机能实验dic
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家兔急性弥漫性血管内凝血（DIC）
摘要目的：掌握动物实验常用技术，学习复制弥漫性血管内凝血（DIC）动物模型，通过血小板计数、纤维蛋白原含量的测定、血浆鱼精蛋白副凝试验（3P试验）等血液学指标的实验结果，进一步探讨DIC的发病机制。
方法：通过给家兔颈静脉缓慢注射4%兔脑粉溶液制作DIC动物模型，使用PcLab数据采集系统采集家兔DIC前后的动脉压、静脉压和脉压等生理指标。
DIC前后分时段采血进行血小板计数、纤维蛋白原含量测定和3P试验等血液学指标的测定。
结果：通过注射4%兔脑粉溶液制作DIC模型后，家兔的血压、呼吸等生理指标明显下降，血小板的数量和纤维蛋白原含量等血液学指标逐渐降低，3P试验由阴性转化为阳性。
关键词：家兔DIC模型；血小板计数；纤维蛋白原含量测定；3P试验
前言：DIC是在某些严重疾病基础上，由特定诱因引发的复杂病理过程。
致病因子引起人体凝血系统激活、血小板活化、纤维蛋白沉积，导致弥散性血管内微血栓形成；继之消耗性降低多种凝血因子和血小板；在凝血系统激活的同时，纤溶系统亦可激活，或因凝血启动而致纤溶激活，导致纤溶亢进。
临床上多以出血、休克、多器官功能衰竭（MODS）以及血管病性溶血等为突出表现[1]。
实验用兔脑浸液经耳缘静脉注入家兔体内，能复制成家兔实验性DIC，将在动物身上获得的资料和结果与人类疾病表现进行比较与分析，从而阐明DIC的发生机理, 揭示疾病发生发展的规律，为临床疾病诊断和治疗提供理论依据[2]。
我们小组通过静注兔脑粉溶液复制DIC 动物模型，并在DIC前后分时段采血进行血小板计数、纤维蛋白原含量测定和3P试验等血液学指标的测定，以观察DIC前后家兔的血液学变化，从而进一步了解DIC的发病机制。
1.实验材料：
1.1动物：家兔1只，体重
2.0kg。
1.2一般器械：粗剪刀、止血钳8把、组织剪、眼科剪、眼科颞（弯、直各1把）、组织镊、手术线2条、培养皿、50ml注射器、25ml注射器、10ml注射器、5ml注射器、EP管6个、血细胞计数版、试管8个、注射针头2个、加样枪、枪头若干。
1.3药品和试剂：20%乌拉坦、0.1%肝素、4%兔脑粉、37℃生理盐水、37℃饱和氯化钠溶液、1%硫酸鱼精蛋白、血小板稀释液。
1.4仪器设备：PcLab计算机生物信号采集处理系统、压力换能器、动静脉插管、三通管、37℃水浴箱、离心机、分光光度仪。
2.实验步骤：
2.1家兔的捉拿、称重、麻醉与固定：捉拿家兔，称量体重，用10.0ml20%乌拉坦（5ml/kg）由耳缘静脉缓慢注射，注射期间注意观察呼吸频率、肌张力、疼痛反射和角膜发射的变化，待家兔四肢呼吸平稳，肌肉松弛，疼痛反射和角膜反射消失后，将其仰面固定于手术台上后颈部剪毛备皮。
2.2颈动脉的分离与插管：沿甲状软骨下正中剪开皮肤，分离左侧颈动脉，经左侧颈动脉插入动脉管，观察并通过PcLab计算机生物信号采集处理系统记录家兔此时的血压和呼吸。
2.3取血样本：通过动脉插管取4ml动脉血（动脉血①）置于有肝素的注射器中，以测定3P试验、纤维蛋白原、血小板计数并记录。
2.4颈静脉的分离与插管：分离右侧颈静脉，经右侧颈静脉插入静脉管，以备补液和复制DIC模型。
2.5复制DIC模型：将4.0ml4%兔脑粉溶液（2ml/kg）与16ml生理盐水混匀，沿家兔的耳缘静脉缓慢注射兔脑粉溶液，时间控制在10min以内。
以备血液学指标的测定
2.6 15min后观察并通过PcLab计算机生物信号采集处理系统记录家兔的血压和呼吸，抽取4ml动脉血（动脉血②）置于有肝素的注射器中，以测定3P试验、纤维蛋白原、血小板计数并记录。
2.7 45min后观察并通过PcLab计算机生物信号采集处理系统记录家兔的血压和呼吸，抽取4ml动脉血（动脉血③）置于有肝素的注射器中，以测定3P试验、纤维蛋白原、血小板计数并记录。
2.8 空气栓塞法处死家兔。
3.测量指标：
3.1血小板计数：
3.1.1取20µl全血，加入0.38ml血小板稀释液中混匀。
3.1.2用加样枪取一小滴滴到血球计数板内，静置5min。
3.1.3在显微镜下数出5个中方格内的血小板数并记录，血小板数为所数值×109个。
3.2.纤维蛋白原含量测定
3.2.1取全血置于EP管中，在5000rpm，3min的条件下离心，分别取0.3ml血浆置于两个试管中，做好标记。
3.2.2取血浆0.3ml置于试管中，加入饱和氯化钠溶液2.7ml,充分混匀，置37℃水浴中孵育3min，作为实验组。
