教学案例库(兽药残留检测部分-抗生素类检测).docx

教学案例库——兽药残留检测教学案例一磺胺类药物代谢产物残留的检测技术教学案例名称：猪肝中磺胺类药物代谢产物残留的检测教学案例描述：该案例主要讲解水产品中磺胺类药物代谢产物残留的检测方法，适用于进行该项目检测的食品企业，以及进行兽药残留检测项目教学的高职学校。

主要内容：1）猪肝中磺胺类药物代谢产物残留的检测意义2）猪肝中磺胺类药物代谢产物残留的检测方法3）高效液相色谱的使用4）检测报告的出具教学目标：1、知识目标1）熟悉磺胺类药物代谢产物的检测方法2）熟悉高效液相色谱的原理3）磺胺类药物代谢产物检测报告构成4）内标法及外标法定量2、能力目标1）正确进行溶液的配制和稀释2）熟练进行样品的制备3）熟练使用高效液相4）标准曲线的绘制5）独立完成磺胺类药物代谢产物的检测工作6）正确书写检测报告适用对象：高职学生知识准备：（一）磺胺类药物代谢产物的危害磺胺类药物是兽医临床上使用最广的一类化学合成抗菌药,主要用于细菌感染性疾病和某些原虫病的预防和治疗。

但使用不合理很容易造成组织中的残留和蓄积，许多国家和组织规定了其最高残留限量(MRL)为0.1μg/g,甚至不得检出。

在摄食残留有磺胺类药物的肉品是一个长期低剂量吸收磺胺类药物的过程，而细菌对磺胺药较易产生抗药性，当剂量、疗程不足时更易发生。

其中以葡萄球菌最易产生，其次为痢疾杆菌、大肠杆菌、肺炎球菌和链球菌，同时各种磺胺药间有交叉抗药性。

人体内蓄积到一定程度时，有严重的毒副作用，会破坏人的正常免疫机能和造血系统。

损害人体泌尿系统，容易在肾小管内析出结晶，损伤肾小管引起结晶尿、血尿、蛋白尿，重者可发生尿少、尿闭甚至尿毒症。

多数磺胺类药抗菌谱广，易抑制肠道正常寄生细菌的生长，造成某些维生素的缺乏。

此外，磺胺药还可抑制骨髓的造血功能，引起溶血性贫血和再生障碍性贫血等严重反应，还影响中枢神经系统，引起头晕、头痛、全身乏力等，并可引起恶心、呕吐等消化道症状，磺胺药也是较多引起药物过敏的药，严重者引起甚至可引起剥脱性皮炎。

兽药残留分析检测及应用案例--青岛科标生物实验室概述兽药残留是指用药后蓄积或存留于畜禽机体或产品(如鸡蛋、奶品、肉品等)中原型药物或其代谢产物，包括与兽药有关的杂质的残留。

兽药大致可归纳为四类：①一般疾病防治药；②传染病防治药；③体内、体外寄生虫病防治药；④（包括促生长药）。

范围畜禽机体或产品(如鸡蛋、奶品、肉品等)中原型药物或其代谢产物等；兽药中，常用的为安乃近、阿莫西林、氟苯尼考、头孢噻呋、土霉素、金霉素、杆菌肽、盐霉素、莫能霉素、粘菌素等20多种。

类别项目β-激动剂类盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特步他林硝基呋喃类呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因四环素类四环素、金霉素、土霉素、强力霉素、差向金霉素、去甲基金霉素、差向四环素、二甲胺四环素、差向土霉素、甲稀土霉素喹诺酮类西诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、二氟沙星、伊诺沙星、恩诺沙星、氟甲喹、洛美沙星、麻保沙星、萘啶酮酸、诺氟沙星、氧氟沙星、奥比沙星、恶喹酸、培氟沙星、吡哌酸、沙拉沙星、弗洛沙星、司帕沙星磺胺类磺胺苯酰、磺胺醋酰、磺胺喹恶啉、磺胺氯哒嗪、磺胺嘧啶、磺胺地索辛、磺胺多辛、磺胺胍、磺胺甲嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲恶唑、磺胺甲氧嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲唑、磺胺硝苯、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺索嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺氯吡嗪、甲氧苄啶大环内酯类林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉它霉素、交沙霉素青霉素类阿莫西林、氨苄青霉素、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、邻氯西林、萘夫西林、双氯西林、甲氧西林、阿洛西林氨基糖苷类链霉素，潮霉素B，双氢链霉素，壮观霉素，丁胺卡那霉素，卡那霉素，安普霉素，新霉素，妥布霉素，庆大霉素硝基咪唑类4-硝基咪唑、异丙硝唑、2-甲硝咪唑、洛硝哒唑、甲硝唑、氯甲硝咪唑、地美硝唑、苯硝咪唑、羟基甲硝唑、羟甲基甲硝咪唑其他氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素、孔雀石绿、无色孔雀石绿、结晶紫、无色结晶紫、氨苯砜、喹乙醇、金刚烷胺、地塞米松、利巴韦林、甲基睾丸酮、己烯雌酚、双烯雌酚、玉米赤霉酮、玉米赤霉醇、氯羟吡啶、尼卡巴嗪。

