嗜酸乳杆菌的计数检验方法——指导
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嗜酸乳杆菌抑菌能力的试验【关键词】嗜酸乳杆菌;牛津杯法;抑菌圈;发酵液文章编号:issn1006—656x(2013)09 -0100-01【前言】嗜酸乳杆菌是人体肠道内的重要益生菌,能调节肠道微生态平衡,抑制病原微生物生长,缓解乳糖不耐症,降低胆固醇和抑制肠道腹泻等作用,被视为第三代酸乳发酵剂菌种[1]。
研究嗜酸乳杆菌对不同病原菌的抑菌效果、探讨其抑菌因素,对嗜酸乳杆菌产品的应用具有一定的意义。
一、材料与仪器(一)材料:(1)实验菌株:嗜酸乳杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、八叠球菌、枯草芽孢杆菌(实验室保存的菌株)(2)培养基:pca培养基、lb培养基、mrs培养基13%牛奶培养基(用脱脂乳粉配制成13%水溶液,115℃10min灭菌)(3)设备名称、型号、厂家yxq-ls-50sl型高压蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)pyx-dhs型隔水式点热恒温培养箱(上海市跃进医疗器械厂)jt-5003型精密电子天平(深圳市华恒仪器有限公司)微生物实验常规玻璃仪器(二)实验方法(1)嗜酸乳杆菌发酵菌悬液、发酵液抑菌效果试验将加有溴钾酚紫指示剂的pca培养基分装于试管中,每管约15ml,可确保每个平板的营养成分基本相同,添加指示剂有利于观察抑菌圈,然后于121℃灭菌20min。
分别吸取1ml指示菌的10-1稀释液于冷却至45-50℃培养基中,这一稀释度生长的菌落能够均匀的布满整个平板,确保实验的准确度,混匀后倒入9cm的灭菌平板中。
培养基凝固后,在无菌条件下将3个灭菌的牛津杯均匀地放置在平板上,轻轻按压,使其与平板培养基接触面无空隙。
在3个杯中分别加入0.1ml的嗜酸乳杆菌菌悬液、嗜酸乳杆菌培养上清液、mrs 液体培养基,37℃培养24h,测定抑菌圈直径。
每个样品做两个重复,结果取平均值。
(2)牛奶发酵物抑菌效果试验13%牛奶培养基,115℃10min灭菌,冷却40℃左右,按5%的接种量接入嗜酸乳杆菌菌种,42℃恒温培养约4h至牛奶凝固,即牛奶发酵物。
活性酸乳中每种益生菌总数的同时计数法
辛若竹;丁梅;孟宪志;孙健
【期刊名称】《食品科学》
【年(卷),期】2008(029)004
【摘要】益生菌酸奶的营养作用和保健功能决定于成品中必须含有一定数量级的活性益生菌数.本实验通过研究分析活性酸奶中嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌(LGG菌)、干酪乳杆菌等乳酸菌在BBL.平板培养基上的菌落特征及菌体形态,提出了一种可同时准确计数每种益生菌总数的新方法,该方法可直观地观察到各种益生菌的生长活度,免除了传统方法计数不同益生菌总数要用不同培养基的繁琐,为快速鉴定益生菌酸奶品质好坏和保健功能活性高低提供了检测依据.
