加强Psy基因表达和通过RNAi抑制Lcy基因表达的载体构建

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202111535765.1(22)申请日 2021.12.15(71)申请人 徐州市中心医院地址 221000 江苏省徐州市解放路199号(72)发明人 孟箭　周霖　李欣然　顾徐嘉　陈霖　(74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限公司 32200专利代理师 曹翠珍(51)Int.Cl.C12N 15/113(2010.01)C12N 15/867(2006.01)A61K 31/713(2006.01)A61P 1/02(2006.01)A61P 25/00(2006.01)(54)发明名称一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用(57)摘要本发明公开了一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用，通过RNA干扰靶点设计及双链DNA oligo制备，将双链DNA oligo与线性化的载体相连，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞进行阳性克隆，构建短发夹RNA慢病毒载体，敲低TSCC内源性PXYLP1基因的表达，抑制了TSCC细胞的增殖能力，诱导了TSCC细胞的凋亡，从而抑制体内肿瘤生长。

权利要求书1页 说明书10页序列表1页 附图9页CN 114457075 A 2022.05.10C N 114457075A1.一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA包括DNA oligo的正链和反链，所述正链为序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，所述反链为序列表SEQ ID NO.2所示的碱基序列，所述的正链和反链退火，形成带粘性末端的双链DNA：SEQ 1：5’‑CCGGCCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGGTTTTTG ‑3’SEQ 2：5’‑AATTCAAAAACCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGG ‑3’。

基因表达与调控实验基因表达与调控是生物学研究中的重要课题之一。

通过实验方法来研究基因的表达和调控机制，有助于深入了解生物体内基因功能的调节网络。

本文将介绍几种常见的基因表达与调控实验方法。

一、RNA干扰实验RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是通过利用双链RNA 抑制特定基因的表达的一种方法。

研究者可以合成特定基因的小干扰RNA（siRNA），将其转染到细胞中，从而降低或抑制目标基因的表达。

通过RNA干扰实验，可以研究目标基因的功能以及该基因对生物体内其他基因表达的调控作用。

二、转录组学研究转录组学是研究细胞或组织中所有转录产物（RNA）的总和，包括mRNA和非编码RNA。

通过高通量测序技术，可以获取细胞或组织中所有转录产物的信息，进而分析基因的表达模式和调控机制。

研究者可以通过比较不同条件下的转录组数据，识别出差异表达的基因，并推断这些基因在特定生物过程中的功能和调控作用。

三、染色质免疫共沉淀实验染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，简称ChIP）实验是一种研究蛋白质与染色质相互作用的方法。

通过将染色质与特定抗体结合，可以富集特定的染色质区域。

研究者可以使用ChIP实验来研究转录因子与染色质上的结合关系，进而揭示基因调控的机制。

四、质谱分析质谱分析是一种通过测量分子的质量和相对丰度来获得结构与组成信息的方法。

在基因表达与调控的研究中，质谱分析常用于鉴定和定量蛋白质样品中的修饰、亚型和互作分子。

研究者可以利用质谱分析研究蛋白质的后转录修饰现象以及蛋白质之间的相互作用，以此来推测基因调控的机制。

五、荧光成像技术荧光成像技术是通过标记基因或蛋白质，并利用激光和荧光显微镜等设备观察和分析其在细胞或组织中的分布和表达量。

通过荧光成像技术，可以研究基因的表达模式、定位与分布，并进一步了解其调控方式。

该技术在研究基因调控过程中具有很大的应用潜力。

基因下调表达的实验技术一、啥是基因下调表达。

基因下调表达呢，就像是给基因这个“小调皮”降降温，让它不要那么活跃啦。

简单来说，就是要降低某个基因在细胞或者生物体内的表达水平。

你可以把基因想象成一个小工人，本来它在细胞这个大工厂里热火朝天地干活呢，现在我们要通过一些技术手段，让它少干点活，别那么积极。

这在很多研究里都超级重要哦，比如说我们想知道这个基因如果不那么活跃了，对细胞的生长、发育或者疾病的产生有啥影响。

二、RNA干扰技术。

1. 原理。

RNA干扰（RNAi）就像是基因的“小干扰器”。

细胞里本来有自己的一套管理系统，有个东西叫双链RNA（dsRNA），当我们把人工合成的或者来自其他地方的双链RNA导入到细胞里，细胞就会觉得，这个东西好像有点危险呢。

