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水处理系统军团菌检测及消毒方法作者：范春红来源：《科技创新导报》2012年第34期摘要：军团病的爆发主要是由于空调水等人工水体感染军团菌引起，因此对于系统中军团菌的检测和消毒方法越来越受到人们的重视。
该文对军团菌的检测方法和消毒方法进行了综述。
关键词：军团菌检测方法消毒方法中图分类号：R372 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2012）12（a）-0-01军团菌是一种革兰氏阴性杆菌，广泛存在于土壤、水体中，可通过含菌气溶胶的方式在空气中散布，当人体进行呼吸时，菌气进入体内引起感染，军团病的病死率高达22.8%[1]。
军团病临床病例中由嗜肺军团菌所引起的病例占军团病的80%[2]。
因此制定规范的检测方法与指标标准对该病的预防与控制具有重要意义，而且，杀灭自然及人工水体中的嗜肺军团菌是控制军团病发生的主要环节。
1 军团菌实验室检测方法军团菌人工培养条件的苛刻及其生长代谢的缓慢导致临床与环境标本检出率低下，从而造成事实上的假阴性漏检，对军团病的预防与治疗十分不利。
现有的军团菌实验室检测方法主要有以下几种。
1.1 分离培养是诊断军团菌，尤其是诊断嗜肺军团菌（LP）最准确的方法，最适培养基为BCYE培养基（即活性炭—酵母提出液琼脂）国外培养阳性率可达50%～80%，但国内还达不到这么的百分率。
培养时应用含军团菌抗体的琼脂培养及免疫放射自显影技术或克隆杂交技术，可更好地检测和计数军团菌菌落。
Steinmetz等利用军团菌特异性的单克隆抗体MAb2125进行克隆印迹分析，可于2 h内在培养基上众多菌落中筛选出军团菌落。
分离培养用时比较长，操作也比较复杂，且在某些标本中还会存在着其他的物质，他们会阻止军团菌的生长，给培养带来了困难，无法观察到军团菌的完整的初期现象。
1.2 直接免疫荧光法（DFA）这种方法也是检测军团菌最常用方法。
这种方法可以在2 h内就能得到结果，但操作复杂，敏感性低。
将单克隆抗体应用于DFA可同时提高此法的敏感性和特异性。
•实验室管理•一起由沐浴水中军团菌引起的感染事件的水质实验室检测宋晖乔玫王2019年7月1日，我省某市4所医院陆续接诊数10例发热患者，截止2019年7月4日17时，共接诊发病患者88例，住院58例，留观14例，治疗后离院16例，所有患者病情稳定，无危重患者。
所有患者均有6月28日至6月30日至某。
中心，营业时日早9.00至晚24:00点，女浴室总面积约600m2,内设有2个约20m2的浴池；男浴池总面积约1000m2,内设有2个约8m2的浴池，1个约30m2发，女浴6月29日发251,6月30日发136浴室管理：6月29至30日在女9 ,3,均发病省市区疾控中心，本次危险暴露因素为女病原E M病，患者-室测疾病发某中心测1材料与方法1.1材料1.1.1培养基：血营养琼脂培养基，军团菌生长培养基（BCYE）,用E GVPC）。
1.1.2：均用1.1.3:诊抗血清试剂（科玛嘉诊断血清试剂盒），1.2方法1.2.1品来源：由我省某市疾病控制中心人员采集送检。
无菌广口瓶沐标26份（500mL/瓶）。
1.2.2检测方法:依据GB/T18204.5-2013,《公共场所卫生检验方法第5部分：中空调通风系统》3;WS394-2012，《公共所中空通风系统卫生规范》附B中的方法进；计数米用Legiolert方法。
1.2.3测步骤：①品离心（过滤）一15mL灭菌水洗脱2mL脱样品热处理!2mL脱样品酸处理。
②接种与培养:取脱品0.2mL、热处理品及酸处理样品各0.1mL，分别接种GVPC平板接种平板静置于C02箱中,35"，孵育10d。
挑取可疑菌落接种BCYE琼脂,35"培2d。
③型确定:进化与清确定嗜肺军D0I：10.19522/ki.l671-5098.2020.03.051作者单位:030012太原，山西省疾病预防控制中心消毒监测科（宋晖、乔玫、王静），质量管理科（武S）,办公室（马麟）静武（马麟团菌.2结果对26份沐浴水，进行军团菌分离培养和浓度计数，结果中东出嗜肺浓度2.2cfu/mL,中西出嗜肺浓度3.5cfu/mL，女东出嗜肺团菌浓度＞2272.6cfu/mL,女西浴池检出嗜肺军团菌浓度939.8cfu/mL，女浴砂箱水（东）检出嗜肺军团菌浓度＞2272.6 cfu/mL,女浴砂箱水（西）检出嗜肺军团菌浓度872.3cfu/mL,绢水素风吕设备水检出嗜肺军团菌浓度＞2272.6cfu/mL,东女砂箱出嗜肺浓度1922.6cfu/mL,西女浴砂箱水检出嗜肺军团菌浓度735cfu/mL，检出率34.61%。
