纸片扩散法测大肠杆菌对几种抗生素的敏感性

几种抗生素对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌作用李莹;叶明【摘要】The slip-agar diffusion method was used to test the antibacterial activity of 4 antibiotics solely and together on the Escherichia coli and Bacillus subtilis.Penicillin sodium for injection,tetracycline forinjection,streptomycin sulfate for injection,and cefminox sodium for injection were used as general antibiotics at three concentrations in the experiments.The susceptibility of antibiotics was used to evaluate the bacteriostatic by measuring the antibacterial circle diameter on the beef extract peptone agar plate.The results showed that four antibiotics have activity against Escherichia coli and Bacillus subtilis,which manifested medium sensitive to penicillin sodium for injection,tetracycline for injection,and streptomycin sulfate for injection at commonly used rates,but extremely sensitive to cefminox sodium for injection, as well as the tenth of the common dose.No link can be proved between the antibiotics action alone and two combined action.%采用琼脂扩散纸片法分析4种抗生素单独及联合使用对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌作用.选用普适性抗生素注射用青霉素钠、注射用四环素、注射用硫酸链霉素和注射用头孢米诺钠,分别在各自常用剂量的10、1、0.1倍剂量下进行,以牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基上圆形滤纸片的抑菌圈直径来确定两种菌种对抗生素抑菌作用的敏感程度.结果表明,4种抗生素对两种菌均有一定的抑菌作用,两种菌对常用剂量的注射用青霉素钠、注射用四环素、注射用硫酸链霉素表现为中度敏感,而对注射用头孢米诺钠表现为极度敏感,在常用剂量的0.1倍剂量条件下,其对注射用头孢米诺钠亦表现为极度敏感;且抗生素两两联用的抑菌效果与单独使用无必然联系.【期刊名称】《泉州师范学院学报》【年(卷),期】2017(035)002【总页数】5页(P35-39)【关键词】抗生素;大肠杆菌;枯草芽孢杆菌;抑菌【作者】李莹;叶明【作者单位】厦门大学嘉庚学院,福建漳州 363105;河口生态安全与环境健康福建省高校重点实验室,福建漳州 363105;厦门大学嘉庚学院,福建漳州 363105【正文语种】中文【中图分类】S317大肠杆菌(Escherichia coli)属革兰氏阴性菌，是人类和动物身上最常见的细菌之一，主要存在于大肠中.在正常状况下，动物体与大肠杆菌的关系可认为是互利共生.然而，在机体免疫力降低、肠道受到刺激等特殊情况下，大肠杆菌会转移到机体其他器官和部位而导致机体致病，成为致病菌[1].枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)属革兰氏阳性菌，抗逆性强，体内具有碱性蛋白酶和淀粉酶，在机体肠道内可抑制腐败菌的生长，增加有益菌数量，增强细胞免疫和体液免疫的功能[2].抗生素(antibiotics)是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌)和一些高等动植物在生活过程中自身产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育和正常活动功能的一类化学物质[3].抗生素的出现为疾病的治疗作出了巨大贡献，然而近年来，抗生素的过度使用，特别在养殖业、畜牧业等领域的过度滥用，导致抗生素通过食物链进入人体，改变机体内菌群的结构和数量，致使人体和动物体发生免疫失调，抵抗力下降，甚至导致机体感染某些超级细菌而致死[4].