酵母表达(1)

毕赤酵母表‎达的培养基‎配制［5］2.1 LB（Luria‎－Berta‎n i）培养基：Trypt‎o n l％Yeast‎Extra‎c t 0.5％NaCl l％PH 7.0制作平板时‎加入2％琼脂粉。

121℃高压灭菌 20min‎。

可于室温保‎存。

用于培养p‎P ICZα‎A原核宿主‎菌TOP1‎0F’时可加入Z‎e ocin‎25ug / ml。

2.2 LLB（Low Salt LB）培养基：Trypt‎o n l％Yeast‎Extra‎c t 0.5％NaCl 0.5％PH 7.0制作平板时‎加入2％琼脂粉。

121℃高压灭菌 20min‎。

可于室温保‎存数月。

用于培养p‎P ICZα‎A 原核宿主‎菌TOP1‎0F’时，加入Zeo‎c in 25ug / ml，可以4℃条件下保存‎1～2周。

2.3 YPD （又称YEP‎D）Yeast‎Extra‎c t Pepto‎n e Dextr‎o se Mediu‎m，（Yeast‎Extra‎c t Pepto‎n e Dextr‎o se Mediu‎m，酵母浸出粉‎/胰蛋白胨/右旋葡萄糖‎培养基）Trypt‎o n 2%dextr‎o se (gluco‎s e) 2%+agar 2%+Zeoci‎n‎100‎μg/ml‎液体YPD‎培养基可常‎温保存；琼脂YPD‎平板在4℃可保存几个‎月。

加入Zeo‎c in 100ug‎/ ml，成为YPD‎Z培养基，可以4℃条件下保存‎1～2周。

2.4 YPDS + Zeoci‎n培养基（Yeast‎Extra‎c t Pepto‎n e Dextr‎o se Mediu‎m）：yeast‎extra‎c t 1%pepto‎n e 2%dextr‎o se (gluco‎s e) 2%sorbi‎t ol （山梨醇）1 M+agar 2%+ Zeoci‎n‎100‎μg/ml不管是液体‎YPDS培‎养基，还是YPD‎S + Zeoci‎n培养基，都必须存放‎4℃条件下，有效期1～2周。

毕赤酵母表达系统步骤（参考Invitrogen公司说明书）：一、pPICZαA、B、C质粒以及DH5α菌株的保存1取0.5μl pPICZα A、B、C质粒，热击转化DH5α，在低盐LB（含有25μg/ml Zeocin）的平板上37℃培养过夜。

2挑取转化子，甘油保存。

二、载体构建1将目的基因构建到pPICZα载体上，转化DH5α，用Zeocin筛选转化子。

2提质粒酶切鉴定或PCR鉴定3载体测序测序可用α-Factor引物或5’AOX1引物，3’AOX1引物三、线性化DNA1提取足够量的质粒DNA（一次转化至少需要5-10μg质粒）2 酶切线性化10μg构建好的载体，同时酶切空载体做对照，根据载体选择线性化酶切位点（样品分管酶切），pPICZα载体在5’AOX1区域有三个酶切位点可选择：SacI、PmeI、BstXI3 取1-2μl酶切产物跑电泳，确定是否酶切完全；4 过柱纯化线性化质粒（用50μl EB洗脱）；四、线性化DNA的去磷酸化处理线性化质粒43μlCIAP Buffer 5μlCIAP酶2μl四、总体积为50μl的样品37℃ 1h，过柱纯化，用30μl ddH2O洗脱；五、感受态细胞的制备实验前准备：无抗性YPD平板一个、无抗生素液体YPD培养基，100μg/ml Zeocin YPD 平板和液体、50ml离心管两个、500ml预冷的无菌水、20ml 1M 山梨醇（灭菌预冷的），0.2cm预冷的电击杯；1YPD平板划线培养菌，30℃培养2-3d；250ml三角瓶中，加入5ml YPD，挑取酵母单菌落，30℃培养过夜；3吸取0.5ml菌液，加入至含有200ml新鲜YPD的1L三角瓶中，30℃，225rpm/min培养至OD值1.3-1.5；41500g，4℃离心5min收集菌体；540ml冰预冷的无菌水重悬沉淀；61500g，4℃,5min；730ml无菌水重悬；81500g，4℃,5min；910ml 1M 山梨醇重悬；101500g，4℃,5min；11加入1ml山梨醇，重悬冰上放置，直接做转化，或加入灭菌甘油每管80ul分装，冻存于-80℃(长时间保存会影响转化效率)；六、电击转化15-10μg线性化DNA（20μl<）与80ul上述感受态细胞混合，转移至预冷的0.2cm电击杯中（点击条件：电压1.5kV；电容25µF；电阻200Ω，电击时间为4～10msec）；2冰上放置5min3电击（按生产厂商提供的适合酵母用的参数）4迅速加入1ml预冷的1M 山梨醇，转移至1.5ml EP管中530℃静置培养1-2h（如果要增加存活率，获得更多的转化克隆，可在30℃静置培养1h后，加入1mlYPD培养基，30℃200rpm培养1h后取部分涂布与不同浓度抗生素的平板）6取50、100、200ul分别涂布于含有Zeocin的YPD平板，30℃培养2-10 d至有菌落出现；7如果要筛选多拷贝转化子，将转化克隆混合在一起，涂布在Zeocin 浓度为500、1000、2000μg/ml的YPD平板，培养2-3d。

