基因工程实验报告
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基因工程实验报告
生命学院
生技114班
摘要：
一、本次试验内容概况如下：
（1）准备植物材料：小麦幼苗 （2）对基因进行双酶切，准备的载体进行双酶切，转移Top10菌株。
（3）进行PCR检测，查看检测结果是否成功，成功则证明转入了BL21菌株，进行表达过程。
（4）进行电泳。（目的蛋白的大小会知道，高诱导。证明符合预期结果。说明此区域该目的基因大量表达，其他区域目的基因没有大量表达。）
（5）用Weatern杂交去证明。因为载体是已知的，在相应位置杂交出杂带，证明的该目的基因确实克隆到了载体上，并且蛋白质进一步进行了表达。
二、实验流程：
用Trizol 法提取小麦总RNA→用RT-PCR技术扩增GAPDH截短体基因→用琼脂糖凝胶电泳进行片段胶回收→表达载体pGEX4T—1的构建→表达菌株转化→诱导表达→Western杂交
关键词：RNA提取、RT-PCR扩增目的基因cDNA、琼脂糖电泳、质粒提取、表达载体的目的片段的酶切、载体和外源DNA的连接、感受态细胞的制备及转化、重组质粒的筛选、鉴定及转化、目的基因诱导表达、Western Blotting检测、DNA的传化与回收、培养基制备和细菌培养
具体实验过程：
一、小麦总RNA提取
1、材料设备：小麦幼苗、高速冷冻离心机、低温冰箱、核酸电泳设备、液氮罐、研体、剪刀、镊子。
2、试剂：
（1）0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯）
（2）器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。
（3）无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶装重蒸馏水，按0.01%的DEPC（体积/体积），处理过后高压灭菌。
（4）Trizol
（5）75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。
（6）氯仿
（7）异丙醇
3、操作步骤：
（1）取400ug小麦，放在液氮中磨成粉末，每组100ug放入已经常有1mL的Triol液的EP管中，充分混匀。
（2）液氮挥发完之前，倒入含有1 毫升TRIpure的离心管中，迅速反复倒置混匀，室温放置5min。
（3）加入200ul氯仿，剧烈反复倒置混匀15s，室温放置5min。
（4）12000转下离心15分钟。
（5）吸管取约上清至新的EP管中（注意避免吸取界面上的蛋白）。
（6）加入500异丙醇混匀，温和颠倒混匀，放置10min。 （7）12000转下离心10分钟。
（8）倒掉上清，加入1ml75%乙醇洗涤涡旋混匀，12000转4度下离心5分钟。
（9）重复上述操作。
（10）倒掉上清，室温或真空干燥5min晾干。加入DEPC水30ul溶解RNA必要时放入55-60度水浴10min置于-70度保存。
RT-PCR扩增GAPDH目的基因
1、实验试剂：
（1）RNA 模板
（2）Olig（dT）18
（3）反转录缓冲液
（4）dNTP
（5）M-MULV 反转录酶
（6）RNA 抑制剂（RNasin）
（7）Premix EX Taq DNA 聚合酶
（8）PCR 特异引物
2、设备：PCR扩增仪、电泳仪、台式离心机、恒温水浴、微量转移器
3、操作步骤：
（1）RNA 的反转录
采用 Thermo Scientific（Fermentas） RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit
Total RNA 6µL（需加入 RNA 约 1mg）
Oligo dT primer 1µL
H2O（nuclease-free） 5µL
Total 12µL
65℃ 5min，补加下列试剂：
5× Reaction buffer 4µL
Ribolock RNase Inhibitor 1µL
10mM dNTP Mix 2µL
RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1µL
Tatal 20µL 42℃ 60min
70℃，5min，﹣20℃保存
（2） PCR 扩增目的基因
用表达引物扩增目的基因（25µL 体系）
2×PCR Mix 25μl 95℃ 1min
cDNA 2μl 95℃ 10s 35cycles
引物GAPDH1-1+GAPDH1-2 2μl 58℃ 65s
H2O 21μl 72℃ 10min
total 50μl 16℃ ∞
PCR扩增结果的凝胶电泳检测及胶回收
PCR胶回收：
（1）柱平衡步骤：向吸附柱CB2加入500ul的平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管得废液，将吸附柱重新放入收集管中。
（2）将单一的目的DNA片段从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中称重。
（3）向橡胶块中加入等体积的PC溶液，50摄氏度水浴10min左右，以确保期间不断的上下翻转离心管，以确保胶充分溶解。
