SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量

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本次实验项目： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量

本次实验课时：8学时

实验类型：设计性

教学要求：

1． 用SDS－PAGE法测定样品中蛋白质相对分子质量；

2． 熟悉操作过程；掌握实验方法；明确实验原理。

3． 够根据实验目的进行整个实验过程的设计与操作，如标准蛋白质的选择、分离胶与浓缩胶浓度的确定与制备、灌胶、样品的处理、上样量及方法的选择、电泳时电压的控制、染色与脱色时间的确定、并能够对电泳过程中出现的问题加能解决，能够独立思考分析电泳结果，总结本实验成功与失败的原因。

重 点：

实验原理、整个实验过程的设计与操作，如标准蛋白质的选择、分离胶与浓缩胶浓度的确定与制备、灌胶、样品的处理、上样量及方法的选择。

教学手段及教具：课堂讲授，学生实验操作。

讲授内容及时间分配：

课堂讲授

1．相关知识…………………………………………………………… …… 0.1 学时

2．实验目的………………………………………………………………… … 0.3学时

3．实验原理…………………………………………………………………… 0.3 学时

4．实验操作 …………………………………………………… … 0.3 学时

实验教学

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量实验的操作技术……… 7 学时

参考资料

《生物化学实验》

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量（设计性）

相关知识

1.电泳？ 2.影响电泳速率的因素？ 3.SDS的作用？ 4.β－乙醇的作用？

2．聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：

3.分类：自然胶电泳、变性胶电泳、等电聚焦电泳、梯度胶电泳、双向电泳、印迹转移电泳。

4.不连续缓冲系统：SDS－PAGE电泳体系为不连续电泳体系。

5．分离胶浓度的选择和配制方法

SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围

蛋白质相对分子质量范围 分离胶的浓度

＜104 20% ~ 30%

1×104 ~ 4×104 15% ~ 20%

4×104 ~ 1×105 10% ~ 15%

1×105 ~ 5×105 5% ~ 10%

＞5×105 2% ~ 5%

*双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29。

常用的标准蛋白质的Mr

蛋白质名称 Mr（D） 蛋白质名称 Mr（D）

牛血清清蛋白 66200 牛胰凝乳蛋白酶原 25000

鸡卵清蛋白 43000 溶菌酶 14300

猪甲状腺球蛋白 669000 猪胃蛋白酶 35000

马心细胞色素c 12500 马肺铁蛋白 440000

牛肝过氧化氢酶 232000 牛心乳酸脱氢酶 140000

兔磷酸化酶B 97400 兔肌动蛋白 43000

胰蛋白酶抑制剂 20100 牛碳酸酐酶 31000

丙烯酰胺

甲叉丙烯酰胺 TEMED

过硫酸铵

聚丙烯酰胺凝胶

－

＋ 浓缩胶 pH 6.8

分离胶 pH8.8

Tris-Gly Tris-Gly pH8.3

ClPr Gly-

不同分离胶的配制方法

分离胶的浓度 20% !5% 12% 10% 7.5%

重蒸水 0.75 2.35 3.35 4.05 4.85

1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)/ml 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5

质量浓度为10%SDS/ml 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

凝胶贮备液(Acr/Bis)/ml 6.6 5.0 4.0 3.3 2.5

质量浓度为10% AP/ul ８0 ８0 ８0 ８0 ８0

TEMED/ ul 6 6 6 6 6

总体积/ml 10 10 10 10 10

5%浓缩胶的配制方法

注意：根据实验目的、实验要求、实验条件在实验前写出实验设计方案

一、 实验目的、实验要求、实验条件

实验目的

1． 用SDS－PAGE法测定样品中蛋白质相对分子质量；

2． 熟悉操作过程；掌握实验方法；明确实验原理。

实验要求

1.能够根据实验目的进行整个实验过程的设计与操作，注意几个设计点:

①如标准蛋白质的选择依据；②分离胶的确定与制备：浓度大小的依据是？分离胶配制量多少的依据是？③灌胶方法的选择？④上样量的确定：依据蛋白质浓度大小确定上样量，一般是样品在含1~6种蛋白且各占比例相当的情况下浓度在1~2mg/ml时、对凝胶大小在8×8.2时，上样量为10~20ul；⑤电泳时电压控制多大的选择；⑥能够对实验过程中出现的问题加能解决，能够独立思考分析电泳结果，总结本实验成功与失败的原因。