【总页数】5页(P244-248)
【作者】辛若竹;丁梅;孟宪志;孙健
【作者单位】梅河口市产品商品质量监督检验所,吉林梅河口,135000;梅河口市产品商品质量监督检验所,吉林梅河口,135000;梅河口市产品商品质量监督检验所,吉林梅河口,135000;梅河口市产品商品质量监督检验所,吉林梅河口,135000
【正文语种】中文
【中图分类】Q949.3
【相关文献】
1.腐乳中低聚肽氨基酸组成及抗氧化活性研究 [J], 唐杰
2.功能性酸乳中每种益生菌的单独计数方法及其混合发酵工艺的研究 [J], 辛若竹;丁梅
3.Soleris微生物实时光电法与平板计数法测定\r生乳中菌落总数的比较研究 [J], 陈美莲;章慧;王仕英
4.澳大利亚研究冷藏对添加菠萝皮酸乳中益生菌活性及抗突变抗氧化肽生成与稳定性的影响 [J],
5.活性酸乳中乳酸菌的直接镜检计数法 [J], 辛若竹;刘洋来;魏昆民
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酸乳杆菌的生物学论文1方法1.1生长曲线的测定嗜酸乳杆菌AP117经活化后,以5%的接种量接种到MRS液体培养基中,30益静置培养24h,每隔2h取样,稀释涂布MRS固体培养基平板,培养20~24h后数活菌数,每毫升的细菌菌落数以对数值表示。
1.2耐酸能力的测定将嗜酸乳杆菌AP117经MRS液体培养基活化后,按5%接种量接种于MRS液体培养基,30益培养16h备用。
用0.1mol/L的HCl分别调节MRS液体培养基pH为1.5、2.0、3.0、4.0和4.5。
取16hAP117培养液,按5%接种量接种于不同pH的液体培养基中,30益培养2h,采用倾注平板法,以MRS固体培养基作为计数培养基,测定培养液的活菌数,平行测定3次,取平均值,以刚接种时的活菌数为对照,计算菌株在不同酸性条件下处理2h后的存活率。
1.3耐胆盐能力的测定将嗜酸乳杆菌AP117经MRS液体培养基活化后,按5%接种量接种于MRS液体培养基,30益培养16h备用。
用猪胆盐分别调节MRS液体培养基,使胆盐含量分别为0.1%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%。
取16h培养液按5%接种量接种于不同胆盐含量的液体培养基中,30益培养2h,采用倾注平板法,以MRS固体培养基作为计数培养基,测定培养液的活菌数,平行测定3次,取平均值,以刚接种时的活菌数为对照,计算在不同胆盐条件下处理2h后的菌株存活率。
2结果与讨论2.1嗜酸乳杆菌AP117的生长动态曲线嗜酸乳杆菌AP117在温度30益,静置培养24h,其活菌数的对数值随时间变化关系如图1。
由图1看出培养6h后活菌浓度达到105cfu/mL,之后进入对数生长期,14~20h 为稳定期,活菌浓度超过1010cfu/mL。
2.2嗜酸乳杆菌AP117的耐酸性乳酸菌可以利用的耐酸性机制有许多种,目前没有统一定论,大体上可以分成8类:质子泵、蛋白质修复、DNA修复、调节因子、细胞密度的改变、细胞膜的改变、产生碱和代谢方式的改变,其耐酸性机制因菌株不同而有差异。
嗜酸乳杆菌的测定方法1.仪器及器皿THZ-C恒温震荡器,LRH-250生化培养箱,LDZX-50FB立式电热压力蒸汽灭菌器,SW-CJ-1F洁净工作台,百分之一电子天平,生物显微镜, 18×150试管,90mm培养皿,500ml三角瓶,10ml刻度吸管,1ml移液枪,吸耳球,玻璃珠(直径4-6mm),pH 试纸(5.5-9.0)2. 试剂氯化钠(分析纯),葡萄糖(分析纯),蛋白胨(生化试剂),牛肉浸膏(生化试剂),柠檬酸铵、磷酸氢二钾、酵母膏、乙酸钠、硫酸镁、硫酸锰、吐温-80、进口琼脂等3.具体步骤3.1 准备工作3.1.1 MRS琼脂培养基的配制及灭菌:葡萄糖20g、柠檬酸铵2g、乙酸钠5g、磷酸氢二钾5g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.2g、牛肉膏10g、酵母膏5g、蛋白胨10g、吐温-80 1g、琼脂16g、水1000mL 、pH5.5-6.0,118℃灭菌30min。
