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ITC200简易操作指南1ITC200介绍等温滴定量热仪ITC200由控制器和主机组成。
其中主机包括塔台，滴定注射器，测量池以及清洗单元等部件。
溶液瓶是清洗单元的一部分，通过管道和清洗平台相连。
主机上方白色托盘内的金属槽内是 ITC200的样品池和参比池。
2实验准备2.1仪器的清洁操作前需要确认ITC200的样品池是否洁净，可以通过向样品池，参比池和滴定注射器中都加入脱气的超纯水，然后通过水滴水的实验观察噪音水平，确认是否洁净。
如果样品池比较脏，可使用5%-20 %的去垢剂 Contrad 70（或 Decon 90）浸泡半小时，浸泡时同时将样品池加温到50 摄氏度，以彻底去除黏附的杂质。
随后用Cell water rinse 命令，用超纯水清洗样品池。
使用 syringe wash 命令，清洗滴定注射器。
清洗后再通过水滴定实验进行确认。
2.2样品的准备滴定与被滴定样品需要溶解在完全一致的缓冲液中，如果缓冲液不一致，则需通过透析或者超滤等手段进行置换，并保留透析或者超滤尾液，作为参比缓冲液。
通常将大分子的蛋白作为被滴定样品，放于样品池中，通常浓度为 50 µM, 参比池中放入超纯水。
将小分子或相互作用的另一方装于滴定注射器中，通常浓度为样品池中浓度的10-15 倍。
3实验设计ITC200的控制软件整合了方便的实验设计的功能。
在软件的Experimental design 标签页中输入预估的相互作用的化学计量比（N），选择相互作用体系，软件将自动估计解离平衡常数(K D)；输入反应焓变（ΔH）后，软件就会自动给出预估的实验结果图，以及推荐使用的样品浓度。
4实验确定实验用的样品浓度后，就可对样品池和滴定针进行加样。
4.1样品池加样取下上样针，检查是否干净，并用缓冲液润洗。
，用上样针慢慢吸取约300 ul的样品，小心去掉针管中的气泡。
将上样针垂直插入样品池，直到针头触到样品池底部，然后向上提起1 mm。
一、实验目的：1.了解MicroCal iTC200等温滴定量热仪在测量蛋白质相互作用中的应用2.了解仪器基本工作原理，学习蛋白质相互作用的测定步骤和仪器操作3.简要分析实验结果。
二、实验原理：在研究两种或两种以上的蛋白质的功能时，相关蛋白质之间常常存在相互作用（常常是氢键或范德华力），如果两蛋白可以彼此结合，则结合的过程中会放出一定的热量。
所以，通过测定蛋白质相互作用时放出热量的大小，可以得到蛋白相互作用时的结合常数KD、化学计量比N和焓变ΔH，从而由热力学公式ΔG = RT lnKD和ΔG = ΔH -TΔS可以进一步得到反应的自由能变化。
在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。
当配体注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比。
当池中的高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。
MicroCal iTC200等温滴定量热仪可以用来定量测定生物分子间的相互作用，例如蛋白质-蛋白质相互作用（包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用）；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用等。
从而获得亲和力以及相关热力学数据。
通过滴定操作和热量的测量，量热仪可以给出热量-摩尔比曲线：图像中曲线的突跃中点对应的化学计量比就是两种蛋白质相互作用的化学计量数N，突跃中点处曲线的斜率就是两种蛋白相互作用的结合常数KD。
决定曲线形状的主要参数是C值：C = 滴定池中的蛋白浓度/ KD = [M]t/ KD × NC值越大，曲线越陡；C值越小，曲线越平缓，没有明显的突跃。
一般C值在10-100之间实验效果最好。