1.适用范围本方法适用于各种环境中的样品包括饮用水、工业用水和自然界中的水及沉淀物和污泥中的军团菌测定。
2.培养基与试剂2.1 GVPC：2.1.1基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
2.1.2添加剂：军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0110A)和军团菌GVPC选择性添加剂Oxoid(SR0152E)。
2.1.3制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将SR110A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀, 再无菌吸取2mL SR0152E（用10mL无菌蒸馏水溶解）加入到上述培养基中，混匀后，倾倒平板。
2.2 BCYE：2.2.1 基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
2.2.2 添加剂：军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0110A)。
2.2.3 制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将SR110A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀,倾倒平板。
2.3 BCYE-Cys：2.3.1 基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
2.3.2 添加剂：不含L-半胱氨酸的军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0175A)。
2.3.3 制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将SR175A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀,倾倒平板。
2.4 酸缓冲液配制：A液 0.2M HCl（10mL 1M的HCl加入到40mL的蒸馏水中） 39mlB液 0.2M KCl (14.9gKCL溶解在1L无菌蒸馏水中) 250mlA, B液混合后用1M 的KOH调节pH至2.2±0.2,室温下的保质期一个月.2.5血平板(BA)2.6革兰氏染色液2.7军团菌乳胶凝集试剂盒Oxoid（DR0800M）。
1.适用范围本方法适用于各种环境中的样品包括饮用水、工业用水和自然界中的水及沉淀物和污泥中的军团菌测定。
2.培养基与试剂2.1 GVPC：2.1.1基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
2.1.2添加剂：军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0110A)和军团菌GVPC选择性添加剂Oxoid(SR0152E)。
2.1.3制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将SR110A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀, 再无菌吸取2mL SR0152E（用10mL无菌蒸馏水溶解）加入到上述培养基中，混匀后，倾倒平板。
2.2 BCYE：2.2.1 基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
2.2.2 添加剂：军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0110A)。
2.2.3 制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将SR110A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀,倾倒平板。