然后细胞里的一些小机制就开始启动啦，它们会把这个双链RNA切成一小段一小段的，叫小干扰RNA （siRNA）。

这些小干扰RNA就像小侦探一样，会去找那些和它们能互补配对的mRNA （信使RNA，是基因表达的中间产物哦），然后结合上去。

一旦结合了，细胞里的一些酶就会过来把这个mRNA给降解掉。

mRNA都没了，那基因就没办法顺利地表达出蛋白质啦，这样就达到了下调基因表达的目的。

是不是超级神奇呀？2. 实验步骤。

- 首先要设计合成siRNA。

这就像给基因定制专门的“小干扰器”。

我们得根据目标基因的序列信息，精心设计出合适的siRNA序列。

这个可不能马虎哦，要是序列设计错了，就像是给错了地址的快递员，小干扰RNA就找不到正确的目标mRNA啦。

- 然后就是把合成好的siRNA导入细胞。

这也有很多种方法呢，比如说可以用脂质体转染法。

脂质体就像是一个小包裹，把siRNA包裹在里面，然后把这个小包裹送到细胞里面。

还有电穿孔法，就像是给细胞开个小门缝，让siRNA能够进去。

不同的细胞可能适合不同的导入方法，就像不同的人喜欢不同的进门方式一样，有的喜欢走大门（脂质体转染法），有的可能需要一点特殊的手段（电穿孔法）。

敲降和过表达基因的研究方法敲降和过表达基因的研究方法基因是遗传物质的基本单位，它们控制着生物个体的生长发育和各种生物过程。

为了探究基因的功能，基因敲除、敲降和过表达等研究方法被广泛应用于生物学研究领域。

本文将介绍敲降和过表达基因的研究方法及其在生物学研究中的应用。

一、敲降基因的研究方法敲降（knockdown）指通过RNA干扰技术（RNAi）介导基因沉默来降低基因的表达水平。

通过RNAi技术可以干扰基因的转录和翻译过程，从而达到抑制基因表达的目的。

敲降可以用于探究基因在生物发育、生理和病理等过程中的功能，也可以用于筛选治疗某些疾病的药物靶点。

敲降基因的研究步骤如下：1.设计RNAi序列：通过合成双链RNA（siRNA或shRNA）的方式来靶向特定的基因，并抑制该基因的表达。

2.转染细胞或生物体：RNAi序列可通过转染或注射等方式导入到目标组织或细胞中。

3.验证敲降效果：通过检测目标基因在转染细胞或生物体中的表达水平，验证RNAi序列是否有效。

4.观察功能改变：通过对敲降细胞或生物体的形态和生理功能等方面进行观察，分析敲降对其功能的影响。

敲降基因的研究优势和不足：敲降技术简单易行，可以快速地验证基因功能，而且可以在活体条件下实现基因敲除，因此更贴近真实环境。

但敲降技术也存在一些问题，如RNAi技术具有组织特异性、效率不稳定等缺点。

另外，敲降技术无法完全消除目标基因的功能，因此不能完全反映基因影响。

二、过表达基因的研究方法过表达（overexpression）指转染外源性DNA，从而增加基因表达水平，使基因的表达量高于正常水平。

过表达技术可以用于筛选新的基因功能和标靶药物，在基因治疗中也有应用。

过表达基因的研究步骤如下：1.克隆目标基因：通过PCR扩增目标基因的DNA序列，并进行酶切以克隆到表达载体中。

2.转染克隆体：将表达载体转染到目标细胞或生物体内，使其过表达目标基因。

3.验证过表达效果：通过Western blot或实时荧光定量PCR等技术确认过表达是否成功。

基因表达调控机制的研究进展及趋势随着基因技术的快速发展，越来越多的科学家开始关注如何理解和利用基因信息。

基因表达调控机制就是其中的重要组成部分。

基因表达指的是基因转录成RNA的过程，而基因表达调控则是指何时和如何触发这个过程。

它涉及到如何控制基因的开关，让它们在适当的时候以适当的方式表达出来。

下面将介绍一些基因表达调控机制的研究进展与趋势。

1. 序列特异性调控在基因表达调控中，序列特异性调控是指基于DNA序列的特异性的调控方式。

这种调控方式主要发挥作用的是转录因子，它们可以结合到DNA上的特定区域，从而调控基因表达。

研究发现，转录因子的数量是非常庞大的，它们还可以相互作用和调节。

此外，最近还出现了一些新的序列特异性调控机制，如CRISPR-Cas9系统和TALENS技术，在基因编辑和基因治疗方面有着广阔的应用前景。

2. 后转录调控在前转录调控过程中，DNA被转录成RNA，然后RNA通过翻译转化成蛋白质。

而后转录调控就发生在RNA转录的后期。

这种调控方式主要涉及到RNA的后期处理，如剪接、多聚腺苷酸尾巴加工和RNA降解。

已经发现一些后转录调控因子，在肿瘤发生和发展中扮演着关键角色。

3. 染色质调控染色质是由DNA和一些调控元件组成的复杂结构，是基因表达的重要调节因素。

染色质调控机制主要包括乙酰化、甲基化和去甲基化等化学修饰方式，以及类胰蛋白、CpG岛和miRNA等特定元素的调控。

乙酰化和甲基化是已经被广泛研究的染色质调控机制。

研究表明，染色质结构的改变可以引起基因表达的改变。

因此，染色质调控机制对于理解基因表达调控的分子机制具有重要意义。

4. RNA干扰调控RNA干扰是一种基于RNA片段的基因调控方法。

它可以通过RNA介导的调控途径来抑制和启动基因的表达。

RNA干扰调控主要依靠反义RNA和小分子RNA来实现。

反义RNA是指与mRNA相互作用、干扰mRNA翻译成蛋白质，从而抑制目标基因表达的RNA分子；而小分子RNA则可以通过靶向mRNA的特定区域，降解或抑制 mRNA的翻译过程，从而调控基因表达。

