第五章聚合酶链式反应

第五章聚合酶链反应及其相关技术PCR技术从Mullis最初建立到现在共约20多年时间，因为此技术具有高特异性、高敏感性和简便快捷等特点而备受人们广泛应用，许多新型的PCR技术或由PCR衍生的新技术正不断出现，使PCR技术由最初的单一技术体系逐步发展成为一系列的技术综合。

PCR技术在体外快速特异地复制目的DNA序列，理论上能将极其微量的（pg DNA）目的基因在较短的时间内（通常1-3h）扩增达到纳克、微克甚至毫克级水平，使产物极易被检测。

因此PCR技术目前已经成为人们获取目标基因的最常用的方法之一，Mullis因其杰出的贡献，于1993年获得了诺贝尔化学奖。

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 是体外酶促扩增DNA或RNA序列的一种方法，它是一种不需要借助于分子克隆而可以在体外快速繁殖、扩增DNA的技术,它与分子克隆（molecular cloning）、DNA测序（DNA sequencing）一起构成了分子生物学的三大主流技术。

在这三项技术中，PCR技术自1983年由美国Cetus公司Kary.Mullis提出并于两年后建立以来，得到了快速的发展，成为最常用的分子生物学技术之一。

这项技术使人们能够在数小时内通过试管中的酶促反应将特定的DNA片断扩增数百万倍，给生命科学领域的研究手段带来了革命性的变化。

由于PCR技术的实用性和极强的生命力，PCR技术成为生物科学研究的一种重要方法，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。

目前，一系列的PCR方法被设计开发出来，并广泛应用于基因扩增与分离、医疗诊断、基因突变与检测、分子进化研究、环境检测、法医鉴定等诸多领域。

5.1 PCR技术原理聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。

它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。

从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始，可产生ug量的PCR产物（见图5-1）。

在PCR反应中，欲扩增的目的DNA片段由两条单链组成。

首先合成出与两条链两端互补的寡聚核苷酸引物(约含20个核苷酸)，然后将起始反应液中的模板DNA加热而变性解链。

在降低温度复性时，引物分别与A，B链两端的互补序列配对结合。

最后，在DNA聚合酶的催化下，以目的DNA片段为模板进行聚合反应。

第一轮反应结束后，目的DNA增加了一倍。

新合成的DNA片段本身又能作为下一轮反应的模板。

如此反复进行，DNA片段的数目可以呈2的指数增加。

由于在PCR操作过程中，需要反复加热解链，一般的DNA聚合酶容易变性失活。

后来从耐热菌中纯化得到一种TaqDNA聚合酶，能在较高的温度下(70～75℃)进行催化聚合。

这样就不需要在每次循环时加入新酶，而且可以获得质量更好的DNA片段，从而使PCR技术达到更成熟的阶段。

5.1.1聚合酶链式反应操作过程Mullis最初建立的PCR方法使用三种温度的水浴进行实验，并以大肠杆菌DNA聚合酶 I 的Klenow片段催化复性引物的延伸。

由于该酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，所以每一轮反应都需添加新的酶，使得操作繁复且产量不高，而且对实验操作要求较高。

1988年Saiki等将从温泉中分离的一株嗜热杆菌（Thermus aquaticus）中提取到的耐热DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）引入了PCR技术。

由于该Taq酶能够耐高温，在DNA热变性时不会被钝化，所以整个反应只需添加一次酶即可，此酶的发现为如今通过PCR 仪实现DNA的自动化扩增奠定了坚实的基础。

PCR扩增靶DNA序列扩增操作过程一般包括3个步骤，即变性、退火、延伸。

⑴变性（denaturation）是将反应体系混合物加热94℃并维持一定时间，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链分子作为反应的模板。

⑵退火（annealing）是将反应体系温度降低至特定的温度（寡核苷酸引物的融点温度Tm值左右或以下），使引物能与模板的互补区域结合，形成模板－引物复合物。

由于模板链分子较引物复杂得多，加之引物量大大超过模板DNA的数量，DNA模板单链之间互补结合的机会很少。

另外，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短。

⑶延伸（elongation）是将反应体系的温度升至72℃并维持一定时间，使反应体系中已结合到模板DNA链上的引物在聚合酶的作用下，以引物为固定起点，以四种单核苷酸（dNTP）作为底物，按照模板链的序列以互补的方式依次把dNTP加至引物的3'端，合成新的DNA链。

上述三个步骤作为PCR的一个循环，由于每个循环所产生的DNA片段作为下一个循环的模板，所以每循环一次，底物DNA的拷贝数增加一倍。

因此，反应产物量以指数形式增长，一个分子的模板经过n个循环可得到2n拷贝产物，如经过25次循环后，则可产生225个拷贝数的特异性DNA片断，即3.4×107倍待扩增的DNA片断。

但是，由于每次PCR的效率并非100％，并且扩增产物中还有部分PCR的中间产物，所以25次循环后的实际扩增倍数为1×106到3×106数。

另外从图中可以看出，PCR反应经过3个循环，扩增产物中就出现待扩增的特异性DNA片断。

5.1.2 参与PCR反应体系的成分及其作用参与PCR反应的成分主要包括：模板核酸、一对寡核苷酸引物、催化依赖模板的DNA 合成的耐热DNA聚合酶、缓冲液、Mg2+，4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、反应温度与循环次数、PCR促进剂等。

