K-B纸片法
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年级:2009 专业:医学检验班级:一班姓名:赵富海学号:2009221792实验八、细菌的药物敏感试验【K-B法】菌种(均为幼龄菌):金黄色葡萄球菌1.5×108/ml、大肠埃希菌1.5×108/ml药物纸片:青霉素、庆大霉素、新诺明、环丙沙星方法:1.涂菌(棋盘划线法),室温放10min;2.贴药敏纸片,注意间距(大于24mm)和边距(大于15mm);3.置35℃ 24h判读结果。
结果如图所示:金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验评价结果实验结论:金黄色葡萄球菌对青霉素耐药,对庆大霉素、新诺明、环丙沙星敏感。
【试管稀释法】菌种:金黄色葡萄球菌1.5×108/ml、大肠b1.5×108/ml抗生素:庆大霉素32u/ml方法:1.对倍稀释抗生素2.加菌液0.1ml/管,摇均35℃ 16—18h3.判读MIC试验操作如下图所示:注意 :设立对照管(肉汤对照管,待测菌生长对照管和质控菌生长对照管) 结果判断: 不出现肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对该细菌的MIC. 如图:实验结论:MIC=原药物浓度(32u/ml) ×稀释倍数(1:24)=2u/ml【联合药敏试验】(示教)金黄色葡萄球菌大肠b结果判断:金黄色葡萄球菌联合药敏试验结果判读:①青+链=青单+链单→相加作用②青+红=青单+红单→相加作用③青+万=青单+万单→相加作用④青+林>青单+林单→协同作用大肠b联合药敏试验结果判读:①青+红=青单+红单→相加作用②青+链=青单+链单→相加作用③青+林=青单或林单→无关作用④青+南>青单+南单→协同作用【实验讨论】1.K-B法原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。
纸片中所含有的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制,从而形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。
平板霉素类似物生物活性评价平板霉素对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VREF)等耐药菌具有很好的抑制活性。
抗菌活性的测试主要针对MRSA和VREF进行测定和相比。
最小抑制浓度(MIC)被确定抑制细菌生长的最低浓度。
通过生物活性数据的反馈,进一步指导平板霉素类似物的合成方向,希望获得活性更高、药效活性更好的抗耐药菌抗生素和药物先导化合物。
纸片扩散法测定抗生素敏感试验及MIC:1.原理:将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。
纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制,从而形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系,即抑菌圈愈大,MIC愈小。
2.仪器及试剂仪器:纸片、试管、移液枪、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、pH试纸、量筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器、超净工作台试剂:样品溶液、培养基3.菌液的配置从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至3~5mL LB肉汤培养液中37℃培养2~8h,以待生长至轻微或中等浊度。
也可直接从孵育18~24h的琼脂平板上挑去纯菌落制成肉汤。
为保证药敏试验的准确度和精度,必须对接种菌液的浓度做相应的控制。
因此,将菌液稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度,稀释时使用无菌肉汤或生理盐水,此时菌液的浓度约为1.5×108CFU/mL。
4.接种平板在超净工作台中,用量筒量取15mL配置好的灭菌培养基,倒在平板中,冷却凝固。
吸取稀释好的菌液500μL于洁净的灭菌试管中,加入4500μL的培养基,冷却到不烫手,摇匀,均匀倾倒置已凝固的平板表面,放置冷却至凝固。
5.粘贴药敏纸片用纸片分配器或无菌镊子取纸片(直径6mm,厚度1mm),贴于平板表面,并用镊子尖轻压一下纸片,使其贴平。
每张纸片的间距不小于24mm,纸片的中心距平板的边缘不小于15mm。
纸片扩散法药物敏感试验若只根据是否出现抑菌环而不考虑抑菌环的直径大小来判断细菌是否对抗菌药物敏感的实验方法,其结果是不正确的。
而纸片扩散法试验是应用标准的方法学原理,根据抑菌环直径大小与最低抑菌浓度的相关性,结合临床上已知敏感或耐药菌株的状态,其结果是可靠的。
WHO推荐K-B法,其目的在于技术的简单和可重复性。
本法特别适用于肠杆菌科细菌,也可用于快速生长的致病菌,但不适用于其他细菌,如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。
无论用哪种方法接种,只要质控菌株的抑菌环在预期范围内,均可按同一解释标准报告结果。
但并非从感染患者分离到的微生物都必须做敏感试验,对于污染、机体共生的正常细菌群和那些与感染无关的细菌,可不必做敏感试验,只有那些被认为引起感染的微生物,应先分离提纯、鉴定菌种后再做敏感试验。
