革兰氏染色标准操作程序

PH1237|标准革兰氏染色液Standard Gramˊs StainCatalog No：PH1237Size：☐4×100mL|☐4×250mL Store at RT简介革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，亦是一种复染法。

未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。

染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，用以分类鉴定。

通过此法染色可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G+)和革兰阴性菌(G-)两大类。

细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。

经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。

在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。

红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。

在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。

Standard Gramˊs Stain采用最经典的革兰染色配方,临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。

组份名称4×100ml4×250ml Storage试剂(A):结晶紫染色液100ml250ml RT避光试剂(B):Gram碘液100ml250ml RT避光试剂(C):脱色液100ml250ml RT试剂(D):沙黄染色液100ml250ml RT避光自备材料1、接种环或挑取细菌的其他工具2、酒精灯3、载玻片4、光学显微镜操作步骤(仅供参考)：1、涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，混合均匀，涂成一薄层。

细菌鉴定流程细菌鉴定细菌形态学鉴定16S rDNA 鉴定生理生化鉴定一、细菌形态学鉴定1.从-80˚Ϲ冰箱中取出菌株放4˚Ϲ复苏，轻柔混匀后用接种环接一环菌液在培养基平板上划线活化，根据菌株来源选择适宜的培养基。

2.放入培养箱倒置培养，实验室一般采用28˚Ϲ培养，特殊菌株依据该菌最适条件（时间、温度）培养24-48h。

3. 纯化：从活化培养基平板上挑取单菌落继续划板培养。

4. 观察记录菌落形态特征：大小（mm）、形状、干湿、透明度、颜色、边缘整齐还是，，，，，，，形状干湿透明度颜色边缘细菌大小（mm）注意事项：①接种划线应在酒精灯旁边操作②培养时应倒置培养，防止污染二、革兰氏染色1.涂片固定将纯化后的菌株进行革兰氏染色，滴一滴生理盐水于载玻片上，无菌条件下用接种环挑取少量菌落均匀涂布水滴中，使其自然干燥，菌面向上，经火焰固定。

注意事项：菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定。

固定时通过火焰1~2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

2.染色一般包括初染、没染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：（1）加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。

（2）加上碘液染色1分钟，水洗。

（3）加上95%酒精，摇动玻片，根据涂片厚度，脱色约20~60秒，水洗，吸去水分。

（4）加上蕃红后，染色1分钟，水洗。

（5）吸干或在空气中晾干后，油镜镜检。

3.结果观察：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。

以均匀分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，都常呈现假阳性。

注意事项：①标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。

若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。

②玻片通过火焰温度不能太高。

③碘液变透明，则不能使用。

④水洗时动作要轻，沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗，以免把菌体冲掉。

三、16S rDNA 鉴定（16S rDNA只能鉴定到属，需进行生理生化、药敏实验等鉴定到种）1. 细菌复苏、活化、纯化同细菌形态学鉴定3. 挑取单菌落至少2-3个接到含有1ml灭菌纯水的1.5ml离心管中混匀。

革兰氏染色及镜检SOP1. 目的规范革兰氏染色及镜检的标准操作规程，确保试验的准确性。

2. 范围本标准适用于革兰氏染色及镜检的操作。

3. 定义3.1.革兰氏阳性菌（G+）：G+的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成。

在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色，因此呈蓝紫色。

3.2.革兰氏阴性菌（G-）：G-的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高。

当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。

4. 职责4.1.QC负责本规程的起草、修订、培训及执行。

4.2.QA、QC组长、质量管理部经理负责本规程的审核。

4.3.质量总监负责本规程的批准。

4.4.QA负责本规程执行的监督。

5.引用标准无6. 材料6.1.仪器、实验用具：显微镜、载玻片、酒精灯、接种环。

6.2.试剂与配制革兰氏染色液、95%乙醇、香柏油、二甲苯和0.9%氯化钠溶液。

结晶紫溶液：称量2g结晶紫于研钵内研磨至粉末，将粉末倒入100ml烧杯中，量取95%乙醇20ml 将其溶解；草酸铵溶液：称量0.8g草酸铵于200ml烧杯中，量取80ml纯化水将其溶解；结晶紫染色液：将配好的结晶紫溶液倒入草酸铵溶液中，混匀，静置24h后过滤即成结晶紫染色液；此液不易保存，如有沉淀出现，需重新配制。

碘化钾溶液：称量2gKI粉末，转移至200ml烧杯中，量取100ml的纯化水将其充分溶解；碘溶液：称量1g碘颗粒于研钵内研磨至粉末，将粉末倒入500ml烧杯中，量取200ml纯化水倒入并碘染液：将配好的碘化钾溶液倒入碘溶液中，混匀即成。