兽药残留检测项目本项目全面考察学生对高效液相色谱法检测禽畜肉中抗生素残留项目的实施过程中所涉及的样品预处理、样品检测（送至第三方检测机构进行，不作为考核点，但选手制备样品的回收率和RSD值将根据检测机构检测数据计分）、数据处理（提供统一打印图谱，考核选手根据图谱计算检测结果的能力）和离线色谱工作站操作4个环节的基本操作与过程的整体把握和运用能力以及在整个实验过程中的操作文明和操作安全意识。

本项目预处理现场操作要求每个参赛队员在2.5个小时内完成。

色谱工作站操作和数据处理分别要求在45分钟和60分钟内完成。

赛项为个人赛，包括农药残留检测、兽药残留检测、重金属污染检测共3个分项，每名选手分别选择其中一个项目进行比赛。

每位参赛选手可以有一名指导教师，参赛选手须为2016年新疆在籍同校高职学生。

以学校为单位组成参赛队，安排领队1名。

农残、兽残检测竞赛项目的试样前处理过程将由参赛人员现场操作完成（过程评分）。

试液的上机测定由赛项专家组安排第三方检测机构专家按规定统一进行（仪器操作不作为选手考核点）。

选手制备样品的回收率和RSD值将直接根据检测机构检测数据计分（结果评分）。

为了考核参赛选手图谱解读及数据处理能力，将提供统一的打印图谱，考核选手根据图谱计算回收率和RSD值等数据处理及正确填写检测记录单的能力（结果评分）。

此外，开展离线色谱工作站软件使用操作考核（色谱工作站软件由赛项专家组指定）（结果评分）。

重金属检测竞赛项目考察选手试样预处理（样品消解液由组委会提前准备好，样品消解不作为考核点）（过程评分）、上机测量（过程评分）、数据处理（结果评分）等全部过程。

竞赛流程（一）竞赛日程（二）竞赛各场次流程七、竞赛试题本赛项为公开试题项目。

八、竞赛规则1.限于竞赛场地设备等条件的制约，3个现场操作项目的竞赛需要分批进行，选手参加考试的批次和竞赛工位将通过抽签决定。

2.参赛选手必须带身份证和学生证，并佩带参赛证件，提前30分钟到候考室检录，在引导员带领下至相应赛场，按签号指定的位置就位，完成相应竞赛任务。

教学案例库一一兽药残留检测教学案例三抗生素残留检测技术教学案例名称鲜乳中抗生素的检测教学案例描述该案例主要讲解鲜乳中抗生素的检测方法，适用于进行该项目检测的食品企业，以及进行兽药残留检测项目教学的高职学校。

主要内容（1）鲜乳中抗生素的检测意义（2）鲜乳中抗生素的检测方法（3）链球菌抑制法（4）检测报告的出具教学目标知识目标（1）熟悉抗生素的检测方法（2）熟悉嗜热链球菌抑制法的原理（3）抗生素检测报告构成能力目标（1）正确活化菌种（2）熟练进行样品的制备（3）对观察结果进行判断（4）正确书写检测报告适用对象高职学生知识准备（一）抗生素的危害抗生素是一些微生物在生长发育过程中产生的化学物质（次级代谢产物）及其半合成或全合成衍生物。

主要用于养殖业，而且对人体能形成间接影响的兽药及药物添加剂主要有青霉素类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类、咲喃卩坐酮、卩奎乙醇、恩诺沙星等。

其中大环内酯类是鲜乳中较常见的抗生素，四环素是鲜乳中残留最多的抗生素，这些药品残留于鲜乳中构成对人类健康的一大危害。

抗生素残留会使人被动地接受并积累抗生素，对抗生素产生耐药性或交叉耐药性，导致抗生素无法控制人体感染细菌性疾病的后果。

有些“过敏”体质的人，长期饮用含有抗生素的奶品后会造成“过敏反应”，轻者引起皮肤瘙痒和尊麻疹。

重者引起急性血管性水肿和休克，严重的过敏病人甚至会导致死亡。

经常饮用含有抗生素残留的牛奶会破坏人体的肠道菌群平衡，引起各种胃肠疾病和生理紊乱。

如磺胺二甲咗唳能诱发人的甲状腺癌，氯霉素能引起人骨髓造血机能损伤，磺胺类药物能破坏人的造血系统等。

教学实施过程一、情境创设某乳制品加工企业检验部门对当天的原料鲜乳进行抗生素的检测，要求检测方法依据国家标准进行。

【问题导入】为什么要抗生素的检测?引出：1、鲜乳中抗生素残留的危害？2、抗生素残留的检测方法？【学生讨论】学生分组学习并讨论，得出问题答案。

【任务描述】准备组操作组数据组准备组操作组数据组准备组操作组数据组二、职责要求科长：负责检验流程的监督及检测报告的审批；组长：人员分工，各组工作的监督（摄像、照相），检测报告初审;准备组：负责检验材料、试剂、设备等的准备工作；操作组：负责仪器设备的检测操作数据组：负责样品信息的记录、检测结果的记录、报告单出具【学生活动】发放学习资料单“GBT 4789. 27-2008食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留检验”，分组学习及讨论。