现对它们的作用介绍如下：1、模板用于PCR的模板核酸可以是DNA，也可以是RNA。

核酸模板来源广泛，可以从动植物细胞、培养的细胞、细菌、病毒、组织，病理样品，考古样品等中提取。

当用RNA 作模板时，首先要进行反转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。

包括基因组DNA、RNA、质粒DNA和线粒体DNA等。

模板DNA都需要通过纯化以除去DNA聚合酶抑制剂（如SDS、氯仿、乙醇等）和其它杂质(如RNA)，以保证有较高的纯度。

DNA模板中过多的RNA污染会造成RNA与DNA的杂交或RNA与引物的杂交，导致特异性扩增效率的下降。

在用RNA作为扩增模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为PCR反应的模板进行扩增反图5-1 聚合酶链式反应示意图应。

除了上述的DNA 或RNA 可用作模板外，PCR 还可以直接以细胞为模板。

一般来说PCR 对模板纯度的要求不是很高，模板不需要达到超纯。

对于来源于组织细胞的模板DNA ，只要先溶细胞，经蛋白酶消化去除蛋白质，再用酚、氯仿抽提，经乙醇沉淀的模板即可应用。

某些扩增实验中甚至可以直接将溶细胞液煮沸加热，用蛋白质变性后的DNA 溶液作模板。

但在DNA 溶液中，不能有影响扩增反应的物质存在，例如蛋白酶、核酸酶、结合DNA 的蛋白质等；另一类是尿素、十二烷基硫酸钠、卟啉类物质等；还有一类是二价金属离子的络合剂(如EDTA)等，会与Mg2+络合，影响TaqDNA 聚合酶的活性。

上述物质的存在会3` 5`3`5`含靶序列的DNA 模板5`5` 3`5`第一次退火引物1 引物25`3` 5`3`3` 第二次变性、退火5 （其它不同长度的链未标出）影响扩增效果，甚至使扩增失败。

一般对于单拷贝的哺乳动物基因组模板来说，100ul的反应体系中有100ng的模板已足够。

有时加的模板太多，会令扩增失败。

这时如果对模板稀释后再加入反应体系中，往往能获得成功。

2、引物引物是与靶DNA的3'端和5'端特异性结合的寡核苷酸，是决定PCR扩增产物的特异性和长度的关键。

只有当每条引物都能特异地与模板DNA中的靶序列复性形成稳定的结构，才能保证其特异性。

一般情况下，设计的引物长度介于15～30个核苷酸之间，3'端必须带有游离的－OH基团，反应体系中各引物浓度一般介于0.1~0.5 μmol/L之间，过高或过低均不利于反应的正常进行。

引物设计是决定PCR反应成败的关键。

引物具有定位和定向作用：一对引物分别与一条单链模板结合，并且与靶序列3’端侧翼碱基互补，从而限定了引物只能结合在所识别的链上的靶序列3’端。

另外由于DAN聚合酶的5’一3’合成特点，引物的3’端得以延伸，两引物延伸方向相对并指靶序列的中央；决定片段大小：引物之间的距离决定了扩增靶序列的大小及特定范围。

PCR反应中，对引物也有一些特殊的要求，引物过短会影响PCR的特异性，要求有16～30bp。

，引物过长使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度，亦会影响产物的特异性。

)G+C 的含量一般为40％～60％。

引物的四种碱基应随机分布，不要有连续3个以上的相同嘌呤或嘧啶存在。

尤其是引物3’不应有连续3个G或c，否则会使引物与核酸的G或c富集区错误互补，而影响PCR的特异性。

引物自身不应存在互补序列而引起自身折叠，起码引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

两引物之间不应互补，尤其是它们的3’端不应互补。

一对引物之间不应多于4个连续碱基有互补性，以免产生引物二聚体。

引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70％或有连续8个互补碱基同源，否则导致非特异性扩增。

引物3’端是引发延伸的点，因此不应错配。

由于ATCG引起错配有一定规律，以引物3’端A影响最大，因此，尽量避免在引物3’端第一位碱基是A。

引物3’末端也不应是编码密码子的第三个碱基，以免因为密码子第3位简并性而影响扩增特异。

引物5’端可以修饰，包括加酶切位点，用生物素、荧光物质、地高辛等标记，引入突变位点，启动子序列，蛋白质结合DNA 序列等。

引物浓度一般要求在0．1～0．5pmol之间。

浓度太高，容易生成引物二聚体，或非特异性产物。

引物Tm值最好在55～70℃范围。

简并引物实际上是一类由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差异。

若PCR扩增引物的核苷酸组成顺序是根据氨基酸顺序推测而来，就需合成简并引物。

简并引物同样也可以用来检测一个已知的基因家族中的新成员，或是用来检测种间的同源基因。

使用简并引物的PCR反应，其最适条件往往是凭经验确定的，尤其是要注意所选定的变性温度，以避免引物与模板之间发生错配。

有的学者建议，使用热起始法(hotstart method)能够有效地克服错配现象。

热起始法要求将反应混合物先加热到72℃，然后才加入Taq DNA 聚合酶。

经过这样的处理，增加了PCR扩增产物的特异性，所得到的靶DNA片段在EB琼脂糖凝胶电泳中可以容易地观察到，而且背景中的非靶序列的条带全消失了。

为了尽可能减少非靶序列的扩增，最近已经发展出一种嵌套引物(nested primers)的策略。