所以尽管抗生素在各个领域得以广泛应用，但是微生物长期大量接触这些具有杀菌或抑菌作用的药物会对其产生一定的耐药性[5].研究发现，一种新抗生素的研发应用大概需要5～10 a的周期，然而微生物对抗生素产生耐药性却只需要2 a时间[6].同时，多种抗生素联用的现象亦屡见不鲜，却鲜有其联合抗菌作用研究，且其导致的耐药性问题亦少报道.因此，探讨抗生素联合效应导致的耐药性研究可为医学、畜牧业和流行病学等领域提供一定的数据支持和理论依据.1.1 材料1.1.1 试验药物市售注射用青霉素钠、注射用四环素、注射用硫酸链霉素、注射用头孢米诺钠.1.1.2 试验菌种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均由厦门大学嘉庚学院环境科学与工程学院微生物实验室提供.1.2 方法1.2.1 培养基的制备将牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g溶于1 000 mL蒸馏水中，加热搅拌至药品完全溶解，加入1 mol/L NaOH至培养基pH达7.4～7.6，加入琼脂24 g，分装至3个500 mL锥形瓶，121 ℃高压灭菌15 min.1.2.2 抗生素的制备按照常用剂量的10、1、0.1倍，分别将4种抗生素与无菌水混合各配置成3个浓度梯度.其中，注射用青霉素钠为1、0.1、0.01 g/mL，注射用四环素、注射用硫酸链霉素和注射用头孢米诺钠3种药品的浓度梯度为0.1、0.01、0.001 g/mL.之后，4种抗生素按相同用量倍数各取1 mL两两混合后标注.1.2.3 菌悬液的制备将供试菌种大肠杆菌和枯草芽孢杆菌分别接种于液体LB培养基，37 ℃振荡培养，至菌液OD值为0.6左右进行后续试验.1.2.4 抑菌试验移液枪移取0.1 mL菌悬液，均匀涂布于牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基上，取直径为7 mm的圆形滤纸片蘸取供试药品(完全浸透且无液滴滴落)，均匀摆放在涂有菌悬液的平板培养基上.每个平板培养基放4个纸片，重复3次，平置于37 ℃培养箱中培养24 h，用直尺测定抑菌圈直径.1.2.5 判定标准试验判定标准，抑菌圈直径小于10 mm为低度敏感，10～14mm为中度敏感，14～20 mm为高度敏感，大于20 mm为极敏感.2.1 注射用青霉素钠单独及联合抑菌作用注射用青霉素钠单用及联合作用对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌情况见表1～2. 由表1～2可知，在常用剂量及其10倍常用剂量水平下，注射用青霉素钠与注射用四环素联合作用的抑菌效果较其单独作用因菌种不同而具有一定的差异，二者对大肠杆菌的联合抑制作用略高于注射用青霉素钠单独作用，但尚未形成敏感度差异;而对枯草芽孢杆菌的联合抑制作用略低于其单独作用，且具有敏感度差异.注射用青霉素钠与注射用硫酸链霉素和注射用头孢米诺钠联合作用的抑菌效果与其单独使用相比，联合作用抑菌效果更好，除10倍常用剂量对枯草芽孢杆菌的抑制作用外，均具有敏感度差异.就菌种而言，注射用青霉素钠单独作用对枯草芽孢杆菌的抑制作用略高于大肠杆菌，10倍常用剂量时具有敏感度差异；而其与注射用四环素的联合作用对大肠杆菌抑菌作用较枯草芽孢杆菌更强，常用剂量时具有敏感度差异；其与注射用硫酸链霉素和注射用头孢米诺钠的联合作用同样对大肠杆菌抑菌效果稍好于枯草芽孢杆菌，且均为极度敏感.2.2 注射用四环素单独及联合抑菌作用注射用四环素单用及联合作用对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌情况见表3～4.由表3～4可知，在0.1倍常用剂量下，注射用四环素单独作用及其与注射用青霉素钠、注射用硫酸链霉素联合作用对两种菌均为产生明显的抑制作用;而在10倍及其常用剂量下，与注射用青霉素钠、注射用硫酸链霉素联合抑菌作用相比，其单独作用抑菌效果较好；而与注射用头孢米诺钠联合作用的抑菌效果相比，联合作用抑菌效果更好.就菌种而言，在常用剂量及其10倍常用剂量水平下，注射用四环素单独作用对大肠杆菌抑菌效果较好，且在10倍常用剂量时具有敏感度差异，其与注射用青霉素钠的联合作用亦对大肠杆菌抑菌效果较好，而在常用剂量时具有敏感度差异；与注射用硫酸链霉素联合作用，在常用剂量下对大肠杆菌抑制作用较好，具有敏感度差异，而10倍常用剂量下无显著差异；其与注射用头孢米诺钠的联合作用对两种菌均具有极/高度抑菌作用.2.3 注射用硫酸链霉素单独及联合抑菌作用注射用硫酸链霉素单用及联合作用对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌情况见表5～6.由表5～6可知，与注射用硫酸链霉素单独作用相比，其与注射用青霉素钠和注射用头孢米诺钠的联合作用抑菌效果较好；而其与注射用四环素的联合抑菌作用尚不及其单独作用抑菌效果.