一种新型酿酒酵母附加型分泌表达载体的构建

专利名称：一种链霉菌分泌型表达载体及其构建方法和应用专利类型：发明专利
发明人：何璟,江洲,张伟
申请号：CN202110167055.1
申请日：20210205
公开号：CN112852858B
公开日：
20220624
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种链霉菌分泌型表达载体及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域，本发明提供了一种链霉菌分泌型表达载体，所述链霉菌分泌型表达载体中包含如SEQIDNO.1所示的序列，该表达载体具体为：将强启动子PA4以及特定的分泌信号肽与待表达目的基因N端融合，并插入至常规载体中构建得到重组质粒，可使目的基因表达并将表达的目的蛋白分泌至胞外，在重组菌株的发酵培养过程中，可以直接从发酵液中收集得到分泌表达的外源目的蛋白。

所述载体的构建方法简单快速，并且可直接将目的蛋白分泌至胞外，利于目的蛋白的收集，避免了异源蛋白积累造成的细胞毒性。

申请人：华中农业大学
地址：430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街1号
国籍：CN
代理机构：武汉智嘉联合知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：易贤卫
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α文章编号:10083464(2003)01003704巴斯德毕赤酵母新型分泌表达载体构建韦宇拓,甘凤琼,苏华波,赵颖怡,汪嵘,黄日波(广西大学生物技术实验中心,广西南宁530005)摘要:巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pP I C I NU 是利用来源于克鲁维酵母(K luy vero m y ces m arx ianus )的菊粉酶基因信号肽DNA 序列(ISP )构建的。

表达实验结果表明,带有分泌表达载体pP I C I NU 的Β-1,3-1,4葡聚糖酶基因重组菌,具有与带有表达载体pP I C 9K (带有Α因子信号肽)的Β-1,3-1,4葡聚糖酶基因重组菌相同的分泌效率。

关键词:巴斯德毕赤酵母;克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽;分泌表达;Α因子信号肽中图分类号:Q 782 文献标识码:ACon struction of a novel secreti ng expression vectors for P ich ia p astorisW E I Yu tuo ,GAN Feng qi ong ,SU H ua bo ,ZHAO Y ing yi ,W AN G Rong ,HUAN G R i bo(B i o techno logy R esearch Cen ter ,Guangx i U n iversity ,N ann ing 530005,Ch ina )Abstract :T he secreting exp ressi on vecto r ,pP I C I NU con tain ing inu linase signal pep tide (ISP )from K luy vero m y ces s m a rx ianu ,of P ich ia p astoris w as con structed .T he exp ressi on resu lts show ed that the secreti on efficiency of the beta1,31,4glucanase of recom b inan t P .p astoris con tain ing p P I C I NU w as as h igh as that of recom b inan t P .p astoris harbo ring pP I C I 9K carrying Αfacto r p rep ro p ep tide .Key wards :P ich ia p astori ;signal pep tides of K luy vero m y ces s m a rx ianu inu linase ;secreting ex 2p ressi on ;Α-facto r p rep ro pep tide Bong 等研究中发现在克鲁维酵母(K luy vero m y ces m a rx ianus )中,大部分菊粉酶能被分泌到胞外,将其先导肽用在酿酒酵母中能促进多种外源蛋白分泌到胞外,分泌效率高于常用的Α因子信号肽[1]。