2.3 BCYE-Cys：2.3.1 基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
2.3.2 添加剂：不含L-半胱氨酸的军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0175A)。
2.3.3 制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将SR175A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀,倾倒平板。
2.4 酸缓冲液配制：A液 0.2M HCl（10mL 1M的HCl加入到40mL的蒸馏水中） 39mlB液 0.2M KCl (14.9gKCL溶解在1L无菌蒸馏水中) 250mlA, B液混合后用1M 的KOH调节pH至2.2±0.2,室温下的保质期一个月.2.5血平板(BA)2.6革兰氏染色液2.7军团菌乳胶凝集试剂盒Oxoid（DR0800M）。
公共场所水环境中活嗜肺军团菌的快速检测方法郭沛;赵龙;胡翮【摘要】旨在建立一种基于16S rRNA前体的分子学检测方法用于快速检测活嗜肺军团菌,应用该方法与ISO标准法调查公共场所水环境中嗜肺军团菌的水平及污染现状.此研究方法的理论基础在于营养刺激后可诱导嗜肺军团菌16S rRNA前体的合成,后者可作为检测细胞活性的指标.分别应用预刺激RT-qPCR法和ISO法对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌以及非军团菌进行检测,并验证两种方法的特异性、灵敏度.应用预刺激RT-qPCR法和ISO法检测公共场所水环境中的嗜肺军团菌,比较两者结果的一致性.结果显示,预刺激时间大于3h时,嗜肺军团菌16S rRNA前体的增长缓慢,最佳预刺激时间设置为3h.预刺激RT-qPCR法与ISO法均能较好地检出嗜肺军团菌,特异性均为100％,预刺激法的最低检测浓度(Limit of detection,LOD)为102Cell/L,ISO标准法的LOD为104 Cell/L.预刺激法及ISO法的总阳性率分别为43.5％(30/69)和40.6％(28/69),两种方法的检出率差异无明显统计学意义(C2=0.119,P=0.730).预刺激RT-qPCR法是一种快速有效的检测活嗜肺军团菌的方法,诊断灵敏度及特异性高,是ISO标准法潜在的替代方案.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2019(035)003【总页数】7页(P203-209)【关键词】嗜肺军团菌;PCR;水环境;公共场所;16S rRNA;快速检测方法【作者】郭沛;赵龙;胡翮【作者单位】湖南省湘潭市食品药品检验所,湘潭411100;湖南省湘潭市食品药品检验所,湘潭411100;湖南省湘潭市食品药品检验所,湘潭411100【正文语种】中文军团菌病是一种细菌性疾病，主要表现为自限性非肺炎性庞蒂亚克热（Pontiac fever）和军团菌病症状，其特征是严重的呼吸道症状，包括具有高度致命性的肺炎。
附录 A（规范性附录）嗜肺军团菌的鉴定A.1 总则嗜肺军团菌作为军团菌中重要检测对象，在特定情况下应进一步用生化培养和血清学试验鉴定嗜肺军团菌。
A.2 生化培养法判定嗜肺军团菌A.2.1 氧化酶试验：使用铂/铱接种环或玻璃棒，挑取待测菌落于滤纸上，加一滴氧化酶试剂，如果在30s内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性；2min不变色为阴性。
A.2.2 硝酸盐还原试验：将待测菌接种到硝酸盐培养基上，在36℃±1℃培养1d～3d，加入甲液和乙液各一滴，观察结果。
立刻或数分钟内显红色为阳性，培养基颜色无变化为阴性。
注：本试验阴性的原因有三个：细菌不能还原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮；培养基不适于细菌的生长。
如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解，可再加入锌粉少许，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色。
A.2.3 尿素酶试验：将待检菌以较大量穿刺接种在尿素琼脂培养基上，36℃±1℃培养2h、4h、24h，分别观察结果，培养基变为红色为阳性,颜色不变为阴性。