基因表达促进机制与抑制因子构建模型基因表达是指基因编码信息转化为功能蛋白质的过程，是生物体正常发育和功能维持的基础。

在细胞中，基因的转录和翻译是基因表达的两个关键步骤。

为了保持基因表达的平衡和适应环境变化，细胞内存在着多种促进机制和抑制因子。

本文将介绍一些常见的基因表达促进机制，以及构建基因表达抑制因子的模型。

1. 基因表达促进机制1.1 转录因子的作用转录因子是一类能够与DNA结合的蛋白质，它们在基因转录调控中起着重要作用。

转录因子能够结合到特定的DNA序列上，并通过激活或抑制转录过程来影响基因表达。

例如，转录因子可以通过结合启动子区域的增强子序列来促进基因转录的启动，从而提高基因的表达水平。

1.2 染色质重塑和表观遗传修饰染色质重塑和表观遗传修饰是通过改变DNA和核蛋白质的相互作用方式来调控基因表达。

其中，DNA甲基化和组蛋白修饰是两种常见的表观遗传修饰方式。

DNA甲基化是指在DNA分子上加上甲基基团，这种修饰方式常常与基因沉默相关。

而组蛋白修饰是通过改变染色质的结构来影响基因的表达。

例如，乙酰化可以解开染色质的紧密结构，使得转录因子可以更容易地结合到DNA上，促进基因表达。

1.3 RNA剪接调控RNA剪接是转录后的一种调控机制，能够对转录产物进行剪接和拼接，产生不同的转录变体。

这些转录变体在编码蛋白质的能力、稳定性和功能上存在差异，因此可以通过调控RNA剪接来影响基因表达。

例如，选择性剪接可以排除一些剪接位点，使得某些特定的转录变体被优先生成，从而对基因功能产生影响。

2. 基因表达抑制因子构建模型为了研究基因表达的抑制机制，科学家们也构建了一些模型来模拟和研究基因表达的抑制因子。

这些模型可以根据特定的信号通路和相互作用关系来预测和验证基因表达抑制因子的作用方式。

2.1 RNA干扰RNA干扰是一种通过RNA分子靶向降解或抑制特定基因表达的机制。

RNA干扰通常通过引入双链RNA分子来触发，这些双链RNA分子可以与目标基因序列相互配对，从而导致目标基因的降解或抑制。

用于植物基因表达载体构建的质粒改造及其应用安韶雅;虎娟;张虹;孙放;马霞;王晨;陈任【摘要】为克服目前常用于植物基因表达载体构建的质粒所具有的酶切位点有限,目的基因片段难于插入和连接,缺少植物基因表达所必须的启动子、终止子、筛选标记等功能元件的缺点,本研究构建了一个用于植物基因表达载体构建的质粒栽体pNULPGE200.该质粒载体引入了植物基因表达最常用的CaMV 35S启动子(cauliflowermosaic virus 35S promoter)和NOS终止子(nopaline synthase terminator),以及之间的多克隆酶切位点MCS(multiple cloning site).利用pNULPGE200构建植物基因表达栽体,经PCR等方法克隆得到的目的基因可以直接连接到35S启动子与NOS终止子之间,使目的基因能够在植物体内稳定表达;同时该质粒载体还具有独立表达的卡那霉素NPT Ⅱ (neomycinphosphotransferase Ⅱ)耐性基因和sGFP (synthetic green-fluorescent protein with S65T mutation)绿色荧光蛋白报告基因,可用于基因转化时的筛选.本研究以假单胞菌(Pseudomonas putida)携带质粒的二甲苯单加氧酶(xylene monooxygenase)编码基因为材料,分别利用本文质粒载体和常规的质粒栽体pBI121构建了植物表达栽体,验证了文中质粒栽体的实用性.%In order to overcome the defects that the commonly used plasmids have a limited number of restriction sites for target gene cloning, and lack expressing elements such as promoter, terminator and selection marker genes, a plasmid named pNULPGE200 for construction of plant gene expression vector was modified. The plasmid contains cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, nopaline synthase (NOS) ter-minator, and a multiple cloning site between them. The target gene amplified by PCR can beinserted directly between the 35S promoter and the NOS terminator, and can be expressed in plants stably. pNULPGE200 also contains two independent expression marker genes, encoding neomycin phosphotransferase Ⅱ(NPT Ⅱ) and synthetic green-fluorescent protein with S65T mutation (sGFP), which can be used for mutual selection in plant transformation. The practicability of the plasmid was confirmed by comparing with a conventional plas-mid pBI121 in the construction of the gene encoding xylene monooxygenase from Pseudomonas putida to create a plant gene expression vector.【期刊名称】《生命科学研究》【年(卷),期】2018(022)002【总页数】8页(P114-121)【关键词】质粒改造;植物基因表达载体;载体构建;二甲苯单加氧酶基因【作者】安韶雅;虎娟;张虹;孙放;马霞;王晨;陈任【作者单位】宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021【正文语种】中文【中图分类】Q782自1984年首次获得转基因烟草[1]以来,以转基因技术为代表的植物基因工程技术的广泛应用为植物的遗传改良开拓了广阔的前景。