酵母菌表面展示载体的准备与构建酵母菌是一种常见的单细胞真核生物，广泛应用于工业发酵、酿造等领域。

在生物技术研究中，酵母菌也常被用作表达外源蛋白的载体。

为了实现高效的外源蛋白表达和展示，研究人员开发了各种酵母菌表面展示载体。

本文将介绍酵母菌表面展示载体的准备与构建方法。

一、酵母菌表面展示载体的选择在酵母菌上表达外源蛋白，可以利用其天然的分泌系统或构建表面展示载体。

与细菌和哺乳动物细胞相比，利用酵母菌表面展示载体表达蛋白有以下优点：酵母菌具有天然的高效蛋白质分泌系统、易于培养、成本低廉、酶活比较稳定等。

目前常用的酵母菌表面展示载体有pYEX系列和pYD系列等。

二、酵母菌表面展示载体的准备1. 扩增载体基因首先需要扩增所选酵母菌表面展示载体的基因。

将载体的DNA与引物混合，通过PCR反应扩增。

扩增后的目标基因需要经过酶切和连接来构建完整载体。

2. 载体酶切和连接将扩增得到的载体基因与酵素切割，并使用DNA连接酶将其与希望表达的外源蛋白基因连接。

酶切和连接反应后需要经过凝胶电泳验证连接是否成功。

3. 转化并筛选利用化学转化或电转化将连接好的载体导入酵母菌细胞中。

经过转化后，需要进行选择性培养基或药物筛选，例如添加抗生素或抗性相关物质，以筛选出携带目标载体的细胞。

三、酵母菌表面展示载体的构建1. 酵母胞外基质(Saccharomyces cerevisiae cell wall)成分分析与定位首先需要对酵母菌细胞外基质进行分析与定位，识别并了解其主要组分。

常用的方便检测酵母菌胞外基质特殊成分的方法包括免疫荧光染色和电镜观察。

2. 融合表位(Adhesion/native proteins)的构建表位融合是构建酵母表面展示载体的关键步骤之一。

通过融合外源蛋白的表位到载体酵母菌的蛋白质上，使得外源蛋白能够稳定地表达在酵母菌细胞表面。

常用的表位融合方法包括基因克隆，融合蛋白的N和C端等。

3. 载体构建与转化将融合表位的基因与酵母菌表面展示载体基因连接，并将连接好的载体导入酵母菌细胞中。

(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201610172061.5(22)申请日 2016.03.24C12N 15/81(2006.01)C12N 15/66(2006.01)C12N 15/65(2006.01)C12R 1/84(2006.01)(71)申请人华中科技大学地址430074 湖北省武汉市洪山区珞喻路1037号(72)发明人闫云君 焦梁成 潘笃杰 查根晗周清华 徐莉(74)专利代理机构华中科技大学专利中心42201代理人朱仁玲(54)发明名称一种构建酵母多拷贝表达载体的方法(57)摘要本发明公开了一种构建酵母多拷贝表达载体的方法，首先选取具有目标基因的第一载体和第二载体，然后利用一对同尾酶和一个参考酶对第一载体和第二载体进行酶切，获得具有目标基因的子序列和母序列，获得具有参考片段的目标载体，最后利用参考片段进行快速筛选，获得所述多拷贝表达载体。

通过本发明，能快速准确的构建含有特定拷贝数和特定基因的多拷贝数载体，降低了常规构建多拷贝表达载体方法中表达盒连接方向随机、载体直连或者酶切过程不充分等产生假阳性因素的概率，操作简单，效率高。

(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书6页 附图4页CN 105647959 A 2016.06.08C N 105647959A1.一种构建酵母多拷贝表达载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)选取第一载体和第二载体：所述第一载体包括第一表达盒以及参考片段，所述第二载体包括第二表达盒以及参考片段；所述第一表达盒具有m个第一目标基因，所述第二表达盒具有n个第二目标基因，m和n 为大于等于1的整数；所述参考片段具有能被参考酶酶切的参考酶切位点，所述参考酶切位点在所述第一载体和第二载体的基因序列上都为唯一序列；在所述第一载体上，所述参考片段的3’端至所述第一表达盒的5’端之间具有能被第一酶酶切的第一酶切位点，且所述第一酶切位点在所述第一酶切位点的下游端以及所述参考酶切位点的上游端之间唯一；在所述第二载体上，所述第二表达盒的3’端至所述参考片段的5’端之间具有能被第二酶酶切的第二酶切位点，且所述第二酶切位点在所述参考酶切位点的下游端以及所述第二酶切位点的上游端之间唯一；所述第一酶以及第二酶为同尾酶；(2)利用第一酶和参考酶酶切第一载体，回收所述第一酶切位点的下游端以及所述参考酶切位点的上游端之间的基因序列为子序列；同时，利用第二酶和参考酶酶切第二载体，回收所述参考酶切位点的下游端以及所述第二酶切位点的上游端之间的基因序列为母序列；(3)连接子序列与母序列，使得所述子序列的第一酶切位点的下游端与所述母序列的第二酶切位点的上游端连接，所述子序列的参考酶切位点的上游端与所述母序列的参考酶切位点的上游端连接，获得目标载体；(4)筛选出具有参考片段的目标载体，获得具有m个第一目标基因以及n个第二目标基因的所述多拷贝表达载体。