动物源性食品中抗生素类药物残留检测方法（二）4.5.1 样液提取称取10 g均质好的试样于50 mL离心管中，加入-丙酮缓冲液20 mL，用涡旋振荡器充分振荡3 min，于70℃～75℃水浴保温20 min后，2000g离心15 min取上清液作为样液。

4.5.2 菌悬液的制备 4.5.2.1 ATCC9341菌悬液：将复活的菌种接种于盛有增菌用固体培养基的克氏瓶中，30℃培养18h～24 h后，用灭菌生理盐水洗下菌苔，制成菌悬液。

置29℃～8℃冰箱保存，储藏期15 d。

4.5.2.2 ATCC6633和蜡样芽胞杆菌ATCC11778菌悬液：将复活的菌种分离接种于盛有增菌用固体培养基的克氏瓶中，30℃培养7d，镜检芽胞数达80％以上(假如达不到，可再培养数日，如培养10 d以上，芽胞数仍达不到要求，菌种可能变异，不行用法)，用灭菌生理盐水洗下菌苔，使其悬浮于生理盐水中，65℃水浴加热30 min，经2000g离心20 min，弃去上清液，如此重复洗涤芽胞两次。

然后用适量灭菌生理盐水制成菌悬液。

置2℃～8℃冰箱保存，储藏期30 d。

4.5.3 检定用平板的制备 4.5.3.1 ATCC9341平板每批菌悬液按下法测定其最相宜用量：把不同浓度藤黄微球菌ATCC9341菌悬液加入AM5培养基中，30℃培养18 h后，使0.025 ug/mL标准工作液可产生14 mm±1 mm清楚、完整的抑菌圈。

无菌吸取1 mL相宜浓度的菌悬液加到100 mL融化后冷却至50℃左右的灭菌AM5中充分混匀后，取8 mL注入灭菌平皿内，保持水平使其凝固。

制备好的平板置2℃～8℃冰箱保存，储藏期2d～3d。

4.5.3.2 ATCC6633平板每批菌悬液按下法测定其最相宜用量：把不同浓度枯草芽胞杆菌ATCC6633菌悬液加入AM5培养基中，30℃培养18 h后，使0.5 ug/mL标准工作液可产生14 mm±1 mm清楚、完整的抑菌圈。

畜、禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定一、实验范围：本标准规定了畜、禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量的检测方法；本标准适用于各种畜、禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量的检测；本标准检出限为土霉素0.15mg/kg、四环素0.20mg/kg、金霉素0.65mg/kg；二、实验原理试样经提取、微孔滤膜过滤后，直接进样，用反相色谱分离紫外检测器检测，与标准比较定量，出峰顺序为土霉素、四环素、金霉素。

标准加法定量。

三、实验试剂3.1乙腈（分析纯）3.2 0.01mol/l磷酸二氢钠溶液：称取1.56g磷酸二氢钠溶于蒸馏水中定容到100ml，经微孔滤膜（0.45um）过滤，备用。

3.3 土霉素（OTC）标准溶液：称取土霉素0.0100g用0.1mol/l盐酸溶液溶解并定容10.00ml，此溶液每毫升含土霉素1mg。

3.4四环素（TC）标准溶液：称取四环素0.0100g（精确到0.001g）用0.01mol/l盐酸溶液溶解并定容10.00ml，此溶液每毫升含四环素1mg。

3.5 金霉素（CTC）标准溶液：称取金霉素0.0100g（精确到0.001g ）溶于蒸馏水并定容10.00ml，此溶液每毫升含金霉素1mg。

以上标准品均按1000单位/mg折算，3.3~3.5溶液应于4℃以下保存，可使用一周。

3.6 混合标准溶液：取3.3、3.4标准溶液各1.00ml，取3.5标准溶液2.00ml，置于10ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，此溶液每毫升含土霉素、四环素各0.1mg，金霉素0.2mg，临时现配。

3.7 5%高氯酸溶液四、实验仪器高效液相色谱仪（HPLC）：具紫外检测器五、色谱条件：5.1 柱：ODS-C18（5um）6.2mm×15cm5.2 检测波长：355nm5.3灵敏度：0.002AUFS5.4柱温：室温5.5 流速：1.0ml/min5.6进样量：10ul5.7:流动相：乙腈+0.01mol/l磷酸二氢钠溶液（用30%硝酸溶液调节PH2.5）=35+65，使用前用超声波脱气10min。