番茄红素β-环化酶基因(LcyB)启动子调控LcyB RNAi双元载体构建莫爱琼;文了;黎海燕;马丽;万小荣【摘要】根据番茄基因组DNA序列信息设计引物进行PCR扩增了Micro-Tom 中番茄红素β-环化酶(Lycopeneβ-cyclase,LcyB)基因起始密码子上游1 534 bp 启动子区域序列(LcyBp),生物信息学分析表明,该启动子序列中存在TA-TA-盒、CAAT-盒、昼夜节律响应元件Circadian、光响应元件Box Ⅰ、真菌激发子响应元件Box-Wl、低温响应元件LTR、响应赤霉素的作用元件P-box、乙烯响应元件ERE、响应生长素的作用元件TGA-element等顺式作用元件.依据番茄LcyB基因序列,设计2对含有不同酶切位点的特异引物进行PCR扩增LcyB基因3'端特异的276 bp DNA片段,利用RNAi载体pKANNIBAL构建了“LcyB启动子-LcyB基因正义片段(Sense)-PDK内含子-LcyB基因反义片段(Antisense)-OCS终止子”的RNAi表达框,并将这一RNAi表达框插入植物双元表达载体pART27的NotⅠ位点,构建成本研究的LcyB启动子驱动的LcyB基因RNAi植物双元表达载体pART-LcyBp-RNAi-LcyB.为利用RNAi技术特异性敲除LcyB基因进而提高番茄果实中番茄红素含量奠定实验基础.【期刊名称】《华南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(048)004【总页数】7页(P50-56)【关键词】番茄;番茄红素β-环化酶(Lycopene β-cyclase,LcyB);启动子;RNAi双元载体【作者】莫爱琼;文了;黎海燕;马丽;万小荣【作者单位】仲恺农业工程学院生命科学学院,广州510225;仲恺农业工程学院生命科学学院,广州510225;仲恺农业工程学院生命科学学院,广州510225;仲恺农业工程学院生命科学学院,广州510225;仲恺农业工程学院生命科学学院,广州510225【正文语种】中文【中图分类】Q945.1番茄红素(Lycopene)具有淬灭单线态氧、清除自由基、诱导细胞间连接通讯、调控细胞增殖等多种功能，尤其是对某些癌细胞增殖的抑制作用比α-胡萝卜素和β-胡萝卜素更强，因而成为现在最受关注的类胡萝卜素色素之一，是目前国际功能食品研究和化妆品与食品添加剂研究的焦点，有希望成为最重要的一个化学防癌物质，对人类健康有重要意义[1-2].在高等植物中番茄红素是由八氢番茄红素脱氢转变而来的，番茄红素的代谢途径主要是其环化反应，特别是番茄红素β-环化酶(Lycopene β-cyclase, LcyB)催化其环化形成β-胡萝卜素，是其主要代谢途径，PECKER等[3]克隆鉴定了番茄中编码番茄红素β-环化酶的LcyB 基因，发现其表达在果实后熟阶段降低，从而利于果实中番茄红素的积累. 目前成功的相关转基因植物报道的工作是在类胡萝卜素合成品种中过表达正向催化番茄红素前体合成的关键酶基因，希望提高转基因植株中番茄红素的含量，但由于向番茄红素合成支路的流向增大，往往导致其它以异戊二烯类化合物为前体的合成途径底物缺乏，而对转基因植株的生长发育造成不利影响[4-5]. 例如组成型表达八氢番茄红素合成酶基因的转基因番茄中，因为与赤霉素的生物合成途径竞争牻牛儿牻牛儿焦磷酸(GGPP)前体导致植株矮化等现象，因而无法应用于农业生产[4]. 2000年以色列科学家利用番茄Beta突变体的研究[6]表明，该突变体果实“后熟”期间番茄红素水平明显低于野生型，进一步研究发现这种突变表型是由于第6染色体上编码番茄红素β-环化酶的LcyB基因高表达所致，即番茄红素环化反应增强，大量转变生成β-胡萝卜素了. 迄今尚无番茄中LcyB基因启动子研究的有关报道.一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因表达，使特异mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，这一过程称为双链RNA干扰(Double-stranded RNA interference, 简称RNAi)[7-8]. RNAi作为一种反向遗传学的研究方法，为后基因组时代基因功能的分析提供了一种可靠、快速的应用技术平台. 