就菌种而言，注射用硫酸链霉素单独作用对大肠杆菌抑菌效果较枯草芽孢杆菌更好，在10倍常用剂量下具有敏感度差异；而与注射用青霉素钠对大肠杆菌的联合抑菌效果较好，但尚未产生敏感度差异；与注射用四环素对两种菌的的联合作用根据使用剂量的不同而有一定的差异，10倍常用剂量时均为高度敏感，常用剂量时对大肠杆菌抑菌作用较好，且具有敏感度差异，0.1倍常用剂量时对两种菌均无明显抑菌作用；与注射用头孢米诺钠头孢的联合作用，对两种菌均为极/高度敏感.2.4 注射用头孢米诺钠单独及联合抑菌作用注射用头孢米诺钠单用及联合作用对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌情况见表7～8.由表7～8可知，3种剂量下，注射用头孢米诺钠单独作用对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均具有极度抑菌效果，且其单独作用较其与注射用青霉素钠、注射用四环素及注射用硫酸链霉素的联合作用抑菌效果稍好，但对两种菌种均具有高度/极度抑菌效果.综上所述，就4种抗生素单独作用及两两联合对两种菌种大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果而言，其单独作用和联合作用的抑菌效果无必然联系，且根据使用剂量的不同、菌种的不同，其抑菌效果亦有一定的差异.随着抗生素在农业、医学等领域的广泛应用，其抑菌作用机理也多有研究.已研究较成熟的机理包括以下几种：抗生素作用于细菌细胞壁，影响细胞壁相关酶类的合成或直接对细胞壁产生破坏作用[7]；作用于菌体细胞膜或细胞质膜，造成菌体胞浆或细胞内容物外的渗漏，而起到杀菌作用[8]；作用于蛋白质合成系统，抑制菌体蛋白质的合成而起到细菌防治的作用[9]；作用于能量代谢系统，切断供菌体生长的养分来源[10]；作用于呼吸代谢途径，抑制呼吸链关键酶的活性，从而达到抑菌的目的[11].本研究就生活中常见的抗生素药物对与生物机体息息相关的菌群进行抑菌试验研究，设置用量是常用剂量的10、1和0.1倍，同时模拟两种抗生素混合抑菌效用.研究发现，作为普适性抗生素，4种药物对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均具有一定的抑菌作用.这也提示我们，抗生素对病原菌进行抑菌的同时，也会对益生菌产生抑菌作用.同时也有研究发现，不合理地使用抗生素类药物会加快人和动物机体的菌群失调[12].本研究中，当所用剂量为常用剂量时，注射用青霉素钠、注射用四环素和注射用硫酸链霉素3种抗生素的抑菌效果为中度敏感;而注射用头孢米诺钠为极度敏感，且将剂量降低为常用剂量的十分之一，对两种菌种的抑菌程度依然为极度敏感，高剂量抗生素药物的使用虽可在短时间内对抗机体疾病，然而长远来看，会加速抗生素与微生物间平衡的破坏.研究还发现,抗生素两两联用的抑菌效果与单独使用的抑菌效果之间无必然联系，这与杜智敏等就抗生素药物联用对枯草芽孢杆菌的研究结果相一致[13].因此，医学上抗生素的联用需要一定的基础数据作为理论支撑，合理有效地使用抗菌药物对抑菌活性、降低毒性、减缓菌种耐药性均具有一定的现实意义.【相关文献】[1] 卫昱君,王紫婷,徐瑗聪,等.致病性大肠杆菌现状分析及检测技术研究进展[J].生物技术通报,2016,32(11):80-92.[2] 俞宁,申一淋.枯草芽孢杆菌替代抗生素治疗仔猪腹泻试验[J].西昌学院学报(自然科学版),2009,23(4):22-24.[3] 任娟.猪粪中沙门氏菌的分离鉴定及体外抑菌方法的研究[D].乌鲁木齐:新疆农业大学,2008.[4] 王育娜,耿慧敏,李春歌.4种抗生素对枯草芽孢杆菌的体外联合抑菌试验[J].河南农业科学,2012,41(8):177-179.[5] 赵明秋,沈海燕,潘文,等.细菌耐药性产生的原因、机制及防治措施[J].中国畜牧兽医,2011,38(5):177-181.[6] 王唯霖.中草药提取物的抑菌机理对大肠杆菌的耐药性研究[D].保定:河北农业大学,2015.[7] 陈敏纯,廖美德,夏汉祥.农用抗生素作用机理简述[J].世界农药,2011,33(3):13-16.[8] 范丽霞.几株放线菌发酵液抑菌活性成分的研究[D].咸阳:西北农林科技大学,2013.[9] 朱春玉,吴元华,赵秀香,等.嘧肽霉素抗烟草花叶病毒作用机理初步研究[J].植物病理学报,2006,36(4):314-316.[10] 郭永霞.井冈霉素A诱导水稻防御纹枯病的生理生化机理研究[D].郑州:河南农业大学,2002.[11] 陈念,高向阳,林壁润.万隆霉素抑制细菌的作用机理初探[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2005,33(增刊1):143-147.[12] 崔晓霞,王秀敏,侯晓礁,等.13种抗生素类药物对大肠杆菌的体外抑菌试验[J].吉林畜牧兽医,2008,29(7):9-10.[13] 杜智敏,朱波,张波.双黄连注射液与注射用青霉素钠配伍的稳定性及体外抑菌实验[J].哈尔滨医科大学学报,2003,37(4):330-332.。