试验方法:一、试验材料:(一)培养基:Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。
多年大量的有关敏感试验的方法学研究,均采用该培养基;维持细菌正常发育,绝大多数细菌在此培养基上生长良好。
此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批次间差异等方面均优于其他培养基。
若检测肺炎链球菌的敏感性时,须在培养基中加5%的脱纤维羊血,制成血平板。
测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时,在培养基中须加入1%血红素和 2.5mg/ml 辅酶I后应校正pH 7.2~7.4。
制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。
在水平的实验台上倾制。
琼脂厚为4mm,允许误差为土1mm。
琼脂凝固后,应测一下pH。
琼脂于板应放4℃保存,在7日内用完。
若当天不用,用塑料袋密封包装贮藏于冰箱(2-8℃)。
每批平板都应抽样,在30-50℃下培养24h或更长时间检查是否被感染。
MH琼脂培养基配方(1L):Beef Extract 2.0g Acid Hydrolysis of Casein 17.5gStarch 1.5g Agar 17.0gFinal PH 7.3 at 25℃高压灭菌后立即水浴冷却至45-50℃。
万方数据万方数据K-B纸片扩散法药敏试验作者:谭瑶, 赵清作者单位:第三军医大学军事预防医学院环境卫生教研室,重庆,400038刊名:检验医学与临床英文刊名:LABORATORY MEDICINE AND CLINIC年,卷(期):2010,07(20)1.Andrews JM For the BSAC working party on susceptibility testing,BSAC standardized disc susceptibility testing method 2001(Suppl 1)2.池云生;李丽对影响细菌药敏试验因素的体会[期刊论文]-Chinese General Practice 2004(12)3.余修中K-B法药敏试验中菌液量的规范[期刊论文]-四川省卫生管理干部学院学报 2002(21)4.杜美华;黄本成;李华信细菌药敏试验比色法的探讨[期刊论文]-临床军医杂志 2000(28)5.张彩芳;张爱君纸片扩散法药敏试验条件的选择[期刊论文]-宁夏医学杂志 2006(12)6.倪语星抗微生物药物敏感性试验规范 20027.Annie F;Bernadette G;Philippe HL Evaluation of three techniques for detection of low-level methicillin resistant Staphylococcus aureus(MRSA):a disk diffusion method withcefoxitin and moxalactam,the VITEK2 system,and theMRSA-screen latex agglutination test[外文期刊] 2002(08)8.赵瑞珍;陈乾;刘彬头孢西丁纸片法检测mecA基因介导的MRS[期刊论文]-中华医院感染学杂志 2006(07)9.王辉;徐英春;陈民钧简要介绍美国NCCLS 药敏试验纸片扩散法法规(1993年12月版) 1995(01)本文链接:/Periodical_jyyxylc201020070.aspx。
第4章抗菌药物敏感试验一、需氧菌和兼性厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验1.扩散法(K-B法)(1)原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在接种有待检菌的琼脂平板上,该点称为抗菌药源。
药物向周围扩散,形成了随着药源距离增加,琼脂中药物浓度递减的浓度梯度。
在药源周围可抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制,形成无菌生长的透明圈即抑菌圈,其大小可以反映待检菌对测定药物的敏感性,并与该药对待检菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关,即抑菌圈愈大,MIC愈小。
(2)实验材料①培养基:采用水解酪蛋白(M-H)琼脂,pH为7.2,琼脂厚度4mm。
对生长条件要求高的细菌,如链球菌属细菌需加入5%脱纤维羊血,嗜血杆菌属细菌需加入1%血红蛋白(含Ⅴ因子)和1%Ⅹ因子复合物。
②抗菌药物纸片:选用直径为6.35mm,吸水量20μl的专用药敏纸片。
制备时取灭菌药敏纸片,经加样或浸泡药物溶液后冷冻干燥,置4℃保存备用,在有效期内使用。
③接种菌液挑取平板上形态相同的菌落4~5个,接种于3~5ml M-H肉汤中,于35℃中培养2~8h。
嗜血杆菌属和链球菌属细菌需用加血肉汤培养过夜。
用生理盐水或肉汤校正菌液至0.5麦氏比浊标准(相当于1.5×109/ml的含菌量)后在15min内接种。
(3)试验方法以无菌棉拭蘸取已制备好的菌液(其浊度为0.5麦氏比浊标准),在M-H琼脂表面均匀涂布接种3次,每次平板旋转60°,最后沿平板内缘涂抹1周。
平板置室温干燥3~5min,后用无菌镊子或专用纸片分配器将含药纸片贴于琼脂表面。
纸片应贴得均匀,各纸片中心相距>24mm,纸片距平板内缘>15mm。
直径为90mm的平板可贴6张纸片。
纸片贴牢后应避免再移动。