本实验从新型模式植物微型番茄(Micro-Tom)中克隆LcyB基因5’上游启动子序列，并构建其驱动的特异静默LcyB基因的RNAi植物双元表达载体，为在此基础上利用RNAi技术特异性敲除番茄果实中的LcyB基因，通过阻断番茄果实中番茄红素的环化反应来终止以番茄红素为底物继续进行的代谢途径，进而获得番茄红素高富集的优质番茄奠定实验基础.1.1 植物材料微型番茄(Lycopersicon esculentum,称作Micro-Tom)是一种新型模式植物，其生命周期短，从播种到果实成熟只需约70 d，且生长密度高，可达约1 357株/m2；农杆菌介导的Micro-Tom子叶转化频率高，约达80%；Micro-Tom中只有2个主要基因(Dwarf Gene和Miniature Gene)与普通番茄不同[9-10]. 上述特征大大方便了番茄的突变和转基因，且使基因敲除的应用更为便利. Micro-Tom 种子播种在泥炭土中，生长条件为：光周期，16 h光/8 h暗；温度，25±1 ℃. 萌发生长约20 d后取番茄叶片备用.1.2 Micro-Tom LcyB基因5’上游启动子序列克隆采用SDS法提取Micro-Tom叶片基因组DNA[11]. 根据DNA数据库中报道的番茄基因组DNA序列信息(GenBank Accession No. KP233172)设计一对引物(LcyBp-F: 5’-CGRYCGTTCAGTCGTCTTAGGC-3’和LcyBp-R: 5’-CTCGAGACCATTATAGAGAATG-3’)，以Micro-Tom基因组DNA为模板，进行PCR扩增LcyB基因5’上游启动子序列，将PCR产物克隆到pMD 19-T (Simple) 载体(TaKaRa)上，通过PCR和酶切检测获得阳性克隆(含质粒pMD-LcyBp)后，挑阳性克隆送上海生工生物技术有限公司测序，获得Micro-Tom LcyB基因5’上游启动子序列(命名为LcyBp).1.3 LcyB基因启动子序列的生物信息学分析将上述克隆的Micro-Tom LcyB基因启动子序列在植物顺式作用元件数据库中的信号扫描程序进行生物信息学分析，搜寻该启动子序列中可能响应外界环境刺激和发育信号的顺式作用元件.1.4 LcyB基因启动子驱动的特异静默LcyB基因的RNAi双元表达载体构建构建LcyB基因RNAi植物表达载体时，本研究选用质粒pKANNIBAL作为基本克隆载体. 以引入的Mcr I和Xho I 2个限制性内切酶酶切质粒pMD-LcyBp，获取LcyBp片段替代质粒pKANNIBAL上的CaMV 35S 启动子，构建成含Micro-Tom LcyB基因启动子的中间RNAi质粒pK-LcyBp.根据DNA数据库中报道的番茄LcyB基因序列信息(GenBank Accession No. AEKE02020044)设计引物RNAi-S1(5’-CTCGAGGATCTTGATCCTAAATACTGGC-3’)和RNAi-S2(5’-GGTACCTGACAGTATGTAGCTCTTATCTCAC-3’)、以及RNAi-AS1(5’-AAGCTTGATCTTGATCCTAAATACTGGC-3’)和RNAi-AS2(5’-ATCGATTGACAGTATGTAGCTCTTATCTCAC-3’)扩增LcyB基因3’端276 bp 片段，在上述4条引物5’端分别引入Xho I、Kpn I和Hind III、Cla I酶切位点. 将2个PCR产物分别克隆到载体pMD 19-T (Simple) (TaKaRa)上，通过PCR、酶切检测及测序验证获得阳性克隆(分别含质粒pMD-RNAiS及质粒pMD-RNAiAS).以Xho I和Kpn I 2个限制性内切酶双酶切质粒pK-LcyBp及质粒pMD-RNAiS，分别回收质粒pK-LcyBp的大片段和质粒pMD-RNAiS酶切后的LcyB基因片段，连接构建成中间RNAi质粒pK-LcyBp-RNAiS；以Hind III和Cla I 2个限制性内切酶双酶切pK-LcyBp-RNAiS及pMD-RNAiAS这2个质粒，分别回收质粒pK-LcyBp-RNAiS的大片段和质粒pMD-RNAiAS酶切后的LcyB基因片段，连接构建成中间RNAi质粒pK-LcyBp-RNAi-LcyB.