（4）将上一步所得到的溶液加入一个吸附柱CB2中，12000rpm离心1min ,倒掉收集管的废液，将吸附柱放收集管中
（5）向吸附柱CB2加入600ul的漂洗液PW,12000rpm离心一分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中
（6）重复操作5
（7）将吸附柱CB2放入收集管中12000rpm离心2min，目地是将柱中的残余漂洗液去除，将吸附柱置于室温下数分钟，彻底晾干
（8）将吸附柱CB2放入干净离心管中，向吸附膜的中间部位加入50-100ul洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min收集DNA溶液。(注意洗脱液的体积应该不少于40ul)
回收产物的双酶切及电泳检测
1、试剂：
（1）BamHⅠ
（2）SalⅠ （3）BamHⅠ buffer
（4）质粒提取试剂盒
2、设备：电泳仪系统、紫外灯、恒温水浴箱
（1）PCR双酶切
经过上步骤可回收40ul的PCR反应液。然后继续进行以下操作：
PCR回收液 40ul
ddH2O 2ul
10×BamhI Buf 5ul
Sal I 2ul
BamhI 1ul
加样后混匀，37摄氏度恒温水浴锅中过夜
（2）电泳检测
从PCR酶切反应液中回收DNA
1、操作步骤：
（1）柱平衡步骤：向吸附柱CB2加入500ul的平衡液BL（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心1分钟，倒掉收集管得废液，将吸附柱重新放入收集管中。
（2）估计PCR反应液或酶切反应液的体积向其中加入等体积的PC溶液，充分混匀。
（3）将上一步所得到的溶液加入一个吸附柱CB2中，室温放置两分钟12000rpm离心1min ,倒掉收集管的废液，将吸附柱放收集管中
（4）向吸附柱CB2加入600ul的漂洗液PW,12000rpm离心一分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中
（5）重复操作4
（6）将吸附柱CB2放入收集管中12000rpm离心2min，目地是将柱中的残余漂洗液去除，将吸附柱置于室温下数分钟，彻底晾干
（7）将吸附柱CB2放入干净离心管中，向吸附膜的中间部位加入50-100ul洗脱缓冲液EB（如果回收的目的片段大于4kb,则洗脱缓冲液应放在65-70的水浴中加热），室温放置2min，12000rpm离心2min收集DNA溶液。(注意洗脱液的体积应该不少于40ul)
二、大肠杆菌质粒DNA的提取及凝胶电泳检测
1、试剂： （1）LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于1000mL蒸馏水中，用NaOH调pH至7.0。高压灭菌20分钟。
（2）LB平板培养基：在每1000mL LB液体培养基中中加入15g琼脂，高压灭菌20分钟。
（3）溶液P1：50mmol/L 葡萄糖,10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)。
（4）溶液P2：0.2mol/L NaOH,1% SDS。（必须新鲜配制）
（5）溶液P3：pH4.8的醋酸钾溶液（5mo1／L乙酸钾 60 ml，冰乙酸11.5 ml，水 28.5ml）。
（6）EB缓冲液
2、材料设备：含质粒的大肠杆菌、Eppendorf管、离心管架、10,100,1000μl液体加样器、台式高速离心机、摇床、高压灭菌锅。
3、操作步骤：
（1）培养细菌：
将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上，37℃培养24小时，然后从平板上挑取单菌落，接种于5ml液体培养基中，37℃培养12小时（老师做的）。
（2）提取步骤：
柱平衡步骤：向吸附柱CP3加入500ul的平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管得废液，将吸附柱重新放入收集管中。
①将菌液移入1.4ml 离心管，离心1分钟（1000rpm，18度），倒去上清液，再加入1.5ml 菌液，重复2次，倒转于滤纸除净残液。
②加入250μl预冷的溶液PⅠ(含10ug/μl RNAase)，用涡旋震荡器充分悬浮。
③加入250μl溶液P2，快速颠倒温和混匀6-8次。此时溶液应非常粘稠。
④加入350μl 预冷的溶液P3，温和混匀6-8次（此时应有白絮状沉淀），12000rpm离心10分钟。
⑤转移上清液至另一吸附柱CP3中注意不要吸出沉淀。12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
⑥向吸附柱CP3加入600ul的PW，12000rpm离心30-60秒倒掉收集管的废液，将吸附柱CP3放入收集管。
⑦重复步骤⑥
⑧将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm离心2min,目地是将柱中的残余漂洗液去除。
⑨将吸附柱CP3放入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加入50-100ul洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