3.1.2 其他物品的包装及灭菌:500ml三角瓶、培养皿、1ml移液枪、10ml刻度吸管、玻璃珠、18×1500试管等用牛皮纸包裹好,0.85%生理盐水置于1000ml三角瓶和250ml三角瓶,1ml枪头盒(内置枪头)、灭菌器121℃30分钟。
3.1.3 洁净工作台的准备:操作前将所需物品置于台面,紫外线灭菌30分钟再进行操作。
3.2 样品制备采样应不少于500克,采用称量纸称取25.00克(精确到0.01g),倾入已加入灭菌玻璃珠的干燥已灭菌500ml三角瓶中,用100ml量筒量取先100ml已灭菌的生理盐水沿瓶壁倾入500ml三角瓶,摇匀,约2分钟,再量取125ml已灭菌的生理盐水沿瓶壁倾入500ml三角瓶,然后包裹起来于旋转式摇床上200r/min充分振荡30min,即成母液的菌悬液。
3.3 样品处理(1)用移液枪取1ml上述母液的菌悬液加入盛有9ml无菌水的试管中,混匀成1:102稀释的菌悬液,这样依次稀释,分别得到1:103、1:104……1:107等浓度(每个稀释度必须更换无菌吸管)。
嗜酸乳杆菌的检测计数方法所用方法:下列方法适用于在浓缩的或标准化的益生菌混合粉末中嗜酸乳杆菌的计数。
参考文献:1.乳制品检验的标准方法。
16 版, 1992 第6章 (微生物计数法) P213 - 246.2.下列方法参考了“由美国营养食品协会1992年9月推荐的国际乳品标准测试方法 (方法号为117A:1988 )”操作步骤:1.无菌称取 11.0 g 冷冻干燥的NCFM菌种片,粉末或混合粉末加入一无菌袋.2.无菌称取 99 ml 经灭菌的室温的MRS培养基,加入上述菌种粉末的无菌袋。
.3.将无菌袋轻轻震荡充分混和2分钟4.将其在室温下放置30分钟,使经冷冻干燥的菌种重新水合。
5.再次将无菌袋轻轻震荡充分混和2分钟。
6.用0.1 % 蛋白胨溶液作空白,按下列方法进行系列稀释:从上述袋中吸取 1.0ml 菌种溶液加入99 mls 蛋白胨溶液,得到 10-3的稀释液.重复上述操作得到适宜的稀释液。
按照上述文献中的标准方法轻轻振荡。
7.每一样品重复三个操作:用 1.0 ml 无菌移液管将上述稀释液加入贴有标签的无菌陪替氏培养皿中。
8. 将装有已灭菌的Difco MRS琼脂培养基的小瓶在100︒C加热30分钟融化,然后放入45︒C水浴中保温在45︒C,将瓶浸入500 PPM氯水溶液(每天新鲜制备), 或在火焰上消毒.9. 以下操作在超净工作台下进行:每 100 ml Difco MRS 琼脂培养基中加入 1.0 ml 经灭菌的 5 % 盐酸半胱氨酸溶液,使得最后MRS 琼脂培养基中盐酸半胱氨酸的浓度为 0.05 %.10. 将上述含0.05 %盐酸半胱氨酸的MRS琼脂培养基约15 mls加到已稀释好的培养皿中,轻轻旋转培养皿使其混合均匀,放置在温度较低的表面上使其在室温下固化。
11. 将培养皿在 38︒C 厌氧培养 (H2 / CO2加入 BBL 厌氧缸) 72 小时.计数:在含0.05 %盐酸半胱氨酸的 MRS琼脂培养基中数出菌落总数。
专利名称:一种肠道嗜酸乳杆菌的检测方法和试剂专利类型:发明专利
发明人:魏宏泉,肖宏,孙相鑫,蓝丽,姜骏飞
申请号:CN202010963572.5
申请日:20200914
公开号:CN112029879A
公开日:
20201204
专利内容由知识产权出版社提供
摘要:本申请公开了一种肠道嗜酸乳杆菌的检测方法和试剂。
本申请的肠道嗜酸乳杆菌的检测方法,包括获取待测对象的粪便样品,提取粪便样品的核酸样本,采用嗜酸乳杆菌特异性的PCR扩增检测核酸样本,通过检测粪便样品中的嗜酸乳杆菌表征肠道嗜酸乳杆菌。
本申请的肠道嗜酸乳杆菌检测方法,采用粪便样品的核酸样本的嗜酸乳杆菌特异性PCR扩增检测结果表征肠道嗜酸乳杆菌,为基于肠道嗜酸乳杆菌的肠道菌群结构分析、临床检验指导和用药、肠道菌群动态平衡研究、预防疾病等提供了一种新的方案和途径。
申请人:壹宏(深圳)基因有限公司
地址:518000 广东省深圳市龙岗区葵涌街道三溪社区金业大道140号生命科学产业园A11栋306国籍:CN
代理机构:深圳鼎合诚知识产权代理有限公司
