基因工程 实验报告
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基因工程实验报告
学号 姓名 1实验目的
（1）学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。
（2）学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法，检测质粒DNA的浓度与分子量。
（3）了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。
（4）学习利用限制性内切酶切割DNA的方法，并通过电泳检测酶切的效果。
（5）学习DNA重组技术中的核心步骤，DNA片段之间的体外连接方法。
（6）学习制备感受态细胞并将体外重组DNA引入受体细胞的技术。
（7）掌握利用蓝白斑筛选出转化子的方法。 2 实验原理
2.1质粒DNA提取的原理
菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而
发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条
件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，变性质粒DNA又恢复到原来
的构型；而线性的大分子量的细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等
形成不溶性复合物。当加入中和溶液后，质粒DNA能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留
在上清中；变形的蛋白质和DNA呈絮状，离心时可以沉淀下来。碱裂法获得的质粒DNA
经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀除去残余的蛋白质和RNA，所得纯化的质粒
DNA可满足实验要求。
2.2 PCR扩增功能基因的原理
将反应体系(模板DNA、引物1、引物2、Mg2+、4种dNTP和Taq DNA聚合酶)置于
高温(94℃)下变性，使模板双链DNA解链为两条单链。在低温(37~65℃)下退火，使引物与
模板链3’端结合，形成部分双链DNA。在中温(~72℃)下，通过Taq DNA聚合酶使引物从5’
端向3’端延伸，随着4种dNTP的掺入合成新的DNA互补链，完成第一轮变性、退火和聚
合反应循环。反复进行这种变性、退火和聚合反应循环，可使两端引物限定范围内的DNA
序列以指数形式扩增。循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上将一个目的DNA分子
经20轮扩增后，可达106。
2.3琼脂糖凝胶电泳检测DNA含量的原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶
孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向
正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分
子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分
离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。
SYBR Gold与DNA结合的亲和力高，且结合后能够极大的增强荧光信号。SYBR Gold
染料的最大激发波长为495nm，在300nm有第二个激发峰，其发射的荧光波长为537nm。
2.4 DNA的体外连接
DNA连接酶催化两个双链DNA片段5’端磷酸和3’端羟基之间形成磷酸二酯键。
2.5氯化钙制备感受态和转化大肠杆菌原理
把外源DNA分子导入到某一宿主细菌细胞的过程称为转化(transformation)。当细菌处
于容易吸收外源DNA的状态即感受态时，转化最易发生。常用的转化方法是用CaCl2处理
受体菌，使细菌细胞进入敏感的感受态。当细菌处于冰冻(0℃)的CaCl2溶液中，细菌细胞
膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羧基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收外源DNA。
2.6蓝白斑筛选重组质粒原理原理
lacZ编码β-半乳糖苷酶，受lac启动子调控，当E.coli菌株表达lac阻抑物，则载体上
的lacZ基因由IPTG诱导表达，表达形成的酶可以利用X-gal形成蓝色化合物。重组质粒中
lacZ插入失活导致不能形成蓝色菌落。 3 实验试剂及设备
3.1 实验设备
台式离心机、旋涡振荡器、恒温水浴锅、微波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶成像检测仪 、
超净工作台、 冰箱、恒温摇床、离心管、移液枪、枪头、冰盒、加样板、 量筒100 ml、
三角瓶500 ml 、培养皿、锥形瓶150 ml、烧杯 3.2 质粒DNA制备的试剂