再利用Not I从质粒pK-LcyBp-RNAi-LcyB切下LcyBp::LcyB RNAi表达框插入植物双元表达载体pART27的Not I位点，最后构建成本研究的RNAi植物双元表达载体pART-LcyBp-RNAi-LcyB.2.1 Micro-Tom LcyB基因启动子序列克隆与生物信息学分析根据DNA数据库中报道的番茄基因组DNA序列信息设计一对引物，以Micro-Tom基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果扩增出一条约1 500 bp的DNA片段(图1)，将此片段回收后克隆到载体pMD 19-T (Simple)上，通过PCR和酶切检测、筛选，获取含质粒pMD-LcyBp的阳性克隆. 挑阳性克隆送上海生工生物技术有限公司测序，测序结果表明PCR产物为1 551 bp的DNA序列. 对此序列进行BLASTn分析(/Blast.cgi)，结果表明其与GenBank DNA数据库中报道的番茄基因组DNA序列信息完全吻合，说明所克隆的DNA序列为Miro-Tom LcyB基因起始密码子ATG上游启动子区域序列(图2). 将克隆的LcyB基因启动子区域序列在国际植物顺式作用元件数据库PlantCARE[12]中进行生物信息学分析，搜寻该启动子序列中可能的响应发育信号和外界环境刺激的顺式作用元件(图2). 在该启动子序列-137～-132(LcyB基因起始密码子ATG上游)处有典型的TATA-box，核心序列为ATATAA[13]；-107～-104处有CAAT-box，核心序列为CAAT[14]；在-298～-289、-275～-266及-116～-107处有典型的响应昼夜节律的顺式作用元件Circadian，核心序列分别为CAAAAATATC、CAAACACATC及CAAAAGCATC[15]；-326～-320处有光响应元件Box I，保守序列为TTTCAAA[16]；在-783～-778及-315～-310处有真菌激发子(Elicitor)响应元件Box-W1，核心序列为TTGACC[17]；在-712～-707及-383～-378处有低温响应元件LTR，核心序列为CCGAAA[18]；另外，在该启动子序列中存在一些响应几种植物激素的顺式作用元件，如-1 352～-1 346及-920～-914处响应赤霉素的作用元件P-box，核心序列为CCTTTTG[19]；-327～-320处的乙烯响应元件ERE，核心序列为ATTTCAAA[20]；-995～-990响应生长素的作用元件TGA-element，核心序列为AACGAC[13](表1). 序列分析结果表明，所克隆的DNA序列为Micro-Tom LcyB基因起始密码子上游包含各种响应植株发育信号和外界环境刺激的顺式作用元件的启动子区域序列.2.2 LcyB启动子驱动的LcyB基因RNAi双元表达载体构建以限制性内切酶Mcr I和Xho I双酶切质粒pMD-LcyBp，回收LcyBp启动子片段克隆到质粒pKANNIBAL的Mcr I和Xho I位点，替换其中的CaMV 35S 启动子，构建成含番茄LcyB基因启动子的中间RNAi质粒pK-LcyBp. 对构建的载体pK-LcyBp进行PCR和双酶切检测,结果以LcyBp-F和LcyBp-R为引物可特异地扩增出1 551 bp的LcyBp片段，以Mcr I和Xho I 2个限制性内切酶双酶切质粒pK-LcyBp可切下相应大小的DNA片段(图3)，说明载体pK-LcyBp构建正确.以Micro-Tom基因组DNA为模板，分别以RNAi-S1和RNAi-S2以及RNAi-AS1和RNAi-AS2为引物，进行PCR扩增LcyB基因3’端276 bp的DNA片段. 按图4的流程构建LcyB启动子驱动的LcyB基因RNAi植物双元表达载体. 用限制性内切酶Xho I和Kpn I双酶切质粒pK-LcyBp，将LcyB基因片段用同样的酶从质粒pMD-RNAiS上切下，然后将2个片断用连接酶连接，构建成质粒pK-LcyBp-RNAiS. 