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嗜酸乳杆菌的检测1、设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下。
1.1恒温厌氧培养箱:37℃士1℃。
1.2冰箱:2℃~5℃。
1.3天平:感量为0.1g。
1.4均质器及无菌均质袋、均质杯。
1.5振荡器。
1.6无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
1.7无菌锥形瓶:容量250mL、500mL。
1.8无菌培养皿:直径90mm。
1.9显微镜:10倍~100倍。
1.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2、培养基和试剂2.1 MRS(Man Rogosa Sharpe)琼脂培养基2.1.1 MRS(Man Rogosa Sharpe)琼脂培养基成分蛋白胨10.0g 牛肉膏10.0g 酵母浸膏5.0g 葡萄糖20.0g吐温-80 1.0g 柠檬酸铵2.0g 乙酸钠5.0g 硫酸镁0.1g硫酸锰0.05g 磷酸氢二钾2.0g 琼脂15.0g 蒸馏水1000mL2.1.2制法将上述成分加于蒸馏水中,煮沸溶解,补足蒸馏水至1000mL,于25℃时调节pH 至7.3±0.2,分装于适宜容器中,121℃灭菌30min。
2.2 MRS肉汤培养基2.2.1 MRS肉汤培养基成分蛋白胨10.0g 牛肉膏10.0g 酵母浸膏5.0g 葡萄糖20.0g吐温-80 1.0g 柠檬酸铵2.0g 乙酸钠5.0g 硫酸镁0.1g硫酸锰0.05g 磷酸氢二钾2.0g 蒸馏水1000mL2.2.2制法将上述成分加于蒸馏水中,煮沸溶解,补足蒸馏水至1000mL,于25℃时调节pH 至7.3±0.2,分装于适宜容器中,121℃灭菌30min。
2.3无菌生理盐水2.3.1成分氯化钠8.5g 蒸馏水1000mL2.3.2制法称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。
2.4 革兰氏染色2.4.1结晶紫染色液2.4.1.1 成分结晶紫1g 95%乙醇20 mL 1%草酸铵水溶液80 mL2.4.1.2制法将结晶紫溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
|组稿\Email:*******************I科学研究饲料中嗜酸乳杆菌菌落计数方法的建立张玲!,毛伟",杨晓培#(1.湖北省武汉市黄陂区农业综合执法大队,湖北武汉430000;2.湖北省武汉市黄陂区动物疫病预防控制中心,湖北武汉430000;3.湖北省武汉市动物疫病预防控制中心,湖北武汉430000)摘要:本试验选取嗜酸乳杆菌,将嗜酸乳杆菌的菌液混入饲料中,并分别对加入菌液前后的饲料进行菌落总数的测定,用倾注法在改良TJA、改良MC和MRS三种培养基上进行菌落计数(试验结果表明,平板计数法用于嗜酸杆菌的菌落计数,且在改良TJA上生长的菌落更接近于真实值。
关键词:嗜酸乳杆菌;菌落计数;倾注法中图分类号:S816文献标识码:A文章顺序编号:1005-5959(2020)07-006-02乳酸菌是在葡萄糖(乳糖)的发酵过程中产生乳酸的益生菌。
是相当庞杂的细菌,目前至少可分为18个属,是与人类生活息息相关的有益微生物仏2%乳酸菌革兰氏染色呈阳性,细胞形态为杆菌或球菌,不形成内生抱子,在固体培养基上菌落较小、生长缓慢叫乳酸菌广泛分布于自然界中,是人和动物的胃及小中的菌,少有菌叫益生菌于饲料中问。
乳酸菌为是的菌,也是具代表性的内益生菌叫本试验将嗜酸乳杆菌的菌混入饲料中,并分加入菌前后的饲料进行菌落数的,法在TJA、MC和MRS培养基上菌落计数。
1材料与方法1.1供试菌为嗜酸乳杆菌1.2饲料1料为泌乳奶牛浓缩料,2号料为泌乳奶牛精补料。
1.3培养基TJA培养基、MC培养基和MRS培养基。
1.4主要试剂和器材、微、菌、、箱和生培养。