2．利用标准曲线计算出待测蛋白质样品的Mr。

实验条件

1．实验所需的实验试剂和材料。

2. 实验所需的主要实验仪器。

二、实验原理

带电颗粒在单位电场中泳动的速度称为迁移率或泳动度（mobility）。泳动度与带电颗粒所带静重蒸水 2.92

0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)/ml 1.25

质量浓度为10%SDS/ml 0.05

凝胶贮备液(Acr/Bis)/ml 0.8

质量浓度为10% AP/ul 40

TEMED/ ul 6

总体积/ml 5 电荷的数量、颗粒大小和形状有关。一般来说，颗粒所带静电荷的数量越多，颗粒越小，越接近球形，则泳动度越大。SDS即十二烷基硫酸钠（sodium dodycyl sulfate），是一种阴离子去污剂。由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的负电荷，能使不同种类蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质原有电荷的差异。在蛋白质溶解液中，加入SDS和巯基乙醇，由于巯基乙醇具有还原性，因此可使蛋白质分子中的二硫键还原，从而使具有四级结构的蛋白质分成单个亚基（subunit）；SDS则可使蛋白质的氢键、疏水键打开，引起蛋白质构象的变化，形成近似雪茄形的长椭圆棒状蛋白质-SDS复合物，不同种类蛋白质的蛋白质-SDS复合物的短轴相同，约为1.8nm，而长轴则与蛋白质的Mr成正比。这样，不同种类蛋白质的蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的泳动度不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度，也就是蛋白质的Mr有关。蛋白质的Mr越大，迁移率越小。研究表明，在一定的条件下，蛋白质Mr的对数（lgMr）与其Rf成负相关。在测定未知蛋白质的Mr时，可选用一组合适的标准蛋白以及适宜的凝胶浓度，与待测蛋白质样品同时进行SDS-PAGE，然后根据已知Mr蛋白质的电泳迁移率与其Mr的对数（lgMr）作出标准曲线，最后根据未知Mr蛋白质的电泳迁移率求得其Mr。单体丙烯酰胺（acylamide，Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide，Bis）在加速剂和催化剂的作用下可以聚合联结成具有三维网状结构的凝胶。常用的催化剂为过硫酸铵（AP），加速剂为四甲基乙二胺（TEMED）。

用途：亚基分子量测定、变性蛋白的分离。蛋白质纯化过程中的质量控制。

三、实验仪器、材料与试剂

（一）仪器：垂直板电泳槽；电泳仪；微量进液器等

（二）实验材料

１．自提取或市售蛋白质（酶，含量在2mg/ml）样品3种（１号，２号，３号）

2．标准相对分子质量（中）的蛋白质：内含已知相对分子质量的5种蛋白（各占比例相当的情况下浓度在1~2mg/ml）

（三）实验试剂

１．30%丙烯酰胺贮存液：称取丙烯酰胺29.2g，N，N-甲叉双丙烯酰胺0.8g，加dH2O至100ml。装于棕色瓶中，置4℃冰箱保存，30天内使用。丙烯酰胺和N, N’-亚甲双丙烯酰胺。以温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水配制含有29%（w/v）丙烯酰胺和1%（w/v）N, N’-亚甲双丙烯酰胺的贮存液，丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化的，故应核实溶液的pH值不超过7.0。这一溶液置棕色瓶中贮存于室温，每隔几个月须重新配制。

小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。

２.分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.8

18.15gTris（三羟甲基氨基甲烷），加约80ml重蒸水，用1mol/LHCl调pH到8.8，用重蒸水稀释至最终体积为100ml，置4℃冰箱保存。

3. 浓缩胶缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl缓冲液，pH 6.8

6gTris，加约60ml重蒸水，用1mol/L HCl调pH到6.8，用重蒸水稀释至最终体积为100ml，4℃冰箱保存。

4．十二烷基硫酸钠（SDS）：SDS可用去离子水配成10%（w/v）贮存液保存于室温。

5． TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)：市售溶液。TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。

6．10%（w/v）过硫酸铵（w/v）：提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基。须新鲜配制。

7．Tris-甘氨酸电极缓冲液：0.025mol/L Tris，0.192mol/L甘氨酸，0.1%SDS，pH8.3。

8．2倍还原样品缓冲液（2×reducing buffer）：总体积10ml

0.5mol/L Tris-HCl(pH 6.8) 2.5ml

甘油 2.0ml