基因工程实验报告

——凯

1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？（实验题目的总结）

答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。

2.如何正确使用微量移液器？（自己写的）

答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。

3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？

答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。

溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。

4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。（题目有歧义）

答：①取0.5g琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解；②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。

5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75）

答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否；

6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31）

答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。

7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？

答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。

基因工程实验报告

学号 姓名 1实验目的

（1）学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。

（2）学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法，检测质粒DNA的浓度与分子量。

（3）了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。

（4）学习利用限制性内切酶切割DNA的方法，并通过电泳检测酶切的效果。

（5）学习DNA重组技术中的核心步骤，DNA片段之间的体外连接方法。

（6）学习制备感受态细胞并将体外重组DNA引入受体细胞的技术。

（7）掌握利用蓝白斑筛选出转化子的方法。 2 实验原理

2.1质粒DNA提取的原理

菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而

发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条

件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，变性质粒DNA又恢复到原来

的构型；而线性的大分子量的细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等

形成不溶性复合物。当加入中和溶液后，质粒DNA能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留

在上清中；变形的蛋白质和DNA呈絮状，离心时可以沉淀下来。碱裂法获得的质粒DNA

经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀除去残余的蛋白质和RNA，所得纯化的质粒

DNA可满足实验要求。

2.2 PCR扩增功能基因的原理

将反应体系(模板DNA、引物1、引物2、Mg2+、4种dNTP和Taq DNA聚合酶)置于

高温(94℃)下变性，使模板双链DNA解链为两条单链。在低温(37~65℃)下退火，使引物与

模板链3’端结合，形成部分双链DNA。在中温(~72℃)下，通过Taq DNA聚合酶使引物从5’

端向3’端延伸，随着4种dNTP的掺入合成新的DNA互补链，完成第一轮变性、退火和聚

合反应循环。反复进行这种变性、退火和聚合反应循环，可使两端引物限定范围内的DNA

序列以指数形式扩增。循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上将一个目的DNA分子

总 论

基因是遗传的基本单位，所以基因工程有时称遗传工程(genetic engineering),有时还称为基因克隆(gene cloning)、分子克隆(molecular cloning)。基因工程的基本技术是DNA重组技术(recombinant DNA technigue)，其定义是在分子水平上，用人工方法提取(或合成)不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合，然后将体外重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达。按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给后代。了解这个概念要注意两个问题，第一就是必须有体外DNA的切割、连接、重组过程。第二，DNA重组必须是有目的的，按事先设计的过程进行，随意的切割、连接、重组过程不是基因工程。

一、DNA体外重组的主要步骤

DNA体外重组可分五个步骤。

(一)目的基因和载体基因的制备

制备带有目的基因的DNA片段和载体基因。

1．带有目的基因的DNA片段的获得

带有目的基因的DNA片段的获得，主要有两个途径：一是从已有的生物基因组中分离；二是用酶学或化学的方法合成。

从生物基因组中分离DNA片段主要是提取基因组DNA，对其进行酶切，获得特定的酶切片段。酶学合成目的基因DNA片段通常是以mRNA为模板，用反转录酶合成其cDNA作为克隆的片段。化学合成是对目的基因DNA片段在体外进行设计，并用化学方法进行合成，较大的基因一般分多段进行合成，并在体外连接成目的基因的片段。

目前，用聚合酶链反应(PCR)对目的基因进行扩增或对目的基因转录产物RNA进行RT-PCR扩增，也是获得带有目的基因DNA片段的最常用方法之一。

2．载体的选择

DNA体外重组所用的载体是可以克隆DNA片段的DNA分子。目前常用的载体类型有质粒、噬菌体和动物病毒等。其中以质粒载体最常用。

质粒(plasmid)是某些细菌中独立于染色体外的DNA，它有自主复制的能力，在细菌分裂时可伴随染色体分配到子细胞。它的存在与否，一般说来，对细胞的生存并没有决定性的影响。

实验一 从植物中提取DNA

【实验目的】

1、掌握提取DNA的技术及原理

2、学习DNA提取的方法

【实验原理】 首先研磨粉碎的植物组织在LP缓冲液裂解完全，基因组DNA被释放出来。在加入DA缓冲液沉淀后，去除大部分杂质。然后，由于加入的P Binding缓冲液中适当的盐分及pH值得作用下，DNA被特异吸附于Biospin膜上。通过洗涤，可将蛋白质等残留的杂质去除。最后使用Elution Buffer将DNA从膜上洗脱下来，从而获得基因组DNA。

【实验材料】 自己采取某种植物的叶子

1. 实验试剂 植物DNA提取试剂盒

【实验操作】

1. 剪取约0.2-0.5g叶片于冷研钵后，迅速倒入液氮用玻棒研磨成为粉末，分装到1.5ml的离心管中。

2. 加入450μl LP缓冲液，并混合均匀。

3. 于65℃环境下温浴15分钟，温浴中可间或震荡离心管2-3次，然后移出。

4. 加入150μlDA缓冲液，混合均匀后于冰浴中放置5分钟。

5. 将混合物全部转移至Shredder spin colum，于离心机中3分钟。

6. 将滤液转移至一个新的1.5ml离心管。

7. 加750μl P Binding缓冲液，并混合均匀。

8. 将混合液转移至Spin column。于离心机离心1分钟，弃去接液管中的液体。

9. 向Spin column中加入500μl的G Binding Buffer。离心30秒，弃去接液管中液体。

10. 向Spin column中加入600μl的Wash Buffer。离心30秒，弃去接液管中液体。

11. 重复步骤10一次。

12. 再次将Spin column离心1分钟，并将Spin column 转移至一个新的1.5ml离心管中。

13. 向Spin column中加入100μl的 Elution Buffer，并于室温温育1分钟。离心1分钟，取离心管中的液体含有DNA。