第三十七章 转录后加工

锥体虫COXIII mRNA前体在编 辑过程中插入大量的尿苷酸
gRNA介导的编辑过程
小肠上皮细胞内发生的Apo B蛋白的Pre-mRNA的编辑
编辑的意义
利什曼原虫细胞色素b mRNA通过编辑创造终止密码子
rRNA前体的后加工
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细菌-剪切、修剪和修饰 真核生物 1)剪切、修剪和修饰 （需要snoRNA） 2)剪接 （某些真核生物，如四膜虫）
细菌rRNA前体的后加工
真核细胞核rRNA前体的后加工
由snoRNA 指导的rRNA前体的修饰
snoRNA指导的2′-O甲基化核糖和假尿苷形成
四膜虫rRNA前体的自我剪接
tRNA前体的后加工
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细菌 1) 剪切和修剪 2) 修饰 3) 添加CCA (如何需要) 真核生物 1) 剪切和修剪 2) 修饰 3) 添加CCA 4) 剪接(某些真核生物)
加尾反应由两步组成：
1. 剪切——在3′-UTR一个特定序列上游10-30 核 苷酸序列的位置切开 2. 添加腺苷酸（100-200个）产生多聚A尾巴
加尾信号
真核细胞核mRNA前体的加尾反应
为什么必须有尾巴？




保护mRNA免受3′-外切核酸酶的消化，提高 mRNA的稳定性。 PABP能够与帽子相互作用增强mRNA的可翻 译性，提高其翻译的效率； 影响最后一个内含子的剪接； 某些本来缺乏终止密码子的mRNA通过加尾 反应创造终止密码子。在UG后加尾可产生 UGA，在UA后加尾产生UAA； 通过可变加尾调节基因的表达。
第三十七章 转录后加工
提纲
一．
细菌的转录后加工
mRNA前体的后加工 rRNA前体的后加工 tRNA前体的后加工
1. 2. 3.
二．
真核生物的转录后加工
mRNA前体的后加工 rRNA前体的后加工 tRNA前体的后加工
1. 2. 3.
三．
古菌的转录后加工
转录后加工


基因转录的直接产物被称为初级转录物。初 级转录物一般是无功能的，它们在细胞内必 → 须经历一些结构和化学的变化即所谓的转录 后加工以后才会有功能。转录后加工可能是 RNA的功能所必需的，也可能提供基因表达 调控的一种手段。 RNA所能经历的后加工方式可达10种以上， 但后加工反应的本质要么是增减一些核苷酸 序列，要么是修饰某些特定的核苷酸。
剪接体的组装与剪接反应（续）
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U6一方面代替U1-snRNP与5'-剪接点的一致序列结合， 另一方面与U4脱离，转而与U2结合； U6的“脚踩两只船”将分支点上突出的腺苷酸上的 2'-OH拉近到5'-剪接点，为第一次转酯反应创造了条 件；在进行第一次转酯反应以后，紧接着U5-snRNP 经历了依赖于ATP的重排，将相邻的外显子并置在一 起，为第二次转酯反应创造了条件； 第一次转酯反应中游离出来的外显子上的3'-OH 亲核 进攻5'-剪接点上的磷酸二酯键，导致内含子以套索结 构释放出来并很快被水解，而外显子则被连接起来； 一旦剪接反应完成，剪接体的所有成分即解体，U6snRNP 与U4-snRNP重新结合参与下一轮剪接反应。
加帽和甲基化
* * * * 帽子结构 加帽反应：共转录 为什么只有mRNA才会加帽？ 功能
为什么要有帽子？



提高mRNA的稳定性 参与识别起始密码子的过程，提高mRNA 的可翻译性 有助于mRNA通过核孔从细胞核运输到细 胞质 提高剪接反应的效率。
为什么只有mRNA加帽?
* 之所以只有mRNA和某些snRNA才有帽子 结构，是因为它们都由聚合酶II催化，当 TFIIH磷酸化CTD重复序列中的Ser5以后， 它即可以将转录因子DSIF 招募到转录复合 物。DSIF随后将另一种转录因子NELF招 募进来，以阻滞转录。上述暂停允许加帽 酶进入，来修饰转录物的5'-端。第三种转 录因子P-TEFb是一种激酶，在帽子结构形 成不久也被招募到复合物，然后磷酸化 CTD的Ser2和NELF，NELF随之失活，聚 合酶II继续延伸。
细菌mRNA前体的后加工

在细菌，mRNA很少有后加工。但某些 噬菌体mRNA会发生最简单的剪切反应， 将一个多顺反子切割成单顺反子，也有 某些噬菌体的mRNA需要经过相对复杂 的剪接反应才能成熟（如T4噬菌体编码 的胸苷酸合酶）。
真核细胞mRNA前体的后加工
* 加工形式 1) 5′-端 = 加帽 2) 3′-端 = 加尾 3) 内部 = 剪接 4) 内部=甲基化 5) 编码区=编辑 * 后加工机制
为什么只有mRNA才会加尾？
* 与加帽反应一样，只有mRNA才会加尾， 也是因为聚合酶 II最大亚基上的 CTD 重复 序列被 TFIIH 磷酸化，但是磷酸化位点为 Ser2 。 Ser2 的 磷 酸 化 将 加 尾 因 子 招 募 到 mRNA 前体上进行加尾反应。
mRNA前体的剪接