酵母表达体系构建酵母表达体系是一种常用的基因表达系统，可以用于生产重组蛋白质、疫苗、抗体等生物制品。

构建酵母表达体系需要选择合适的酵母菌种、载体、目的基因以及必要的宿主细胞，并通过基因克隆、转化、筛选等一系列步骤实现。

本文将详细介绍酵母表达体系的构建过程。

一、选择酵母菌种和载体1．酵母菌种选择：根据需要表达的蛋白质的种类和性质，选择适合的酵母菌种。

常用的酵母菌种有Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）、Pichia pastoris（毕赤酵母）等。

2．载体选择：载体是携带目的基因进入宿主细胞的必要元件，常用的载体包括质粒、整合型载体和噬菌体载体等。

在构建酵母表达体系时，应根据目的基因的性质和表达量要求选择合适的载体。

二、目的基因的克隆和鉴定1．基因克隆：将目的基因插入到载体中，形成重组DNA分子。

可以通过PCR、基因文库等方法获取目的基因，也可以从基因组或cDNA文库中筛选出目的基因。

2．转化宿主细胞：将重组DNA分子导入到宿主细胞中，常用的方法包括电穿孔法、转化法等。

3．阳性克隆筛选：通过菌落PCR或 southern 杂交等方法筛选出含有目的基因的阳性克隆。

4．序列分析：对阳性克隆进行序列分析，确保目的基因正确插入载体中，并且没有发生任何突变。

三、构建酵母表达体系1．质粒制备：从阳性克隆中提取重组质粒，并进行纯化和鉴定。

2．转化酵母细胞：将重组质粒转化到酵母细胞中，常用的方法包括电穿孔法、热激法等。

3．筛选阳性克隆：通过 southern 杂交等方法筛选出含有重组质粒的阳性克隆。

4．鉴定表达产物：对阳性克隆进行蛋白质表达水平检测，常用的方法包括 western 杂交、ELISA等。

同时对表达产物进行生物活性检测，以评估表达产物的质量和功能。

5．优化表达条件：通过对培养条件（如温度、pH值、营养物质浓度等）进行优化，提高目的基因的表达水平和产量。

6．生产与纯化：在优化条件下进行大规模培养和表达，并对表达产物进行纯化和加工，以满足实际应用需求。

酵母表达系统基因表达是分子生物学领域的重要内容之一，人们利用基因表达技术制备各种目的基因的重组蛋白质，在分析基因的表达与调控、基因的结构与功能、基因治疗以及生物制药等领域均取得了令人振奋的成果。

其中，酵母表达系统拥有转录后加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。

1、酵母表达系统的特点酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。

酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。

某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。

应用酵母表达系统生产外源基因的蛋白质产物时也有不足之处，如产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等，造成表达蛋白质在结构上的不一致。

解决内部降解的方法有三：一是在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物，通过增加酶作用底物来缓解蛋白水解作用；二是将培养基的pH值调成酸性(酵母可在pH3.0~8.0的范围内生长)，以抑制中性蛋白酶的活性；三是利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。