纸片扩散法药敏试验一、原理纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。

在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。

不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小。

二、进行药敏实验指征为保证治疗效果，对引起感染的任何病原菌，若不能从该菌的种属特征可靠地推知其对抗菌药物的敏感性，就需要进行药敏试验。

尤其当病原菌属于对常用抗菌药物能产生耐药时，就更需进行药敏试验。

若感染是公认的对某一高效抗菌药物敏感的微生物引起的，就很少需要进行药敏试验了。

三、标本要求参加药敏试验的菌株包括从临床标本中分离的常见的、快生长的菌株，如肠杆菌科菌、葡萄球菌、肠球菌、非发酵糖菌；还包括某些苛养的病原菌，如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌及其他链球菌、淋病奈瑟菌等。

标本内的正常菌群，通常不作药敏。

对每一种可能致病的细菌进行敏感试验时，使用的单个菌落都应选自原始的琼脂平板，鉴定种属的过程常与此同时进行。

不同菌种的混合物不能在同一药敏平皿上进行试验。

除非在临床急症患者的标本（如阳性血培养物）经涂片革兰染色提示单一的病原菌，一般应避免直接用临床标本（如无菌体液和尿液）做药敏试验。

若用临床标本作了直接药敏试验，也必须按标准方法重复第二次药敏。

四、选药原则详见临床实验室标准化研究所（CLSI）对各种非苛养菌和苛养菌进行常规药敏试验和报告时的选药指南表。

表中的抗菌药物可满足绝大多数临床实验室的常规需要，在此表中各种抗菌药物针对具体的菌种或菌群被分成许多纵列，每一列又根据不同的选择要求分成A、B、C、U等不同的组，其中A组药物用于常规和首选试验，其结果也应常规报告。

大肠埃希氏菌生化鉴定结果大肠埃希氏菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，可以引起多种感染性疾病，包括腹泻、尿路感染和食物中毒等。