（1）LB培养基：胰蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母膏5g，pH7.5，加水1L，高压灭菌。
（2）含pBluescript SK(-)质粒的大肠杆菌。
（3）100mg/ml氨苄青霉素水溶液。
（4）TE：10mmol/L Tris-HCl（pH7.8）—1mmol/L EDTA(pH8.0)。
（5）无菌超纯水。
（6）溶液II：1%SDS（电泳级）-0.2mol/L NaOH。
（7）溶液III：3mol/L 醋酸钠溶液（40.8gNaAc.3H2O溶于60mL水中，加入11.5mL
冰醋酸，定容至100Ml，高压灭菌，pH4.8。）
（8）20mg/mL RNA酶液。
（9）水饱和酚。
（10）70% 乙醇。
（11）异丙醇。
3.3 琼脂糖凝胶电泳的试剂
（1）琼脂糖1%
（2）加样缓冲液
（3）Maker
（4）电泳缓冲液（10X）：Tris242g，冰醋酸57.1ml，EDTA.Na2.2H2O 37.2g，加水至1L。
（5）SYBR Gold
3.4 PRC反应的试剂
（1）10XPCR反应缓冲液
（2）四种核苷酸混合物(dNTPs)，10mol/L
（3）寡核苷酸(PCR引物)
（4）模板DNA
（5）DNA聚合酶
3.5 酶切反应及质粒重组的试剂
（1）10X buffer
（2）酶：RcoRI、BamHI
（3）ddH2O
（4）DNA连接酶
3.6感受态的制备、大肠杆菌的转化和重组质粒的筛选的试剂
CaCl2、LB培养基、LB培养基-Amp、X-gal、IPTG。 4 实验步骤
实验整体流程如下：
4.1质粒DNA的制备
4.1.1质粒DNA的提取和纯化
（1）挑去LB固体培养基上的但菌落，接种于200mL LB（含相应抗生素）液体培养基
中，37℃、250r/min震荡培养过夜。
（2）取3mL培养物于微量离心管中，室温离心，去尽液体。
（3）将细菌沉淀重悬于200μl无菌水中，剧烈震荡，使菌体分散混匀。
（4）加入400μl新鲜配置的溶液II，轻轻颠倒数次混匀。
（5）加入300μl预冷的溶液III，颠倒数次，出现絮状白色沉淀后在冰上放置5min。
（6）12000r离心15min，小心将上清液转移至另一离心管中。
（7）向上清液中加入10μl RNA酶，37℃水浴酶切1h。
（8）向酶切后的上清液中加入等体积的饱和酚，反复混匀，12000r/min离心10min，
小心转移上清至另一离心管中。
（9）向上清液中加入等体积的氯仿，反复混匀，12000r/min离心10min，小心转移上
清至另一离心管中。
（10）向上清液中加入等体积的异丙醇，混匀，冰上放置5—10min。12000r/min 离心
10min，弃去上清，并将离心管倒置用滤纸吸干所有液体。
（11）用1ml 70%乙醇洗涤沉淀1—2次，12000r/min离心2min，弃去上清，室温晾干
是酒精充分挥发。
（12）将沉淀溶于40μl ddH2O，储存-20℃冰箱中。
4.1.2 琼脂糖凝胶电泳DNA检测
（1）制备琼脂糖凝胶：将胶框和梳子装配好，水平放置，将约20ml琼脂糖凝胶溶液
倒入胶框中，室温放置至凝胶凝固。
（2）将凝胶移入电泳槽中，去除梳子，加入足量的1X电泳缓冲液。
（3）取5μl质粒DNA样品与2μl加样缓冲液混匀，加入凝胶梳孔内，设置电压50V，
电泳30min。
（4）电泳结束后，取出凝胶，置于紫外投色仪中观察条带。
4.2 PCR扩增功能基因
4.2.1 PCR扩增基因
（1）按PCR反应体系加入试剂：
PCR反应体系
双蒸水 33.5 μl
10XPCR缓冲液 5 μl
Mg2+ 4 μl
dNTPs（10mol/L each） 4 μl
引物1 1 μl
引物2 1 μl
模板DNA 1 μl
DNA聚合酶 0.5 μl
（2）PCR扩增条件：
94℃，5分钟(预变性)
94℃，30秒
58℃，1分钟 35个循环
72℃，45秒
72℃，10分钟
（3）取5μl PCR产物按 3.1.2的操作步骤对功能基因进行琼脂糖凝胶电泳检测。 4.2.2 功能基因的纯化
（1）向扩增后的离心管中加入等体积的饱和酚，反复混匀，12000r/min离心10min，
小心转移上清至另一离心管中。
（2）向上清液中加入等体积的氯仿，反复混匀，12000r/min离心10min，小心转移上
清至另一离心管中。
（3）向上清液中加入等体积的异丙醇，混匀，冰上放置5—10min。12000r/min 离心
10min，弃去上清，并将离心管倒置用滤纸吸干所有液体。
（4）用1ml 70%乙醇洗涤沉淀1—2次，12000r/min离心2min，弃去上清，室温晾干
使酒精充分挥发。
（5）将沉淀溶于40μl ddH2O，储存-20℃冰箱中。
（6）取5μl功能基因水溶液按 3.1.2的操作步骤对纯化后的功能基因进行琼脂糖凝胶
电泳检测。
4.3 限制性酶切PCR产物及质粒
（1）酶切反应体系如下，在0.5mL离心管中加入个组分
PCR产物酶切体系 质粒DNA酶切体系
PCR产物 35μl 质粒DNA样品 20μl
10Xbuffer 5μl 10Xbuffer 4μl
RcoRI 2.5μl RcoRI 2.5μl
BamHI 2.5μl BamHI 2.5μl
ddH2O 5μl ddH2O 11μl
总反应体系 50μl
总反应体系 40μl