平板室温放置15min后倒置于35℃培养箱中培养16~18h后读取结果。
(4)结果解释平板置黑色背景上,从背面量取包括纸片直径在内的抑菌圈直径,单位为mm。
培养基中如果加有血液须打开皿盖从正面测量抑圈菌。
实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法(K-B法)、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。
2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。
3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。
【试剂与器材】1.培养基:一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白(M-H)琼脂或M-H液体培养基(pH7.2~7.4)。
对于营养要求高的细菌,则需在M-H培养基中加入其它营养成分。
2.抗菌药物纸片:直径为6.0~6.35mm的滤纸片上,含有一定量的某种抗菌药物。
市场有售,但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局(SFDA)批准。
不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物,药敏纸片的选择见表7-1。
3.待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。
4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下:0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合,置螺口试管中,放室温暗处保存。
用前混匀。
有效期为6个月。
5.其它:无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。
【实验容】一、纸片扩散法(K-B法)药敏试验1.原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面,纸片上的药物随即溶于琼脂中,并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散,形成逐渐减少的梯度浓度。
在纸片周围,一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环,抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。
K-B法是由Kirby - Bauer 建立,美国NCCLS推荐,目前为世界所公认的标准纸片扩散法(定性法)。
2.方法(1)培养基的准备:将无菌M-H琼脂加热融化,趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。
琼脂厚为4mm(约23~25ml培养基),琼脂凝固后塑料包装放4℃保存,在5日用完,使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。
检验科细菌耐药性监测SOP文件一、耐甲氧西林葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococci,MRS)MRS是引起临床感染的常见病原菌,同时也是引起医院感染的重要病原菌之一,其耐药特点是耐受甲氧西林的同时,还对临床广泛应用的多种抗生素呈现多重耐药,因而该菌所致感染已成为临床治疗的一大难题。
(一)MRS测定方法1、纸片扩散法接种物:直接悬液法从非选择琼脂平皿上挑取少许单个菌落至无菌生理盐水调至浓度0.5 McFarland,具体操作同常规纸片法药敏试验。
苯唑西林纸片,1R g/片,检测MRS平板应置于35℃ (而不是37℃)孵育24h (而不是16〜18h)。
结果判断:金黄色葡萄球菌:S:三13mm;I:11〜12mm;R:W10mm。
凝固酶阴性葡萄球菌:S:三18mm;R W17mm。
对于苯唑西林纸片周围的抑菌圈内有任何小菌落或稀薄“菌膜”生长都应列为MRS。
2、琼脂筛选法:如果纸片试验结果中介时,可做琼脂筛选法,培养基为MH琼脂+6R g/ml苯唑西林+4%NaCl,调整菌液浓度0.5McFarland,于35℃孵育24h,凡有任何生长即使一个菌落均报MRS。
(二)MRS监测意义对于MRS,应报告对所有头抱菌素类和其他B -内酰胺酶类耐药,喹喏酮类药物,除氟哌酸外,环丙氟哌酸,氟嗪酸有较好抗菌活性(耐药率10〜23%之间),利福平敏感率在90%以上,未见耐万古霉素菌株,但已有万古霉素中介金黄色葡萄球菌。
二、高水平耐药的肠球菌(HLAR)及耐万古霉素的肠球菌(VRE)(一)药敏测定方法1、常规测定方法:采用K-B纸片扩散法,头抱菌素不用做(均为耐药),氨苄,庆大霉素,替考拉宁,万古霉素一定要做。
2、高水平氨基糖甙类耐药性测定:⑴高含量纸片扩散法:通常测定庆大霉素和链霉素的高度耐药性,具体操作如常规纸片法药敏试验。
药敏纸片:庆大霉素:120R g/片;链霉素300p g/片结果判断:R:W6mm;I:7~9mm;S:三10mm⑵含单一高浓度抗生素琼脂平皿法:稀释法:庆大霉素:R:三500R g/ml;链霉素:R:2000p g/ml3、万古霉素耐药性测定:纸片扩散法,具体操作如常规纸片法药敏试验,万古霉素纸片为:30p g/片,检测平皿置35℃24h (而不是16〜18h),并注意抑菌圈内有无小菌落或薄膜生长。