3.2.3取生理盐水0.3ml置于试管中，加入饱和氯化钠溶液2.7ml,充分混匀，置37℃水浴中孵育3min，作为对照组。
3.2.4用分光光度计测量OD520nm，以对照组调零后，测量并记录实验组光密度，计算纤维蛋白原含量，即实验组光密度值×20g/L。
3.3血浆鱼精蛋白副凝试验（3P试验）
3.3.1取全血置于EP管中，在5000rpm，3min的条件下离心，分别取0.3ml血浆置于两个试管中，做好标记。
3.3.2取血浆0.4ml置于试管中，加入0.1ml 1%硫酸鱼精蛋白液混匀。
3.3.3室温下静置30min后摇动试管，出现白色纤维或凝块者为阳性，均匀浑浊而没有出现白色纤维者为阴性。
4.实验结果：
DIC前后家兔各项指标的观察与记录
“+”：阳性；“-”：阴性。
5.结果讨论：
5.1 将家兔各项正常生理指标及血液学指标与DIC后15min时相对应的各项指标比较发现：
5.1.1家兔的舒张压和收缩压均有一定程度的下降，可能与发生DIC后导致的循环系统衰竭有关。
5.1.2呼吸频率增加，可能是因为循环衰竭，引起的血中CO2分压的增加，从而导致呼
吸中枢的兴奋。
5.1.3血小板数目减少，即血小板被消耗，说明DIC后凝血系统被激活。
5.1.4纤维蛋白原含量增加，即凝血因子被释放，说明DIC后凝血系统被激活。
5.1.5 3P试验结果阳性，是纤维蛋白单体再聚合成不溶性的纤维状或絮状的纤维蛋白
丝沉淀所致，说明DIC后血浆中的纤维蛋白单体增多，DIC后凝血系统被激活。
5.2将家兔各项正常生理指标及血液学指标与DIC后45min时相对应的各项指标比较发
现：
5.2.1家兔的舒张压和收缩压均进一步降低，可能与发生DIC后导致的循环系统衰竭有
关。
5.2.2呼吸频率增加，可能是因为循环衰竭，引起的血中CO2分压的增加，从而导致呼
吸中枢的兴奋。
5.2.3血小板数目持续减少，即血小板继续被消耗。
5.2.4纤维蛋白原含量增加，即说明继发凝血因子被消耗。
合并血小板减少这一现象，
将会导致出血加剧。
5.2.5 3P试验结果强阳性，说明DIC后血浆中的纤维蛋白单体持续增多。
6.实验结论：
6.1 DIC与休克的关系：
6.1.1 DIC引起休克：低血压或休克是DIC早期的主要临床表现，尤其在急性DIC极易
发生休克；休克晚期微循环改变主要表现为微循环麻痹、扩张，对血管活性物质无反应，微血管中出现弥散性血管内凝血（DIC），并有广泛性出血、组织细胞的变性坏死，机体因此发生多器官衰竭。
6.1.2休克引起DIC：引起休克的病因与引起DIC的病因大多相似，且休克引起的微循
环障碍，血流缓慢、瘀滞、缺氧、酸中毒等均容易促使DIC的发生。
6.1.3 DIC与休克的辩证关系：DIC和休克之间相互促进。
DIC起低血压或休克，使微
循环衰竭加剧，又促进了DIC的发展，加重了DIC对机体的损伤。
两病理过程互为因果，形成恶性循环[3]。
6.2弥散性血管内凝血（DIC）的分期及治疗：
6.1.1高凝期：又称弥漫性微血栓形成期。
病初，机体的凝血活性增高，以微血栓形成
为主要特点，加之血小板的粘附性增高，各脏器微循环可有严重程度不同的微血栓形成。
因此，该期治疗应在于抑制广泛性微血栓形成，防止血小板及各种凝血因子进一步消耗，即治疗以抗凝为主。
6.2.2消耗性低凝期：该期主要特点为大量凝血因子的持续消耗和血小板的减少，且继
发性纤溶功能增强。
因此会出现严重程度不等的出血症状，也可能有休克或某脏器功能障碍的临床表现。
该期微血栓形成仍在进行，抗凝治疗仍然非常重要，但因凝血因子的进行性消耗，故应补充血小板和凝血因子。
6.2.3继发性纤溶亢进期：该期微血栓形成已基本停止，主要特点为继发性纤溶亢进。
大多有严重程度不同的临床出血症状，严重病人有休克及多器官功能障碍综合症（MODS）的临床症状。
若临床确认纤溶亢进是出血首要原因，则可适量应用抗纤溶药物，同时，由于凝血因子和血小板消耗，也应积极补充[4]。
参考文献
[1] 陆晓华，程礼敏，李伟，等. 弥散性血管内凝血的新认识及实验诊断进展[J]. 检验医学与临
床,2012(10):1229-1231.
[2] 李秀华，张兆龙，杨海萍，等. 用兔脑粉浸液复制弥散性血管内凝血(DIC)[J]. 内蒙古医学杂
志,1997(04):204-205.
[3] 金惠铭. 纤维连接蛋白及其与败血症、休克、DIC的关系[J]. 中国病理生理杂志,1986(03):164-170.
[4] 李君君，陈方平，颜家运，等. 弥散性血管内凝血早期诊断的实验研究[J]. 临床血液学杂志,2003(02):82-84.。