A.2.4 明胶液化：将待测菌穿刺接种在明胶培养基内，于36℃±1℃培养24h±2h,取出放置于4℃±2℃冰箱内10min-30min后再观察结果，仍呈溶解状或表面溶解时即为明胶液化试验阳性；凝固不溶者为阴性。
A.2.5 马尿酸水解试验：挑取待测菌落，加到盛有0.4mL1%马尿酸钠的试管中制成菌悬液。
混合均匀后在36℃±1℃水浴中温育或36℃±1℃培养箱中培养24h。
沿着试管壁缓缓加入0.2mL茚三酮溶液，在36℃±1℃水浴中温育或36℃±1℃培养箱中放置10min后观察结果。
15min内溶液出现蓝紫色变化则为阳性；溶液无颜色变化或15min之后出现蓝紫色变化为阴性。
试验时为了避免假阴性需用标准菌株做阳性对照。
A.2.6 生化培养结果判定：氧化酶（－/弱+），硝酸盐还原（－），尿素酶（－），明胶液化（+），水解马尿酸（+），即可确定为嗜肺军团菌。
医院热水系统中的军团菌及其感染控制医院是军团病高发区，而热水系统是军团病的主要菌源，为此，从设计和维护管理的角度，对其感染控制进行了初步地分析与探讨。
关键词：热水系统军团控制谢思桃1 王冠军1 吴金城2（1总后勤部建筑设计研究院，北京100036；2北京洁利尼水处理工程有限公司，北京100016）摘要: 医院是军团病高发区，而热水系统是军团病的主要菌源，为此，从设计和维护管理的角度，对其感染控制进行了初步地分析与探讨。
关键词: 医院热水系统军团菌感染控制军团病热水供应为现代化医院所必备，而热水供应设备和供水系统因存在死区、滞留时间及设备管道的腐蚀造成细菌繁殖，调查和化验结果表明，水中细菌开始繁殖，其中主要是产生了对人体极有危害的“军团菌”[1]。
国内外相关的一些研究表明军团菌能长期混入医院管道工程系统，侵袭力很强，我们缺乏有效的预防措施，军团病传染的危险性正在加剧，特别是较老的大医院保持较低水温的热水容器军团菌混入率较高。
1 军团菌（病）简介[2]1976年10月在美国费城召开了一次退伍军人会议，参会者有221人感染了一种当时被媒体称作神秘的病菌，症状为高烧、发冷、头痛、恶心，半数人神志不清及精神错乱。
三分之二的感染者住院治疗，大部分获得痊愈，有34人死亡。
对此可怕的疾病，美国疾病防治中心（CDC）组织了一批专家，经半年时间研究，耗资200多万美元，发现了致病的杆状嗜肺菌。
1977年元月公开了这一重要研究，并定名这种致病菌为“军团菌”，由此引起的疾病叫“军团病”。
军团病是由存在于自然界水及土壤中的军团菌侵入人体所致的疾病。
军团菌是常见的细菌，但军团菌的营养要求比较特殊，因而，在水温较低、营养较贫乏的环境水体中，军团菌一般不易繁殖，浓度较低，没有致病危险。
虽然军团菌生活在水中，但是人们不会由于饮用了含有军团菌的水而感染。
军团菌感染的主要途径是经呼吸道感染。
军团菌的菌体微小，人在正常呼吸时，会将空气中含有军团菌的气溶胶同时吸入呼吸道内，致使军团菌有机会侵染肺泡组织和巨噬细胞，引发炎症，导致军团病。
水处理系统军团菌检测及消毒方法
摘要：军团病的爆发主要是由于空调水等人工水体感染军团菌引起，因此对于系统中军团菌的检测和消毒方法越来越受到人们的重视。
该文对军团菌的检测方法和消毒方法进行了综述。
关键词：军团菌检测方法消毒方法
军团菌是一种革兰氏阴性杆菌，广泛存在于土壤、水体中，可通过含菌气溶胶的方式在空气中散布，当人体进行呼吸时，菌气进入体内引起感染，军团病的病死率高达22.8%[1]。
军团病临床病例中由嗜肺军团菌所引起的病例占军团病的80%[2]。
因此制定规范的检测方法与指标标准对该病的预防与控制具有重要意义，而且，杀灭自然及人工水体中的嗜肺军团菌是控制军团病发生的主要环节。
1 军团菌实验室检测方法
军团菌人工培养条件的苛刻及其生长代谢的缓慢导致临床与环境标本检出率低下，从而造成事实上的假阴性漏检，对军团病的预防与治疗十分不利。
现有的军团菌实验室检测方法主要有以下几种。
1.1 分离培养
是诊断军团菌，尤其是诊断嗜肺军团菌（LP）最准确的方法，最适培养基为BCYE培养基（即活性炭—酵母提出液琼脂）国外培养阳性率可达50%～80%，但国内还达不到这么的百分率。
培养时应
用含军团菌抗体的琼脂培养及免疫放射自显影技术或克隆杂交技术，可更好地检测和计数军团菌菌落。
Steinmetz等利用军团菌特异性的单克隆抗体MAb2125进行克隆印迹分析，可于2 h内在培养基上众多菌落中筛选出军团菌落。