另外，还时常遇到表达产物的过度糖基化情况。

因此，表达系统应根据具体情况作适当的改进。

2、常用酵母表达系统(宿主-载体系统)（1）酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。

因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。

酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。

1、菌株用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。

2、温度：在28度和室温下诱导表达，表达水平可能都不低。

3、pH手册上用6.0，pH提高到6.8，不表达的蛋白可能就表达出来。

BMMY的pH7.0-7.5比较合适。

国内外做的最好的rHSA，最适pH大概5-6左右。

pH3的时候yeast和peptone好像会沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氢钾调，具体比例自己去试试。

4、偏爱密码子codonbias一般不是主要的问题，你要表达的蛋白特性才是主要问题，酵母对分子量大（30KD 以上），结构复杂（如一些蛋白酶），二硫键含量多的蛋白往往不能有效表达，尤其是分泌表达。

密码子改造对一些较小的而且结构简单的蛋白表达量的提高可能有一些作用。

比如一位战友用Pichia酵母表达一个单链抗体，29KD，含有2对二硫键，表达量约几毫克每升，选用酵母偏好密码子全基因合成后，表达量没有什么提高。

5、表达时间与空质粒转化对照诱导时间长了以后，是会有很多蛋白分泌出来的，时间越长杂蛋白就越多，且分子量都比较大。

最好做一个空质粒转化的对照，这样就会比较肯定到底是不是自身的蛋白分泌的结果。

6、污染每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2ml BMGY摇菌（30ml玻璃管，比LB管大一点），纱布一般用8层，一天左右看着比较浑离心，留样1ml，余1ml换2ml BMMY诱导表达，3,4层纱布足够了。

污染一般都是跟瓶口覆盖有关的原因造成的，只盖纱布肯定会污染。

加盖报纸后，就再没遇到过污染。

如果只用6层纱布，污染的可能当然很大，100ml三角瓶，装量10ml培养液，用橡筋把8层纱布和2层报纸拴紧封口，空气浴摇床。

7、不表达蛋白有没有表达就要看你的运气了，一般重复2－3次实验都没有表达菌株，这个蛋白就放弃表达了。

8、表达量30KD,10mg/L表达量已经很高，最直接的方法是发酵，一般提高5－10倍。

大肠杆菌一样出现大团的超表达蛋白。

酵母表达手册
酵母表达系统是一种常用于生产重组蛋白质的方法，其利用酵母细胞作为宿主来表达外源基因。

以下是酵母表达系统的基本步骤：
1. 基因克隆和转化：将目的基因克隆到酵母表达载体中，常用的载体有质粒和整合型载体。

转化方法包括电转化和化学转化。

2. 重组蛋白表达：将转化后的酵母细胞接种到发酵罐中进行培养，在适宜的温度、pH和营养条件下，目的基因在酵母细胞中表达出重组蛋白。

3. 蛋白质纯化：通过一系列的纯化技术，如离心、过滤、沉淀、亲和层析等，将重组蛋白从酵母细胞中分离出来并进行纯化。

4. 蛋白质后处理：根据需要，对纯化的重组蛋白进行进一步的后处理，如去盐、脱色、除菌等。

5. 蛋白质检测：通过SDS-PAGE、Western blot等方法检测重组蛋白的表达水平和纯度。

6. 蛋白质功能研究：对纯化的重组蛋白进行生物活性检测和功能研究，如酶活测定、免疫分析等。

在实际应用中，需要根据不同的需求选择不同的酵母表达系统，如酿酒酵母表达系统、毕赤酵母表达系统等。

同时，还需要对重组蛋白进行质量分析和稳定性研究，以确保其用于后续的实验或生产中具有可靠性和有效性。

酵母分泌表达酵母分泌表达作为一种重要的蛋白质表达技术，已经在生物科学、生物技术和医药研究领域得到了广泛应用。

本文将从酵母分泌表达的概述、优势、应用、实验流程、提高策略以及未来发展趋势等方面进行详细阐述。

一、酵母分泌表达的概述酵母分泌表达是指将外源基因在酵母细胞中表达，并使其分泌到细胞外的过程。

与其他表达体系相比，酵母分泌表达具有许多优点，使得它成为了研究者们的首选。

二、酵母分泌表达的优势1.酵母细胞易于培养和繁殖，成本较低；2.酵母分泌的蛋白质具有较高的纯度和活性；3.分泌蛋白具有天然的空间结构和功能；4.可以实现高密度发酵，提高产量。