2试验方法2.1嗜酸乳杆菌的纯化将嗜酸乳杆菌于乳培养基,于37!内有培养48h,然于MRS固体培养基%在37!内有培养48h后挑取单个可菌落于MRS培养基上。
于37!内有培养48h、染色、,培养物%2.2嗜酸乳杆菌在改良TJA、改良MC和MRS培养基上的生长特性作者简介:张玲(1988-),女,硕士研究生,助理兽医师,主要从事畜牧兽医监督执法和检测工作#将嗜酸乳杆菌于TJA、MC和MRS培养基,于37!内有氧培养48h,菌落形态%2.3嗜酸乳杆菌的扩增及菌液浓度的调整将嗜酸乳杆菌MRS体培养基内,于37!内有氧培养48h后,置于4!内%的菌10,法为198/mL的菌%2.4饲料中嗜酸乳杆菌的添加将饲料2,每份2.5?,研,中1:10的,于中乳酸菌菌落数的%在饲料中嗜酸乳杆菌菌1 mL,为198/mL%3结果3.1嗜酸乳杆菌涂片、染色、镜检结果的嗜酸乳杆菌、染色、,可,多数在,偶尔有2~3个连在一起的革兰氏阳性短杆菌%3.2本底饲料乳酸菌菌落计数结果对1号料和2号料选取10-5和10"作为稀释度,并分于30!'37!、42!内培养24h,隔6h开展菌落计数%结果表1、表2、表3% 3.3添加嗜酸乳杆菌的饲料中乳酸菌菌落计数结果选取平板长出菌落为30~300的计数%1料和2料选取了10-2、10-3为,并置于30!、37!、42!三个内培养24h后隔6h开展菌落计数%结果表4、表5、表6%4结论试验结果表明,1和2本底饲料中的乳酸菌在TJA培养基与MC培养基中生长,相较差的是MRS培养基%1号加菌饲料和2号加菌饲料在30!、37!的内于TJA培养基和MRS培养基中生长良好,相较差的是MC培养基%在42!内于TJA培养基与MC培养基中生长,相对较差的是6!代#禽%殖业•2020-07科学研究I组稿\Email:nmgxmy2008@■表130!原饲料中乳酸菌菌落计数结果(菌落数单位:万个)1#饲料MC1#饲料TJA1#饲料MRS2#饲料MC2#TJA2#MRS24h0.1470560.0430h0.19565039536h0.2753553555542h33955550.11 83750.4156575表237!本底饲料中乳酸菌菌落计数结果(菌落数单位:万个)1#饲料MC A RS22A2RS 24h0.180.1950.030.240.30.2430h0.6750.350.1350.420.3850.3036h0.750.5250.1350.4850.4350.3442h0.7650.7250.150.5950.490.400 48h0.90.980.70.80.780.74表342!本底饲料中乳酸菌菌落计数结果(菌落数单位:万个)1#饲料MC1#饲料TJA1#饲料MRS2#饲料MC2#饲料TJA2#饲料MRS24h0.330.2550.060.3550.4750.26530h0.4050.3950.0750.4650.49590.35536h0.580.470.220.4850.520.40542h0.5650.930.4050.715 1.110.6848h0.79 1.0850.590.765 1.80.725表430!下添加嗜酸乳杆菌的饲料中乳酸菌菌落计数结果(菌落数单位:万个)l#c MC l#c TJA RS222RS 24h68.5890905575530h20595925526536h5845003900510004542h9757500445055548548h17574563252452表537!下添加嗜酸乳杆菌的饲料中乳酸菌菌落计数结果(菌落数单位:万个)l#c MC l#c TJA RS222RS24h55025005005035000030h650350029003002000225036h18507400670022005650540042h45508600745034505900570048h50506507450370059505800表642!下添加嗜酸乳杆菌的饲料中乳酸菌菌落计数结果(菌落数单位:万个)l#c MC l#c TJA RS222RS24h16500850320005080020030h005003250275025085036h27005650530034506650470042h59005700535039506850495048h6506505450670072005500MRS培养基!