食品级酿酒酵母高效分泌/展示表达系统构建基因工程酵母菌在食品工业中的应用逐渐普遍,但重组菌抗生素抗性标记的存在对食品安全具有潜在隐患。

此外,较低的生产成本、简单方便的下游操作技术和高水平的表达量等是工业大规模生产重组蛋白必须具备的特点。

针对这些问题,本课题根据半乳糖-葡萄糖对GAL基因家族诱导-抑制效应以及GAL4p对GAL基因的调控机制,采用同源重组技术分步敲除了工业多倍体酿酒酵母MS-1染色体上的GAL1基因,并将GAL4基因整合到GALl基因位点,构建了不同GAL基因型的重组酵母SG1、DG115.DPG65和GQ21。

同时,选用α-半乳糖苷酶作为食品级选择标记、β-1,3-1,4-葡聚糖酶作为报告基因构建了在GALl启动子和MFαl信号肽控制指导下的食品级分泌表达载体YGMPA-PM:并以α-凝集素C-端320个氨基酸为锚定序列,构建了能够展示表达p-1,3-1,4-葡聚糖酶的食品级展示表达载体YGMPNA-PM.将构建的载体和不同GAL基因型的重组酵母相结合,得到了适合工业化生产的食品级高效分泌表达系统和食品级高效展示表达系统。

主要研究结果如下：扩增了GAL4结构基因全长序列,并构建了包含GAL4基因+KanMX表达盒的模板质粒PMD18-TGK.通过同源重组以GAL4+KanMX表达盒替换了工业三倍体酵母MS-1的三个等位的GALl基因中的一个,得到具有双GAL4的重组酵母。

以KanMX为敲除框架,敲除了MS-l染色体上的一个GALl基因。

利用LFH原理,设计了另外两套基因敲除框架KanMX+GALls和GALlt+KanMX,依次敲除了双GAL4重组菌株染色体上剩余的两个GALl等位基因。

考虑到重组菌株应用的安全性,利用Cre/loxP系统切除了构建重组酿酒酵母菌株时使用的KanMX抗性表达盒,并通过传代使Zeocin抗性质粒pSH47/ZEO丢失,得到不同GAL 基因型的重组酵母SGl、DG115.DPG65和GQ21。

专利名称：一种酿酒酵母载体及其构建方法与应用专利类型：发明专利
发明人：于宇,陈新宇,孔稳稳,马欣宜,莫蓓莘
申请号：CN202111214972.7
申请日：20211019
公开号：CN114350700A
公开日：
20220415
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种酿酒酵母载体及其构建方法与应用，其中，酿酒酵母载体的构建方法包括步骤：以PGBKT7酵母双杂交载体为基本骨架，依次重组了35S:HYG序列片段、细菌质粒转化子相关元件序列、CEN6‑ARSH4序列片段以及MCS序列片段，获得
PGBKT7‑Hyg‑pVS‑CEN6‑ARSH4‑MCS重组载体，即可用于植物人工染色体组装的酿酒酵母载体。

本发明构建的所述酿酒酵母载体可用于植物人工染色体相关大片段组装，以满足植物人工染色体实验中大片段序列合成组装，以及在植物体内的功能验证，该发明具有实际的研究价值和明确的应用前景。

申请人：深圳大学,深圳大学龙华生物产业创新研究院
地址：518060 广东省深圳市南山区南海大道3688号
国籍：CN
代理机构：深圳市君胜知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：徐凯凯
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新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证收稿日期：2009-03-11基金项目：黑龙江省生物菌种资源共享平台建设（KT05A400-1）作者简介：宋庆凤（1983-），女，黑龙江人，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。

*通讯作者：李杰，副教授，硕士生导师，研究方向为植物分子遗传学与基因工程。

E-mail:lijie_neau@宋庆凤，暴立娟，李杰*（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030）摘要：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一。