三、酵母分泌表达的应用酵母分泌表达技术在生物制药、生物材料、生物能源等领域具有广泛的应用。

例如，利用酵母分泌表达制备单克隆抗体、酶、激素等生物制品。

四、酵母分泌表达的实验流程1.构建表达载体：将外源基因与酵母分泌表达载体连接；2.转化酵母细胞：将构建好的表达载体转化到酵母细胞中；3.筛选与鉴定转化子：通过筛选含有目的基因的酵母转化子，并进行鉴定；4.发酵培养：对转化子进行发酵培养，实现外源蛋白的分泌表达；5.分离与纯化：对外分泌的蛋白质进行分离、纯化及活性检测。

五、提高酵母分泌表达的策略1.选择合适的酵母菌株：根据目标蛋白的特性和需求，选择具有较高分泌能力的酵母菌株；2.优化表达载体：改进表达载体的结构和组成，提高外源基因的表达水平；3.调整发酵条件：优化发酵过程中的温度、pH、营养元素等条件，以提高分泌蛋白的产量；4.蛋白后翻译修饰：对分泌蛋白进行适当的翻译后修饰，以提高其稳定性和活性。

六、未来发展趋势与展望随着科学技术的不断发展，酵母分泌表达技术在医药、食品和生物工程等领域具有巨大的应用潜力。

未来，酵母分泌表达技术将继续向高效、可控和个性化方向发展，为人类创造更多的价值。

总之，酵母分泌表达作为一种重要的蛋白质表达手段，已经在各个领域取得了显著的成果。

1、菌株用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。

2、温度：在28度和室温下诱导表达，表达水平可能都不低。

3、pH手册上用6.0，pH提高到6.8，不表达的蛋白可能就表达出来。

BMMY的pH7.0-7.5比较合适。

国内外做的最好的rHSA，最适pH大概5-6左右。

pH3的时候yeast和peptone好像会沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氢钾调，具体比例自己去试试。

4、偏爱密码子codonbias一般不是主要的问题，你要表达的蛋白特性才是主要问题，酵母对分子量大（30KD 以上），结构复杂（如一些蛋白酶），二硫键含量多的蛋白往往不能有效表达，尤其是分泌表达。

密码子改造对一些较小的而且结构简单的蛋白表达量的提高可能有一些作用。

比如一位战友用Pichia酵母表达一个单链抗体，29KD，含有2对二硫键，表达量约几毫克每升，选用酵母偏好密码子全基因合成后，表达量没有什么提高。

5、表达时间与空质粒转化对照诱导时间长了以后，是会有很多蛋白分泌出来的，时间越长杂蛋白就越多，且分子量都比较大。

最好做一个空质粒转化的对照，这样就会比较肯定到底是不是自身的蛋白分泌的结果。

6、污染每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2ml BMGY摇菌（30ml玻璃管，比LB管大一点），纱布一般用8层，一天左右看着比较浑离心，留样1ml，余1ml换2ml BMMY诱导表达，3,4层纱布足够了。

污染一般都是跟瓶口覆盖有关的原因造成的，只盖纱布肯定会污染。

加盖报纸后，就再没遇到过污染。

如果只用6层纱布，污染的可能当然很大，100ml三角瓶，装量10ml培养液，用橡筋把8层纱布和2层报纸拴紧封口，空气浴摇床。

7、不表达蛋白有没有表达就要看你的运气了，一般重复2－3次实验都没有表达菌株，这个蛋白就放弃表达了。

8、表达量30KD,10mg/L表达量已经很高，最直接的方法是发酵，一般提高5－10倍。

大肠杆菌一样出现大团的超表达蛋白。

毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是:醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢.为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。

由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。

而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。

毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。

细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。

甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株,可占可溶性蛋白的 30％以上。

AOX2 基因与 AOX1 基因有 97％的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多,通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。

毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。

利用含有α因子序列的分泌型载体即可。

翻译后修饰:酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N—连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度(平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的(50—150 个甘露糖残基）短得多。

菌株:GS115 （ Mut+, Muts)和 KM71（Muts）分泌型载体:pPICZα A,B,and C(5’AOX1启动子,紧密型调节,甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达,Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签）胞内表达型载体：pPICZ A，B，and C，一：分子克隆1。

设计引物分泌型载体图谱：见酵母表达说明书（p13—pPICZ A，p14-pPICZ B，p15—pPICZ C)2.PCR扩增基因PCR反应体系（50μl）模板DNA 1μlForward Primer（10μM）1μlReverse Primer（10μM）1μldNTP Mixture（各2mM）：4μl5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μlPrimerSTAR DNA Polymerase 0。

BMGY的配制（每200 mL）
Yeast extract 2 g
Peptone 4 g
K3PO4(pH 6.0) 20 mL
丙三醇 2 mL
定容至180 mL，121，灭20 min。

使用前再加入
10*YNB 20 mL（10%）（过滤除菌）
生物素0.4 mL（0.02%）（过滤除菌）
加入后，用紫外照射10 min左右再接菌。

BMMY的配制（每200 mL）
Yeast extract 2 g
Peptone 4 g
K3PO4(pH 6.0) 20 mL
定容至180 mL，121，灭20 min。

使用前再加入
10*YNB 20 mL（10%）（过滤除菌）
生物素0.4 mL（0.02%）（过滤除菌）
甲醇0.5%
加入后，用紫外照射10 min左右再接菌。

10*YNB的配制
酵母基础氮源培养基 3.4 g
硫酸铵10 g
双蒸水80 mL
定容至100 mL，过滤除菌（用0.22 μm滤膜过滤）。

毕赤酵母诱导表达
1.配BMGY和BMMY灭菌
2.使用前向BMGY按比例加入生物素、10*YNB，紫外照10 min。

3.接菌于BMGY，250 rpm，28℃摇24 h
4.向BMMY中按比例加入生物素、10*YNB、甲醇，紫外照10 min。

5.将含有菌液的BMGY转移至50 mL离心管，4℃5000 rpm 离心5 min，弃上
清。

6.用BMMY将沉淀菌体重悬，倒回瓶中，250 rpm，28℃，摇3 d。

每24 h补
一次甲醇。

酿酒酵母表达
哎呀，说起这酿酒酵母表达，咱们得用点儿咱们四川人的热情来摆谈摆谈！
你晓得嘛，酿酒这活儿，就像咱们四川人做菜，讲究个火候、材料还有那份子心意。

酿酒酵母，那就是咱们酒香里的“灵魂歌手”，它们在瓶子里头悄悄地唱，唱出了那一股子让人沉醉的味儿。

你看啊，这些小家伙（指酿酒酵母），它们可不是白吃白住的，它们得干活儿！在咱们精心准备的粮食堆里，它们开始了一场盛大的“演唱会”，一边吃，一边释放出自己的魔法——二氧化碳和酒精。

这过程，简直就是一场无声的艺术表演，只有咱们这些懂行的人，才能品出其中的韵味。

说到表达，酿酒酵母的表达方式可独特了。

它们不用说话，也不用写字，就用那神奇的化学反应，告诉咱们：“嘿，朋友，这酒快成了，味道正对！”咱们一开坛，那股子香气扑鼻而来，就知道，这酵母们可是下足了功夫，表达得淋漓尽致。

而且啊，这酿酒酵母的表达，还跟咱们四川人的性格有点像。

它们不畏艰难，不怕辛苦，只要条件合适，就能发挥出最大的潜力。

就像咱们四川人，无论遇到啥子困难，都能乐呵呵地面对，用咱们的智慧和勤劳，酿造出生活的甜蜜和幸福。

所以啊，下次你端起一杯好酒，不妨想想这背后的酿酒酵母，它们是如何默默地表达着自己的努力和才华。

咱们也得学学它们，用心去感受生活中的每一个细节，用咱们的热情和智慧，去创造属于自己的美好。