配成后贮于棕色瓶内备用，如变为浅黄色即不能使用。

沙黄溶液：称量0.25g沙黄于200ml烧杯中，量取95%乙醇10ml将其溶解；沙皇（番红）复染液：待沙黄溶液完全溶解后加纯化水定容至100ml，混匀即成。

细菌革兰氏染色法1.目的为镜检细菌形态结构提供样本2.范围适用于实验室常见细菌的抹片制备及染色3.采样对接人服务专家针对病死猪进行解剖根据临床症状采集相应的病料。

4.设备和材料无菌剪刀、无菌手术刀、无菌试管、无菌生理盐水、无菌平皿、三角烧瓶、酒精灯、接种环、打火机、75%酒精棉球、一次性手套、营养琼脂培养基、5％石炭酸液；；碘片；碘化钾； 95％酒精；碱性复红粉末；显微镜；试管架；酒精灯；接种环；药匙；称量纸；电子称；待试菌；灭菌蒸馏水；吸水纸；香柏油；灭菌玻片、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、打火机、擦镜纸、计时器5、采样及送样操作采集：病料新鲜度→无菌操作采样→有目的进行采样→保证组织完整性→独立存放到封口袋中并做好标记。

运输：采集好病料放入保温箱（泡沫纸箱+冰袋）中，冷藏即可，不可冷冻。

样品的标识要求有样品编号、样品名称、样品来源、样品数量、初步诊结果抽样日期及周龄、检测项目等内容。

6、细菌分离在无菌操作条件下，将待测病料（含有典型临床症状部分）用平板划线分离法接种于普通营养琼脂培养基或特殊培养基上（血琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂、BP琼脂等），于37℃±1℃恒温培养箱中培养18-24h后备用。

7、操作步骤7.1细菌抹片的制备1、玻片准备：载玻片应清晰透明，洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。

如有残余油迹，可按下列方法处理：2、滴上 95％酒精 2～3 滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯上轻轻脱过几次。

3、若上述方法未能去除油渍可再滴 1～2 滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯上轻轻通过。

4、抹片：所用材料不同，抹片方法亦有差异5、液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳液）可直接用灭菌接种环取一环材料与玻片的中央均匀涂成适当大小的薄层。

6、不是液体材料（如菌落、脓、粪便等）则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置与玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。

革兰氏染色法操作规程编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（革兰氏染色法操作规程）的内容能够给您的工作和学习带来便利。

同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。

本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为革兰氏染色法操作规程的全部内容。

革兰氏染色法操作规程1目的建立革兰氏染色法操作规程，确保革兰氏染色法操作规范化、科学化。

2范围适用于用革兰氏染色法对细菌进行分类和鉴定。

3职责3.1检验员:负责按本规程进行革兰氏染色操作.3。

2 QC主管、质量部经理：负责监督。

4内容4.1仪器与用具酒精灯、洁净的盖玻片、接种环、滴管、生物显微镜.4.2材料4。

2。

1试剂结晶紫、番红、碘化钾、碘、95%乙醇、草酸铵、香柏油。

4。

2.2试液及配制方法4.2。

2。

1 结晶紫染色液：称取结晶紫2g,溶于20ml 95％乙醇中；称取草酸铵0。

8g，溶于80ml水中；将两种溶液混合，静置48h后使用.4.2.2.2碘染色液：称取碘化钾2g，加5～10ml水使充分溶解，加碘1g，待完全溶解后，加水至300ml。

4.2.2.3 番红复染液：称取番红0.25g溶于10ml 95%乙醇中，然后加水100ml。

4。

3操作步骤4。

3.1 样品固片取一干净的载玻片，用接种环挑取一环无菌水于载玻片中,挑取少量菌于生理盐水中涂片或直接滴一滴待检菌在盖玻片中央，自然干燥固定.4。

3.2 初染滴加结晶紫染液于已固定的涂片上，染1min，用水冲洗、甩干。

4。

3。

3 媒染滴加碘染色液，液作用1min，用水冲洗、甩干。

4.3.4 脱色滴加95％乙醇脱色,置白色背景下，侧动盖玻片,直至无紫色脱落为止(约为20—30秒），立即用水冲洗、甩干。

4.3.5 复染滴加番红复染液,染1-2 min，用水冲洗、甩干.4.3.6 镜检置油镜下观察。

革兰氏染色液操作步骤及注意事项－资料类关键信息项1、染色液的组成成分结晶紫染液碘液脱色液（乙醇或丙酮溶液）复染液（沙黄染液或番红染液）2、操作所需的器材载玻片酒精灯接种环显微镜染色缸吸水纸3、样本的准备要求细菌培养物的新鲜程度培养物的浓度涂片的厚度和均匀度4、染色的具体步骤初染媒染脱色复染5、操作过程中的注意事项染液的使用量和作用时间脱色程度的控制避免染液干燥样本的固定6、结果的观察与判断标准革兰氏阳性菌的染色特征革兰氏阴性菌的染色特征不确定结果的处理方法1、引言革兰氏染色法是细菌学中广泛应用的一种鉴别染色法，通过此方法可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。

