮培养的293T细胞。
本发明操作简单，方便使用，费用低，安全性好。
293T 细胞悬浮培养的体外扩增培养方法无需特殊设备，操作简单可行。
293T细胞悬浮培养的基础研究及临床应用上将具有广泛的前景。
权利要求书2页 说明书4页 附图1页CN 109280636 A 2019.01.29C N 109280636A1.全悬浮培养型293T细胞系的驯化方法，其特征在于：步骤如下：(1)贴壁培养型293T细胞的培养选用经无菌、支原体、外源病毒检定为阴性，贴壁培养型293T细胞，待细胞生长致密单层后用含10％胎牛血清的DMEM培养液按1：3比例分瓶传代，置37℃5％CO2的培养箱培养，在48-72h内细胞形成致密单层，为边缘清晰的扁平上皮型细胞且细胞生长正常的情况下可用于驯化；(2)低血清贴壁培养型293T细胞系的驯化a)将步骤(1)所述生长正常的贴壁培养型293T细胞分别用含胎牛血清10％的DMEM培养液各培养三代；每次传代的标准是按1：4比例分瓶，在37℃5％CO2培养，在48-72h内细胞形成致密单层；b)将培养液换成Free style培养基后加10％胎牛血清继续培养三代，传代标准同步骤a)；c)培养液中胎牛血清降为5％，按b步骤中的方法，传代比例降为1：3再培养三代；d)培养液中胎牛牛血清降为2％，在培养液中再加体积百分含量20％上一代次培养了该细胞48-72h的培养液继续培养三代；传代标准同步骤c)；细胞在48h-72h内形成致密单层，驯化得到了低血清贴壁培养型293T细胞系；(3)低血清全悬浮培养型293T细胞的驯化a)将步骤(2)驯化的低血清贴壁培养型293T细胞，用Free style无血清培养基按体积比1：1比例混合后，加2％胎牛血清制成培养液，用培养液将细胞密度调整至2-5×105/ml，125r/min、37℃5％CO2摇床培养；b)重复步骤a)，每培养三代降低血清浓度，胎牛血清浓度依次从2％到1％到0.5％；b)每培养48h取样计数，细胞密度未达到1×106/ml时，800-1000r/min离心后换用新鲜培养液重新悬浮培养；细胞密度达到1×106/ml时，800-1000r/min离心按1：2比例分瓶培养；至细胞密度达到2×106/ml时，800-1000r/min离心按1：3比例分瓶培养；在连续三代按1：3比例培养48h细胞密度均达2×106/ml时，驯化得到低血清全悬浮培养型293T细胞系；(4)无血清全悬浮培养型293T细胞的驯化a)在无血清培养基中加0.2％胎牛血清，将步骤(3)中得到的低血清全悬浮培养型293T 细胞直接稀释到密度5×105/ml，置125r/min、37℃5％CO2摇床培养；b)每培养24h取样计数，细胞密度达到3×106/ml时，将细胞悬液直接稀释至5×105/ml 接种培养，血清降为0，完全用无血清培养培养，在连续三代培养48h细胞密度均达3×106/ ml时，驯化得到无血清全悬浮培养型293T细胞系。
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010716107.1(22)申请日 2020.07.23(71)申请人 上海奥浦迈生物科技有限公司地址 201321 上海市浦东新区紫萍路908弄28号(72)发明人 肖志华 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245代理人 陆惠中 王永伟(51)Int.Cl.C12N 5/071(2010.01)C12N 5/073(2010.01)C12P 21/00(2006.01)C07K 16/00(2006.01)(54)发明名称一种体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法(57)摘要本发明公开了一种体外培养HEK293用于瞬时表达蛋白的方法，包括如下步骤：S1：将冻存的HEK293细胞在原始培养基里复苏，培养箱中孵育；S2：将细胞接种到HEK293无血清培养基中进行培养；S3：传代操作；S4：再次传代操作；S5：准备转染质粒；S6：获取包括细胞密度和存活率的数据并稀释细胞；S7：稀释质粒DNA；S8：稀释转染试剂；S9：将稀释后的转染试剂加到稀释后的质粒DNA中，将混合物在室温下孵育；S10：将混合物缓慢添加至步骤S6的细胞中摇动；S11：放入培养箱培养，收获HEK293细胞和表达产物。
本发明可明显提高表达量，表达效率高，在更短的时间获得更多的蛋白。
权利要求书4页 说明书13页 附图2页CN 111826341 A 2020.10.27C N 111826341A1.一种体外培养HEK293细胞用于瞬时表达蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：S1：将冻存的HEK293细胞在原始培养基里复苏，将HEK293细胞在37℃培养箱中孵育；S2：当HEK293细胞活率≥95％且生长处于对数中期时，开始进行驯化；S3：每2-3天进行一次传代操作，以保持HEK293细胞处于早期对数生长期，细胞接种密度为0.3～0.6×106细胞/mL；S4：当细胞密度达到3～4×106细胞/mL且细胞活率≥95％，2～4天时，再次传代培养HEK293细胞；S5：细胞密度达到约3～4×106个活细胞/mL，活率≥95％时，准备转染质粒，转染前一天，将HEK293细胞按2～4×106细胞/mL的细胞密度接种，并使HEK293细胞生长过夜；S6：在第二天，即转染当天，获取包括细胞密度和存活率的数据，进行转染的HEK293细胞活率应≥95％，使用新鲜的培养基将HEK293细胞稀释至2～4×106细胞/mL；S7：稀释质粒DNA，通过旋转和/或翻转混匀；S8：将转染试剂充分混匀，并用培养基稀释转染试剂；S9：将稀释后的转染试剂加到稀释后的质粒DNA中，旋转和/或颠倒或轻轻吹打2-3次进行混合，将混合物在室温下孵育约20分钟；S10：将混合物缓慢添加至步骤S6的HEK293细胞中，在添加过程中轻轻摇动；S11：放回37℃培养箱中培养，在转染第二天，在瞬时表达过程中，维持葡萄糖浓度在4g/L以上，当细胞活率低于60％时收获HEK293细胞和表达产物。