配体溶液多次次注射到ITC池的蛋白溶液中。
每个注射峰下方的区域的面积与注射所释放的总热量相等。
ITC等温滴定量热法的操作说明ITC等温滴定量热法的操作说明1：概述ITC（Isothermal Titration Calorimetry）等温滴定量热法是一种常用于测量化学反应热效应和热力学参数的实验技术。
本文档将详细介绍ITC等温滴定量热法的操作步骤，以及常见问题的解决方案。
2：实验前准备2.1 仪器准备- 确保ITC仪器处于良好的工作状态，并进行必要的校准和检修。
- 检查仪器和相关设备的供电和冷却系统，确保正常运行。
- 准备实验所需的试剂和溶液，确保其纯度和浓度符合要求。
2.2 样品准备- 准备待测样品，确保样品的纯度和浓度符合实验要求。
- 储存样品时，注意避免暴露在空气中，以免影响实验结果。
- 如有需要，进行样品的预处理或稀释，以适应实验要求。
3：实验操作3.1 基本操作步骤- 打开ITC仪器，并进行必要的初始化设置。
- 准备试样，通常包括两种液体：溶剂和待测样品。
- 启动实验程序，并按照程序指导添加试样。
- 进行实验过程中，根据实验需要，调整实验参数，如温度、压力、浓度等。
- 当实验结束后，关闭仪器，保存实验数据。
3.2 添加试样的注意事项- 添加试样时，应尽量避免形成气泡，以免影响测量结果。
- 在添加试样前，应将样品和溶剂在相同工作温度下达到热平衡。
- 添加样品时，应使用精确的加样装置，控制加样速度和时间。
4：数据分析4.1 数据处理与解读- 对实验数据进行处理和分析，包括热流曲线的积分和差分操作等。
- 利用数据做曲线拟合，计算反应热和其他热力学参数。
- 根据数据分析结果，解释实验现象和反应机制。
4.2 出现问题的解决方案- 如实验数据异常或与理论不符，可检查实验操作是否正确，并逐步排除可能的问题。
- 如仪器出现故障或异常，应及时联系厂家进行维修或咨询专业人员的意见。
5：附件本文档附带以下附件：- ITX仪器操作手册6：法律名词及注释本文档中涉及的法律名词及其注释如下：- 1：涉及附件: 本文档所附带的相关文件或资料。
等温滴定量热法(I T C)的简易操作流程：①样品的准备，包括滴定物与被滴定物(如DNA滴定蛋白质)。
a.实验前的蛋白质样品需用缓冲溶液透析(注意透析袋的正确使用)，透析时间一般为24小时，buffer体积为1L，且中途注意更换buffer，其目的是为了减少由于溶液组成不同而产生的滴定误差；b.样品的浓度要求，一般要求的浓度为微摩尔级，且滴定物(DNA)的浓度是被滴定物(蛋白质)的十倍左右为宜，且实验前需要再次确认所配样品的浓度是否符合要求；c.在进行滴定实验前，用于空白对照的缓冲液，蛋白样品以及DNA均需抽真空除气泡(15Mins左右为宜)。
②仪器的清洗。
a.在进行真空除气泡前，除气泡用容器均需用超纯水清洗三次左右，且清洗完毕后擦干内壁，防止由于残留缓冲液的稀释而导致样品浓度的改变；b.样品池(sample cell)的清洗，用超纯水清洗15次左右(每次2ml左右)，清洗完毕后，一定要将残留的超纯水吸干净；c.注射器(syringe)的清洗，用超纯水清洗3次以上(专用注射器清洗,此时无需点击open,close和purge选项)，清洗完毕后将注射器的头部擦干，之后清洗装DNA 的小试管，步骤同注射器的清洗。
③设置空白对照试验（DNA滴定缓冲液），将缓冲液置于小试管中(为了防止空气的进入，一般添加样品的量大于其实际所需的量)，打开控制界面，点击open之后，用手动注射器缓慢拉动活塞，此时注射器管中的液面上升，然后点击close, 注射器会自动将小试管中的缓冲液吸入注射器中，当缓冲液完全吸入注射器之后点击pump键，除去气泡；在清洗样品池的同时就设置所需的实验温度（套管温度，一般较反应温度稍低），并输入样品的实际浓度以及实验数据文件名和储存路径等一系列参数（如注射时间，注射次数，注射间隔时间）。
④设置滴定实验，步骤同空白试验，只需将样品池中用于空白对照的缓冲液换成蛋白样品同时修改文件名(先准备样品池中的样品，后准备注射器中的样品)。