分离培养用时比较长，操作也比较复杂，且在某些标本中还会存在着其他的物质，他们会阻止军团菌的生长，给培养带来了困难，无法观察到军团菌的完整的初期现象。
1.2 直接免疫荧光法（DFA）
这种方法也是检测军团菌最常用方法。
这种方法可以在2 h内就能得到结果，但操作复杂，敏感性低。
将单克隆抗体应用于DFA可同时提高此法的敏感性和特异性。
1.3 核酸探针技术
原位杂交技术不仅能够特异性地检测到细菌，且可完整地保持组织细胞及细菌的形态，将原位杂交和聚焦激光扫描电镜技术结合将有助于检测细菌的空间及时间分布情况[3]。
1.4 尿抗原的检测
Plouffe等报道了用免疫学方法检测LP血清I型尿抗原，证明此法特异性>99.5%敏感性80%～90%。
1992年Tang报道利用广谱ELISA法可同时对嗜肺及非嗜肺军团菌病患者尿抗原进行检测，敏感行高、特异性好，且有检测快速（3 h内可获结果）、标本容易获得的
优点。
Steinmetzs等报道可利用一种针对军团菌特异性抗原决定簇60KDaHSP的单克隆抗体检测尿军团菌抗原。
到现在还没找到合适的试剂盒，但这种方法是判断早期军团病最有效，最有发展的一种实验方法。
1.5 PCR及其相关技术的应用
近几年聚合酶链式反应（PCR）及其相关技术的发展为军团菌的检测提供了快速、敏感的方法。
PCR，可检测到每mL水中1cfu的细菌，无论标本细菌是死是活，都可以检测。
在培养中其他细菌掩盖军团菌生长和生产毒素抑制生长，PCR就不用担心以上情况的发生。
PCR法是将军团菌的特定目的基因在体外扩增上万倍，甚至几十万倍，扩增产物在含溴化已锭的琼脂糖凝胶上检测。
2 军团菌消毒方法
消毒方法的选择要根据军团菌所处的环境体条件（如pH值、温度、有机物及无机物含量和组成等）来定，适当的消毒方法才能达到理想的消毒效果。
当军团菌所在的水体中存在生物垢泥以及阿米八虫时，军团菌的除灭就比较困难，药剂的计入量和接触时间都需要成倍增加。
在实验室已发现某些藻类的提出物能刺激嗜可为军团菌的大量生长繁殖捕捉、聚集其所需的各种营养肺军团菌的生长，四膜虫可维军团菌在细胞内的生长，棘皮阿米巴的收缩性空泡，在有生物垢泥的条件下，消毒药剂的使用量要提高4倍才能达到效果。
现有对军团菌
的杀菌方法主要分两类：化学方法和加热法。
2.1 化学方法
主要是采用金属离子，如铜-银离子，氧化剂如卤素及其化合物包括氯、溴、碘，二氧化氯、氯胺盐和卤化乙内酰脲等，臭氧，和过氧化氢，非氧化剂包括杂环酮类，胍类，硫代氨基甲酸酯类等和紫外光。
Lin等研究了分别使用铜、银离子和公共使用铜银离子的杀菌效果，二者对军团菌都有较好的杀灭效果，但同时使用会有协同效应，杀菌效果更好。
目前，使用最多的是含氯制剂。
含氯制剂具有以下三个特色:(1)长效性；(2)腐蚀性;(3)产生消毒副产物。
有关文献报道，要达到持续抑制军团菌的效果，氯的浓度要在2～6 mg/L，这比传统的处理饮用水的氯浓度（≤1mg/L）高很多，相应的消毒副产物的量也就增多，而且由于使用含氯制剂易腐管道，空调系统过多使用含氯试剂可能会降低空调使用寿命。
因此使用含氯制剂不是最理想的。
许多有机药剂被用于军团菌的消毒，使用最广泛的是杂环酮类，以异噻唑啉酮类为代表。
但总的说来，非氧化剂效果不如氧化剂杀菌效果好。
嗜肺军团菌比其他革兰氏阴性菌对紫外线敏感，所以采用紫外线处理水中的嗜肺军团菌是可行的。
但用于紫外线无“余氯”效果，无法有效控制军团菌的再生，因此他的使用也受到了限制。
另外，电化学方法也被用来杀灭军团菌。
Chuanping Feng 等用Ti/RuO2作阳极涂层对冷却塔水进行电解，发现能有效控制军团菌。
但是电解消毒，其效果受pH值及
水硬度的影响。
pH值高或水硬度高其杀菌效果就不好,而空调冷却塔水的pH值及水硬度都比较高。
2.2 加热消毒法
此法广泛用于锅炉循环水系统的军团菌消毒。
有关文献报道，当水温增高到42 ℃时，大肠杆菌等受到抑制，而军团菌仍能存活。
水温65 ℃需要25 min才能完全杀死军团菌。
水温70 ℃可在10 min 内杀死该菌。
3 结语
直到现在，还没有一种防范措施可以有效控制水环境中的军团菌，而衡定的去除或控制人工水环境中的藻类、有机物和阿米巴等可能是控制军团菌的关键步骤。
参考文献
[1] 俞树荣.微生物学和微生物学检验[M].2版. 北京；人民卫生出版.
[2] 谢哲子.军团菌家族及其致病性[J].国外医学外生物学分册，1996，19（5）；23-25.
[3] 金建敏.军团菌研究进展[J].国外医学内科学分册,2001，28（10）.。