鉴定大肠埃希氏菌的生化特征可以帮助确定病原菌的身份以及其潜在的耐药性和毒力因子。

本次实验目的是对一株致病性大肠埃希氏菌样本进行生化鉴定，以确认其菌株的性质和特征。

首先，我们进行了气体产生实验。

在Triple Sugar Iron Agar（TSI）培养基中，观察到菌落周围发生了气体产生，此结果表明该菌株具有产气性。

产气性通常意味着大肠杆菌等需要葡萄糖产生酸，进而分解产生气体的细菌。

其次，我们进行了甲烷发酵试验。

在Methyl Red（MR）试剂中，当菌液发酵产酸时，溶液颜色由黄色变成红色。

然而，该菌株在MR试剂中没有产生红色反应，这表明它无法通过甲烷发酵产酸。

这一结果与典型的大肠杆菌不同，因为大肠杆菌通常可以通过此途径产酸。

进一步，我们进行了亮氨酸脱氨酶试验。

使用亮氨酸脱氨酶（LDC）培养基，如果菌株具有亮氨酸脱氨酶活性，菌液会变色。

然而，我们观察到该菌株在培养基中没有出现任何颜色变化，这表明它不具备亮氨酸脱氨酶活性。

亮氨酸脱氨酶活性通常是大肠杆菌的典型特征之一。

此外，我们还进行了尿素酶试验。

使用尿素平板培养基，如果菌株具有尿素酶活性，培养基颜色将由黄色变为粉红色。

然而，我们观察到该菌株在培养基上未显示出任何颜色变化。

这暗示着该菌株可能缺乏尿素酶活性，与大肠杆菌的典型特征不同。

最后，我们进行了青霉素酶试验。

使用青霉素酶试纸进行反应检测，在试纸上出现蓝色点状斑点表示菌株具有青霉素酶活性。

而对于这个菌株，我们观察到在试纸上没有出现蓝色斑点。

这意味着该菌株可能对青霉素类药物敏感，这对于抗生素选择治疗提供了重要信息。

综上所述，通过对致病性大肠埃希氏菌样本进行生化鉴定，我们发现该菌株具有产气性，但与典型的大肠杆菌不同，它不表现出甲烷发酵、亮氨酸脱氨酶和尿素酶活性。

1. 掌握纸片扩散法（Kirby-Bauer法）的原理、操作方法和结果判读。

2. 了解纸片扩散法在抗菌药物敏感试验中的临床意义。

二、实验原理纸片扩散法是一种常用的抗菌药物敏感试验方法，其原理为：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后，不断地向纸片周围扩散，形成递减浓度梯度。

在纸片周围抑菌浓度范围内，待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。

抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。

三、实验材料1. 标本：大肠埃希菌（18～24小时非选择性培养基上纯培养物）。

2. 试剂：营养肉汤或无菌生理盐水、直径为9cm水解酪蛋白（M-H）琼脂平板、药敏纸片（氨苄西林、头孢唑啉、庆大霉素、头孢曲松、环丙沙星、亚胺培南）等。

3. 器材：35℃培养箱、0.5麦氏比浊管或比浊仪、酒精灯、接种环、镊子、无菌棉拭子、毫米尺或游标卡尺等。

四、实验方法1. 菌液制备：用接种环或无菌棉拭子蘸取大肠埃希菌单个菌落，接种到有营养肉汤或0.9%无菌生理盐水的试管中，制成菌悬液，校正浊度为0.5麦氏浊度。

2. 接种平板：调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。

用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部。

3. 贴药敏纸片：用无菌镊子或纸片分配器将药敏纸片平贴于M-H琼脂平板表面，轻压。

直径9cm的平板可贴6张纸片，每张药敏纸片之间的距离24mm，距平板边缘15mm，纸片贴牢后不要移动。

4. 培养平板：将贴好药敏纸片的M-H琼脂平板置室温干燥3～5min，倒置放入35℃培养箱中培养16～24h。

5. 结果观察与记录：观察平板上抑菌圈的大小，并记录数据。

1. 氨苄西林：抑菌圈直径为18mm。

2. 头孢唑啉：抑菌圈直径为22mm。

3. 庆大霉素：抑菌圈直径为25mm。

平板霉素类似物生物活性评价平板霉素对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VREF)等耐药菌具有很好的抑制活性。

抗菌活性的测试主要针对MRSA和VREF进行测定和相比。

最小抑制浓度（MIC）被确定抑制细菌生长的最低浓度。

通过生物活性数据的反馈，进一步指导平板霉素类似物的合成方向，希望获得活性更高、药效活性更好的抗耐药菌抗生素和药物先导化合物。

纸片扩散法测定抗生素敏感试验及MIC：1.原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。

纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。

在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制,从而形成透明的抑菌圈。

抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系,即抑菌圈愈大,MIC愈小。

2.仪器及试剂仪器：纸片、试管、移液枪、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、pH试纸、量筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器、超净工作台试剂：样品溶液、培养基3.菌液的配置从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至3～5mL LB肉汤培养液中37℃培养2～8h，以待生长至轻微或中等浊度。

也可直接从孵育18～24h的琼脂平板上挑去纯菌落制成肉汤。

为保证药敏试验的准确度和精度，必须对接种菌液的浓度做相应的控制。

因此，将菌液稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度，稀释时使用无菌肉汤或生理盐水，此时菌液的浓度约为1.5×108CFU/mL。

4.接种平板在超净工作台中，用量筒量取15mL配置好的灭菌培养基，倒在平板中，冷却凝固。

吸取稀释好的菌液500μL于洁净的灭菌试管中，加入4500μL的培养基，冷却到不烫手，摇匀，均匀倾倒置已凝固的平板表面，放置冷却至凝固。

5.粘贴药敏纸片用纸片分配器或无菌镊子取纸片（直径6mm，厚度1mm），贴于平板表面，并用镊子尖轻压一下纸片，使其贴平。

每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm。

纸片扩散法药物敏感试验若只根据是否出现抑菌环而不考虑抑菌环的直径大小来判断细菌是否对抗菌药物敏感的实验方法，其结果是不正确的。

而纸片扩散法试验是应用标准的方法学原理，根据抑菌环直径大小与最低抑菌浓度的相关性，结合临床上已知敏感或耐药菌株的状态，其结果是可靠的。

WHO推荐K-B法，其目的在于技术的简单和可重复性。

本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。

无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告结果。

但并非从感染患者分离到的微生物都必须做敏感试验，对于污染、机体共生的正常细菌群和那些与感染无关的细菌，可不必做敏感试验，只有那些被认为引起感染的微生物，应先分离提纯、鉴定菌种后再做敏感试验。