通过比较可知,嗜酸乳酸菌比较适合在TJA培养基和MRS培养基中生长°在三种温度下,乳酸菌于37!时生长最好,由此可知37!为乳酸菌的最适生长温度°参考文献:[1]周雨霞,孟和毕力格•内蒙古不同地区、不同畜种乳及乳制品中乳杆菌属细菌的分布[J].中国乳品工业,2004,32(11):3-5. [2]杨洁彬•乳酸菌生物学基础及应用[M],北京:中国轻工业出版社,1994:162.⑶凌代文•乳酸菌分类鉴定及实验方法[M],北京:中国轻工业出版社,1999:85-86.[4]金世琳•乳酸菌的科学与技术[J].中国乳品工业,1998,26(2):14-15.⑸沈通一•益生菌对肠微生物生态学影响的研究进展[J],肠外与肠内营养,2((4,11(04):242—246.⑹郭兴华.益生菌基础与应用[M],北京:科学技术出版社,2((2,125-154.[7]赵红霞,詹勇,徐梓荣,等•乳酸菌的研究及其应用[J].江西饲,2((3((1):9-12.[8]GB/T4789.2-2008食5卫生微生物学检验菌落总数测定.[9]GB/T4789.35-2008食5卫生微生物学检验食5中乳酸菌验.2020-07-!代#禽%殖业7。
附录 A(规范性附录)枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌的计数和杂菌率的测定A.1 原理每个活菌在适宜的培养基和良好的生长条件下,经过合适的培养时间可繁殖成一个肉眼可见的菌落,通过对菌落数量的统计,便可计算出相应样品的单位活菌数。
A.2 培养基除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T 6682规定的三级水或相当纯度的水。
按本标准规定的方法配制培养基或购买商品化的产品。
A.2.1 枯草芽孢杆菌培养基A.2.1.1 成分营养琼脂 33g;蒸馏水 1000mL。
A.2.1.2 制法将33g营养琼脂溶解于蒸馏水中,定容至1000mL;121℃灭菌20min。
A.2.2 酿酒酵母菌培养基A.2.2.1 成分孟加拉红培养基 36.6g;蒸馏水 1000mL。
A.2.2.2 制法将36.6g孟加拉红培养基溶解于蒸馏水中,定容至1000mL;121℃灭菌20min。
A.2.3 植物乳杆菌培养基A.2.3.1 成分蛋白胨 10g;牛肉膏 10g;酵母提取物 5g;磷酸氢二钾 2g;柠檬酸三铵 2g;乙酸钠 5g;葡萄糖 20g;吐温-80 1mL;七水硫酸镁 0.58g;四水硫酸锰 0.25g;琼脂粉 20g;灭菌碳酸钙 3g;蒸馏水 1000mL。
A.2.3.2 制法将上述试剂依次溶解于蒸馏水中,七水硫酸镁和四水硫酸锰单独用蒸馏水溶解后混入前述溶液中,最后加入琼脂粉,定容至1000mL;121℃灭菌20min。
A.2.4 麦康凯培养基A.2.4.1 成分蛋白胨 17g;脙胨 3g;猪胆盐(或牛、羊胆盐) 5g;氯化钠 5g;琼脂 17g;蒸馏水 1000mL;0.01%结晶紫水溶液 10mL;0.5%中性红水溶液 5mL。
A.2.4.2 制法A.将蛋白胨、脙胨、胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中,校正pH7.2。
将琼脂加入600mL蒸馏水中,加热溶解。
将两液合并,分装于烧瓶内,121℃高压灭菌15min备用。
TTC 在嗜酸乳杆菌菌落计数中的应用韩 迪, 吕嘉枥(陕西科技大学生命科学与工程学院, 咸阳 712081)摘要: 对TTC 用于嗜酸乳杆菌菌落计数的可行性进行了探讨。
结果表明, 当TTC 的最终浓度为0.1~0.2mg/mL 时菌落正常生长, 而且显色效果明显。
说明TTC 可应用于嗜酸乳杆菌的计数。
用TTC 进行培 养时间的试验。
结果, 嗜酸乳杆菌在TTC - MRS 中培养36h 后, 就能有效地进行菌落计数。
这与用普通 的MRS 琼脂计数相比, 时间大大缩短。