用于毕赤酵母表达系统的表达载体种类繁多，却因需要甲醇诱导表达或者基因转化过程中引入抗生素基因而限制了其在食品行业中的应用。

研究设计以毕赤酵母组成型启动子-GAP 启动子替换毕赤酵母表达载体pPIC9上的甲醇诱导型启动子AOX ，成功构建了毕赤酵母组成型表达载体pGAPH α。

并以里氏木霉木聚糖酶基因xyn 2为报告基因进行功能验证，结果表明，该载体可实现xyn 2基因在毕赤酵母中的高效表达。

在此基础上以经密码子优化后的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽INU 替换载体上原有的α-Factor 信号肽，结果表明，INU 信号肽能够有效引导XYNII 的分泌。

关键词：毕赤酵母；表达载体；GAP 启动子；INU 信号肽中图分类号：文献标识码：A文章编号：1005－9369（2009）07－0055－05Construction and probation of neotype secreting expression vectors for Pichia pastoris /SONG Qingfeng,BAO Lijuan,LI Jie （College of Life Sciences,Northeast Agricul-tural Unive rsity,Harbin 150030,China )Abstract:Pichia pastor is is one of the foreign protein expression system which has been widelyused.The expression vectors for Pichia pastoris are varied,but they can not be used in food vocation,because of the need of methanol in expression and the leading-in of antibiotic gene by transformation.This research designed to replace the methanol induced AOX promoter by Pichia pastoris 's constitutional promoter,GAP promoter,and successfully constructed the secreting expression vector pGAPH αfor Pichiapastoris .The gene encoding endo-β-1,4-xylanase from Trichoderma Reesei,and xyn 2gene were used as a reporter gene,and then the function probation indicated that the xyn 2gene could be overexpressed inPichia pastoris .Based on this neotype secreting expression vector pGAPH αⅡ,we replaced the α-Factor by inulase gene's signal peptide sequence which had been optimized in codon,the results showed that the showed gene's signal peptide could also utility guide the secreting expression of xyn 2gene.Key words:Pichia pastoris ;expression vector;GAP promoter;INU signal peptide 随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。

专利名称：人α防御素5在酿酒酵母中分泌表达的方法专利类型：发明专利
发明人：陈金军,许琪瑶
申请号：CN201510230559.8
申请日：20150508
公开号：CN104789625A
公开日：
20150722
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种人α防御素5在酿酒酵母中分泌表达的方法，是利用分泌型酿酒酵母表达载体构建含有人α防御素5基因的重组酿酒酵母表达载体，将构建的重组酿酒酵母表达载体导入酿酒酵母中，获得重组酿酒酵母，培养重组酿酒酵母使人α防御素5基因得到表达。

本发明使用天然存在质粒的酿酒酵母作为表达体系，通过分泌表达，目的蛋白多肽直接存在于发酵液的上清液中，不仅能保证表达的目的蛋白具有正确的天然构象；而且产物存在于上清中，不必破碎细胞，大大简化了分离纯化的工序，降低生产成本。

申请人：湖南农业大学
地址：410128 湖南省长沙市芙蓉区东湖湖南农业大学
国籍：CN
代理机构：长沙正奇专利事务所有限责任公司
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专利名称：一种酿酒酵母多基因表达载体及其构建方法与应用专利类型：发明专利
发明人：刘泽寰,台艳,肖文娟,王峻梅
申请号：CN200810029630.6
申请日：20080722
公开号：CN101319225A
公开日：
20081210
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开一种酿酒酵母多基因表达载体及其构建方法与应用，该表达载体是将酿酒酵母基因组rDNA的1.8kb片段、磷酸甘油激酶启动子和磷酸甘油激酶终止子三个表达元件插入到大肠杆菌－酿酒酵母穿梭表达载体中，并在启动子上游和终止子下游设计了两个同尾酶的酶切位点而构建成的。

本发明的酿酒酵母多基因表达载体具有同时表达多个外源基因的特点，其载体上的同尾酶设计可以使得多个外源基因以串联表达盒的方式连接到该载体上获得同时表达。

本发明的表达载体由于采用了来源于宿主酿酒酵母自身的三个表达元件，有利于外源基因在宿主中稳定、高效的表达。

申请人：暨南大学
地址：510630 广东省广州市天河区石牌
国籍：CN
代理机构：广州粤高专利代理有限公司
代理人：何淑珍
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