用限制性内切酶Hind III和Cla I双酶切pK-LcyBp-RNAiS，并以同样的酶从质粒pMD-RNAiAS上切下LcyB基因片段，再回收2片段并连接，构建成中间RNAi质粒pK-LcyBp-RNAi-LcyB. 再利用Not I从质粒pK-LcyBp-RNAi-LcyB切下LcyBp::LcyB RNAi表达框插入载体pART27的Not I位点，最后构建成Micro-Tom LcyB启动子驱动的LcyB基因RNAi双元表达载体pART-LcyBp-RNAi-LcyB.对构建的载体pART-LcyBp-RNAi-LcyB进行PCR、酶切及测序检测，结果以LcyBp-F和LcyBp-R为引物可特异地扩增出1 551 bp的LcyBp片段；分别以Xho I/Kpn I和Hind III/Cla I双酶切质粒pART-LcyBp-RNAi-LcyB，均可切下276 bp的LcyB基因片段；以Not I单酶切质粒pART-LcyBp-RNAi-LcyB，得到与预期大小一致的2个片段(图5). 进一步对质粒pART-LcyBp-RNAi-LcyB所有经连接的接合处(Junction Area)进行测序，结果表明，构建质粒的接合处序列都与预期一致，构建过程中未发生碱基插入、缺失等造成的读码框变化. 说明已成功构建Micro-Tom LcyB启动子驱动的LcyB基因RNAi植物双元表达载体(图6).近年来伴随番茄红素重要生理功能的发现，利用基因工程技术改造番茄红素合成途径，提高农作物番茄红素含量的研究成为类胡萝卜素研究领域的新热点. 植物中转入番茄红素合成关键酶同源序列很强的基因非常容易发生基因静默(Gene silencing)，从而会降低番茄红素的含量.RNAi具有高度的特异性，只引起与dsRNA同源的mRNA的降解，在由21～23个核苷酸构成的siRNA(small interfering RNA)中只要改变1个核苷酸，就可以使该siRNA序列不对靶向mRNA起作用[21]. 已有大量研究[7-8, 21-24]证实RNAi可高效特异地抑制特定基因的表达，获得功能性丧失，从而成为研究基因功能的良好工具. 本实验从Micro-Tom中克隆了LcyB基因起始密码子上游1 534 bp的启动子区域序列，利用RNAi中间载体pKANNIBAL构建了“番茄LcyB启动子-LcyB基因正义片段(Sense)-PDK内含子-LcyB基因反义片段(Antisense)-OCS终止子”的结构，并将这一结构以Not I从质粒pK-LcyBp-RNAi-LcyB上切下，插入植物双元表达载体pART27的Not I位点，最后构建成本文的RNAi植物双元表达载体pART-LcyBp-RNAi-LcyB. 故可使将来转基因植物中经转录就形成了具有“LcyB基因正义片段-PDK内含子-LcyB基因反义片段”结构的mRNA，LcyB基因正、反义片段通过链内退火，形成dsRNA，激发RNAi机制，形成siRNA，能够与内源LcyB基因转录的mRNA发生特异性作用，使LcyB基因在转录后水平沉默(PTGS).许多报道的转基因实验中所用的启动子多为组成型启动子，如CaMV 35S，在它的调控下，外源基因在转基因植物中所有的发育阶段和所有的部位都能表达，对于需要组织特异性表达的基因来说，在该启动子调控下表达造成营养浪费而常导致植株生长不良，如上述Fray和Grierson将番茄八氢番茄红素合成酶基因在组成型启动子调控下转入番茄，结果幼果异常生长，植物矮化. 在基因工程研究中对于组织或器官特异性启动子的需求是很大的，也越来越受到研究人员的重视. 因此本研究是采用番茄LcyB基因本身的启动子调控LcyB基因RNAi片段的表达，将可更加特异地阻抑LcyB基因在番茄中的时空表达.【相关文献】[1] 谭新平, 王银娜, 刘昕. 番茄红素与癌 [J]. 天然产物研究与开发, 2001, 13(4): 71-75. 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调控基因表达的技术与应用近年来，关于调控基因表达的技术在科学界引起了广泛的关注，因为这些技术可以对不同的生物体进行精确的调控，从而进一步深入理解基因功能以及疾病的发生发展机制。