关键词: TTC; 嗜酸乳杆菌; 菌落计数 中图分类号: TS201.3 文献标识码: A 文章编号: 1005- 9989(2007)04- 0208- 03Applica tion of TTC for col ony e nume ra ti on ofLa ctoba cillus a cidophilusHAN Di, LV J i a- li(Co lle ge of Li fe S c ie nc e & E ng ine e ri ng, S ha a nxi Un ive rs ityof S c ie nc e & Te chnol ogy, Xia n ya ng 712081)Abst r a ct : The p a p e r a n a lys e d the p os s i bility of us i n g TTC for colony e n um e ra t ion of L.a cido ph ilus . The re s u lts s h o we d wh e n the ultim a te co n c e ntra tion of TTC wa s 0 .1 ~0 .2m g /mL,The L.a cidop hilus could norm a l growth , a nd the e ffe ct of color de ve lop m e nt wa s vis ib le . It m e a ns th a t TTC c a n be u s e d for colony e nu m e r a t i o n of L . a cido ph ilus . E xp e rim e nt for culture time wa s pro c e s s e d by TTC. The re s ult wa s : wh e n culture 36h i n TTC - MRS a g a r , the colony could e n um e ra t e e ffe ctive ly. It wa s fa s t e r th a n u s ing MRS a g a r . Key wor d s: TTC; La cto b a c illus a cido ph ilus ; colony e n u m e ra t ion嗜酸乳杆菌(L actobacillus acidophilus)是人体肠道 计数方面的报道极少。
本指导方法介绍了科汉森嗜酸乳杆菌LA-5使用的培养基及计数方法。
本方法适用于发酵乳中单株LA-5或混合菌株中LA-5的计数。
本方法基于国际标准ISO 20128/IDF192建立,但仅适用于用在检测发酵乳制品中的菌种组合。
嗜酸乳杆菌
单一菌株 培养基 MRS 琼脂培养基
技术 倾注平皿或平板涂布
厌氧培养,37°C (99°F), 3天
注释 嗜酸乳杆菌菌落形态单一,暗淡,粗糙,灰白色,有不规则边缘。
根据菌落数的多少,
直径在1mm ~3mm 之间。
嗜酸乳杆菌
在 AB ,ABT ,ABY 中,或与中温菌混合。
培养基 MRS 琼脂培养基,每升培养基中添加0.5ml 氯林可霉素储备溶液
技术 倾注平皿
厌氧培养,37°C (99°F), 3天
注释 氯林可霉素能够抑制大多数乳酸菌,不能抑制类干酪乳杆菌类干酪亚种。
所有的菌落均
计为嗜酸乳杆菌。
嗜酸乳杆菌
与AC ,ABC 或ABYC 混合。
培养基 MRS 琼脂培养基,每升培养基中添加0.5ml 氯林可霉素储备溶液和5ml 环丙沙星储备溶
液。
技术 倾注平皿
厌氧培养,43°C (109°F), 3天
注释 氯林可霉素与环丙沙星的组合能够抑制大多数乳酸菌。
所有菌落均计为嗜酸乳杆菌。
通常,我们始终建议使用显微镜镜检几个菌落,以确认是正确的菌株。
准备培养基及储备准备培养基及储备溶液溶液
准备MRS 培养基培养基::
溶解70g MRS 琼脂粉( Difico 288210 )到1000ml 蒸馏水中,加热至沸腾并不断搅拌直至完全溶解。
分装培养基至瓶中,用121℃(250℉),15 min 高压杀菌。
高压杀菌后pH 值:6.5+/-0.2,25℃.