剪接这种后加工方式是在发现基因断裂的现象后确定 的。1977年，由Phillip Sharp和Richard Roberts领导两个 实验小组几乎同时在腺病毒的晚期表达基因中发现蛋 白质基因断裂现象。 进一步研究表明，基因断裂是真核细胞及其病毒的基 因组中的普遍现象，在高等生物的基因组中，只有很 少的蛋白质基因是连续的（如组蛋白和干扰素），但 在低等的真核生物，断裂基因却不多见。 不同断裂基因含有的内含子数目不一定相同，同样内 含子大小也会有差别。一般说来，一个典型的真核生 物蛋白质的基因由10% 的外显子序列和90%的内含子 序列组成。
酵母Pre-tRNA的剪接
古菌的转录后加工
古菌的转录后加工在某些方面分别与细菌和真核生物一样，在 某些方面仅类似于细菌或真核生物，还有少数是古菌特有的。 tRNA后加工包括：5′-端和3′-端的剪切和修剪 ；核苷酸的修饰 ； 添加CCA ；含有内含子的还包括剪接，但古菌的tRNA剪接与 真核生物一样，由一系列专门的蛋白质组成的酶按照一定的次 序催化完成的 rRNA后加工：其基因以多顺反子的形式存在，通过剪切和修剪 释放出三种rRNA。核苷酸的修饰与真核生物一样，需要各种特 殊的小RNA（相当于真核生物的snoRNA）与蛋白质形成的 RNP去锁定修饰目标。但对于含有内含子的rRNA的剪接与其 tRNA剪接机制相似，完全不同于真核生物 mRNA后加工：后加工类似于细菌，没有帽子结构，一般也没 有多聚A尾巴。对于少数具有多聚A尾巴的mRNA而言，其加尾 的机制和功能完全不同于真核生物，倒与含有多聚A尾巴的细 菌相似。含有内含子的mRNA的剪接机制既不同于真核生物， 也不同于细菌，而是类似于它的tRNA的剪接
U5
上游外显子 和下游外显子
ห้องสมุดไป่ตู้U6
U4 (和U2)
在剪接体中与U2结合。
snRNP的重要性




小核糖核酸蛋白颗粒（发音为 snurps）—— 参与剪接 一种 snRNP 由一个snRNA (100-200核苷酸长） 和10种不同的蛋白质组成 snRNPs和mRNA前体形成剪接体 剪接体大小与核糖体差不多，其组装需要 ATP
剪接信号
剪接通过2次转酯反应
在转酯反应中，1个磷酸二酯键被转移到另1个羟基上 没有水解，无能量的损失
参与剪接反应的5种snRNA
snRNA U1 U2 U4 互补性 内含子的5' -端 分支点 U6 snRNA 功能 识别和结合5'-剪接点 识别和结合分支点。在剪接体组装中，也与 U6 snRNA 配对。 结合并失活U6。在剪接体组装中，U4-U6之间 的碱基配对被U2-U6之间的剪接配对所取代。 U6也取代U1 与5' -剪接点的相互作用。 与相邻的2个外显子结合，以防止它们离开剪 接体。
大肠杆菌 tRNATyr的后加工
核糖核酸酶 P –一种真正的核酶


一种核酸内切酶–参与tRNA前体5′-端的后加 工 大肠杆菌核糖核酸酶 P: 14-k的多肽链 + 一 种 377核苷酸长的RNA ( M1 RNA) 在高浓度的Mg2+下，分离的M1 RNA能单独 和剪切大肠杆菌的tRNA前体。核糖核酸酶P 中的多肽链提高 M1 RNA的剪切速率，允 许它在生理Mg2+浓度下起作用。
R-环技术:真核基因内含子数目与结构分析
变性
与成熟的mRNA杂交； 在电镜下观察
DNA 模板链 成熟的mRNA
R环实验的结果及其对结果的解释
鸡卵清蛋白基因结构及其Pre-mRNA的后加工
mRNA前体的剪接机制
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mRNA前体的剪接是高度精确的。其精确 性一方面取决于位于外显子和内含子交界 处的剪接信号（可以将其视为内因），另 外一方面取决于5种被称为snRNP的核糖核 酸蛋白质复合物（可以将其视为外因）。 剪接反应的“内因”——剪接信号 剪接反应的“外因”——snRNP和剪接因子 剪接反应——两次转酯反应 剪接体的组装
RNA polII CTD的磷酸化与加尾和加帽反应的关系
3′-加尾
加尾内因：加尾信号 ATG 加尾外因：
终止密码子
mRNA
1. CPSF = “剪切/多聚腺苷酸化特异性因子（3个 亚基）识别mRNA前体 3′-UTR上的 AAUAAA 一致序列，并与此结合 2. CFI和CFII = “剪切因子” 3. PAP = “poly(A) 聚合酶”
为什么只有mRNA被snRNPs剪接？
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RNA聚合酶的CTD是剪接必需的 剪接体内的剪接因子与CTD作用 这保证来自RNA聚合酶II的转录物处于 和剪接机构正确的相互作用的位置。
可变剪接和反式剪接
可变剪接
1. 2. 剪接是精确的，但是... 一种mRNA前体可以通过去除不同的内含子/ 外显子组合而剪接成两种以上的mRNA，从 而导致一个基因可以编码多种蛋白质 可变剪接受到调节 果蝇的性别决定与可变剪接有关 发生在两个mRNA分子之间的剪接 比较罕见 自然界只发现在锥体虫和秀丽线虫