本文将简要介绍几种常用的调控基因表达技术及其应用场景。

一、siRNA技术siRNA全称small interfering RNA，是一种近年来广泛用于基因靶向的技术。

siRNA技术可通过设计和合成siRNA分子，使其寡核苷酸序列与目标基因mRNA互补，从而特异性地切割靶向基因的mRNA，进而调控靶向基因的表达。

siRNA技术可用于基因的靶向剪切、转录水平的调控等领域，实现了对基因表达的精确调控。

siRNA技术在癌症治疗中具有潜在应用，例如对于BRCA1基因进行靶向干扰，可减弱它对细胞凋亡的抑制作用，从而增加乳腺癌等癌症细胞对治疗的敏感性。

此外siRNA技术也可应用于神经科学、免疫学等领域。

二、CRISPR-Cas9技术CRISPR-Cas9是一种革命性的基因编辑技术，可以对基因序列进行精确的修饰，如基因靶向编辑、基因转录调控等。

CRISPR-Cas9技术起源于细菌体内其自身的免疫机制，是将CRISPR序列与Cas9蛋白相结合应用于基因编辑的一种技术。

CRISPR-Cas9技术在农业、生物医学、神经科学、生长发育等领域都有潜在的应用前景。

例如，基于CRISPR-Cas9技术对非典型病毒进行基因修饰，使其丧失对人类免疫系统的逃避性，成为研发疫苗的新途径之一。

此外，CRISPR-Cas9还可以应用于治疗遗传性疾病，如单基因疾病。

三、RNA干扰技术RNA干扰技术（RNAi）是通过siRNA和miRNA调控基因表达的一个重要的分子生物学技术。

RNA干扰技术可以通过siRNA、miRNA等作用于基因靶向mRNA，从而有效抑制基因表达。

RNA干扰技术具有可以下调、稳定性较高、靶向性较强等优点，已经成为基因调控领域不可或缺的一环。

RNA干扰技术在生物医学领域应用广泛，例如可用于研究HIV 病毒的侵入机理、肺癌的治疗等。