准备好的MRS琼脂培养基可以在5+/-3℃的黑暗条件下储藏三个月。
倾注好的培养基平板可以在5+/-3℃的黑暗条件下储藏10天。
准备氯林可霉素储备准备氯林可霉素储备溶液溶液溶液::
盐酸氯林可霉素 2mg (Sigma C5269)
蒸馏水定容至 10ml
过滤器除菌 (0.22 μm)
如果溶液不能立即用完,建议将溶液分装到灭菌冷冻管中,冻藏在-20℃,冷冻溶液可以储藏6周。
准备环丙沙星储备溶液准备环丙沙星储备溶液::
盐酸环丙沙星 20mg (BAYER 02838560)
蒸馏水定容至 10ml
过滤器除菌 (0.22 μm)
如果溶液不能立即用完,建议将溶液分装到灭菌冷冻管中,冬藏在-20℃,冷冻溶液可以储藏8周.
注意注意::当向琼脂培养基中添加了不同溶液之后,应立即将培养基用完。
缩写词缩写词::
A:嗜酸乳杆菌
B:双歧杆菌
C:类干酪乳杆菌类干酪亚种
T:嗜热链球菌
Y:由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组成的酸奶菌种。
注意注意::
由于发酵乳种类的多样性,本方法也许不能适用于某种产品的每一个细节。
例如当嗜酸乳杆菌的数量远远低于其它微生物的数量,比如鼠李糖乳杆菌,路氏乳杆菌,植物乳杆菌,瑞士乳杆菌,类干酪乳杆菌类干酪亚种,酵母。
此外,嗜酸乳杆菌与约翰逊乳杆菌,加氏乳杆菌,卷曲乳杆菌非常接近,本方法无法区分这四种细菌。
LA-5 在 AC 或 ACT 混合菌种中
对嗜酸乳杆菌L. acidophilus LA-5 在混合菌种中的计数,我们推荐使用MRS-im + 麦芽糖并在有氧的条件下进行培养。
但干酪乳杆菌, L. casei LC-01 会在此条件下同时出现在培养基上,但菌落能够从培养基上进行分辩。
(图 1)。
我们推荐在显微镜下进行菌株的验证和鉴定。
在琼脂培养基上,LC-01的菌落比LA-5 的菌落大而且边缘规则,而LA-5在MRS-im + 麦芽糖的培养基上呈现不规则的形状。
图 1. L. casei (LC-01) 在 MRS-im + 麦芽糖比 LA-5的菌落大而且规则
参看放大的小图片。
,参看放大的小图片
的菌落大而且规则,
在显微镜下, LA-5 的形状是长的杆装,见图2。
LC-01 短而且较厚。
(图 3)。
种中
混合菌种中
LA-5 在 AY 或 ABY 混合菌
在某些情况下L. bulgaricus 在MRS-im + 麦芽糖培养基上也能生长,但大多数情况下菌落要比LA-5小,能够与LA-5的菌落区分开。
显微镜下L. bulgaricus 的形状与LA-5非常相似(图 4)。