为了确保革兰氏染色的准确性和可靠性，特制定本操作步骤及注意事项协议。

11 适用范围本协议适用于使用革兰氏染色液对细菌进行染色的实验操作。

2、染色液的组成成分21 结晶紫染液由结晶紫、乙醇和草酸铵溶液组成，用于初染，使细菌染上结晶紫的颜色。

22 碘液由碘和碘化钾组成，用于媒染，增强结晶紫与细菌细胞的结合力。

23 脱色液通常为乙醇或丙酮溶液，用于脱色，使革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌呈现出不同的颜色反应。

24 复染液常见的有沙黄染液或番红染液，用于复染，使革兰氏阴性菌染上复染液的颜色，增强对比。

3、操作所需的器材31 载玻片要求洁净、无油脂和划痕，以便于细菌涂片的制作和观察。

32 酒精灯用于加热固定细菌涂片，使其牢固地附着在载玻片上。

33 接种环用于挑取细菌培养物，制作涂片。

34 显微镜用于观察染色后的细菌形态和颜色，以判断其革兰氏染色结果。

35 染色缸用于分别容纳不同的染色液，保证染色过程的有序进行。

36 吸水纸用于在染色过程中吸干多余的染液，保持涂片的清洁。

4、样本的准备要求41 细菌培养物的新鲜程度应使用新鲜培养的细菌，通常培养 18 24 小时的细菌染色效果最佳。

42 培养物的浓度细菌浓度不宜过高或过低，过高会导致涂片过厚，影响观察；过低则可能导致染色结果不准确。

微生物学实验一、选择题1.革兰氏染色的关键操作步骤是：A.结晶紫染色B.碘液固定C.酒精脱色D.复染答:( )2.放线菌印片染色的关键操作是：A.印片时不能移动B.染色C.染色后不能吸干D.A和C答:( )3.高氏培养基用来培养：A.细菌B.真菌C.放线菌答:( )4.肉汤培养基用来培养:A.酵母菌B.霉菌C.细菌答:( )5.无氮培养基用来培养:A.自生固氮菌。

B.硅酸盐细菌C.根瘤菌D.A、B均可培养E.A、B、C均可培养答:( )6.在使用显微镜油镜时，为了提高分辨力，通常在镜头和盖玻片之间滴加:A.二甲苯B.水C.香柏油答:( )7.常用的消毒酒精浓度为:A.75%B.50%C.90%答:( )8.用甲醛进行空气熏蒸消毒的用量是:A.20ml/M3B.6ml/M3C.1ml/M3答:( )9.实验室培养基高压蒸汽灭菌的工艺条件是:A.121℃/30minB.115℃/30minC.130℃/30min答:( )10.巴氏消毒的工艺条件是:A.62-63℃/30minB.71-72℃/15minC.A.B.均可答:( )11.半固体培养基的主要用途是:A.检查细菌的运动性B.检查细菌的好氧性C.A.B.两项答：( )12.半固体培养基的琼脂加入量通常是:A.1%B.0.5%C.0.1%答:( )。

13.使用手提式灭菌锅灭菌的关键操作是:A.排冷气彻底B.保温时间适当C.灭菌完后排气不能太快D.A-C答:( )。

14.目镜头上的“K”字母表示:A.广视野目镜B.惠更斯目镜C.补偿目镜答:( )15.目镜头上的“P”字母表示:A.平场目镜B.广视野目镜C.平场补偿目镜答:( )16.物镜头上的“PL”字母表示:A.正低相差物镜B.正高相差物镜C.负高相差物镜答:( )17.物镜头上的“UVFL”字母表示。

A.无荧光物镜B.照相物镜C.相差物镜答:( )18.镜头上标有“TC”字母的镜头是:A.相差调整望远镜B.摄影目镜C.相差目镜答:( )19.“PA”表示:A.马铃薯培养基B.高氏培养基C.肉汤培养基答:( )20.无菌室空气灭菌常用方法是:A.甲醛熏蒸B.紫外灯照射C.喷石炭酸D.A.B.并用答:( )21.干热灭菌的关键操作是:A.灭菌物不能有水B.保温过程中不能开箱门C.降温不能太快答:( )22.霉菌水浸制片的关键操作是：A.菌丝要分散B.菌丝首先要用50%的乙醇浸润C.盖盖玻片不能有气泡D.A-C答：（）23.加热法染芽胞的染料通常是:A.孔雀绿B.结晶紫C.复红D.蕃红答:( )24.复红法染鞭毛的关键操作是:A.玻片干净B.染料新鲜C.菌体活化适当D.A、B、C答:( )25.镀银法染鞭毛的关键操作是:A.玻片干净B.染料无沉淀C.加热适当D.菌体活化适当E.A-D答:( )。

革兰氏染色一、目的：在细胞发放之前，利用标准的革兰氏染色法对即将发放的细胞悬液进行检测，判断细胞悬液中是否含有革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。

二、原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

三、实验用品准备：灭菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul灭菌移液吸头、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器四、操作：1 涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。

2 干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。

3 固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。

4 初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

5 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

6 媒染：用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。