试验方法：一、试验材料：(一)培养基：Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。

多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基；维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。

此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批次间差异等方面均优于其他培养基。

若检测肺炎链球菌的敏感性时，须在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。

测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和 2.5mg/ml 辅酶I后应校正pH 7.2～7.4。

制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。

在水平的实验台上倾制。

琼脂厚为4mm，允许误差为土1mm。

琼脂凝固后，应测一下pH。

琼脂于板应放4℃保存，在7日内用完。

若当天不用，用塑料袋密封包装贮藏于冰箱（2-8℃）。

每批平板都应抽样，在30-50℃下培养24h或更长时间检查是否被感染。

MH琼脂培养基配方(1L)：Beef Extract 2.0g Acid Hydrolysis of Casein 17.5gStarch 1.5g Agar 17.0gFinal PH 7.3 at 25℃高压灭菌后立即水浴冷却至45-50℃。

实验6 抗生素等对细菌的药敏性检测antimicrobial susceptibility testing in vitro（圆盘滤纸片法disc diffusion test）一、实验目的：1、了解抗生素及化学试剂对微生物生长的影响2、掌握不同化学试剂的作用原理、常用浓度及使用方法二、实验原理许多微生物可以产生抗生素，能选择性的抑制或杀死其他微生物。

凡是抗菌谱即抗菌范围不广泛的抗生素称为窄谱抗生素，如青霉素只对革兰氏阳性菌有抗菌作用，而对革兰氏阴性菌、结核菌、立克次体等均无疗效，故青霉素就属于窄谱抗生素。

原来窄谱的抗生素如青霉素经过改造，产生了许多半合成的青霉素，扩大了原来的抗菌范围，如氨苄青霉素，不但对革兰氏阳性菌有效，而且对革兰氏阴性菌也很有效，对伤寒杆菌、痢疾杆菌效果也不错。

不同化学药品或同一化学药品对不同微生物的杀菌能力不同，此外，试剂浓度、作用时间及环境条件不同，其效果也不同。

应用前需进行试验，灵活选择。

三、实验器材1、菌种：培养24~28 h大肠杆菌、金黄色葡萄球菌斜面菌种。

2、培养基和试剂：牛肉膏蛋白胨培养基，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌液3、仪器与其他用品：无菌平皿，无菌吸管（1ml），酒精灯，接种环，涂布棒，无菌滤纸片，无菌镊子，记号笔, 消毒棉球和培养箱。

四、实验步骤（以金黄色葡萄球菌操作为例）（1）菌液制备：将待检菌接种于普通营养琼脂平板，37℃培养16～18小时，然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养菌落，悬于3ml生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊。

以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管（0.5麦氏单位）相同。

（2）倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板，注意平皿中培养基厚度均匀，倒3套平板。

（平板厚度均匀，滤纸片大小一致）（3）涂平板：无菌操作，用无菌棉棒儿蘸取菌液（金葡）。

将多余菌液在液面上方管壁内轻轻旋转挤出，涂布在MH琼脂平板整个平面三次，每次旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀。

大肠杆菌药敏试验简易方法近年来，随着养鸡业的迅猛发展，鸡大肠杆菌病的发病率和死亡率也不断增加，现已成为危害养鸡业（特别是肉鸡）最为重要的疾病之一，为细菌病之首。

因此，广大养鸡户谈之色变，没有比感染病毒病又继发大肠杆菌病更糟糕的了。

正因为如此，抗生素得到了大量广泛的应用，又由于大肠杆菌对抗生素容易产生耐药性，所以大肠杆菌的耐药性问题日益突出。

如何解决这个问题将是畜牧兽医工作者今后工作的重点。

而就目前来说，通过抗菌药物敏感性试验（药敏试验）选择敏感药物对鸡群进行预防和治疗是降低大肠杆菌病发病率和死亡率的有效手段。

标准的药敏试验（纸片扩散法）比较繁琐，要先进行细菌培养，再进行药敏试验，试验设备要求高，基层兽医诊疗机构很难做到，现介绍一种简易药敏试验方法（纸片扩散法［1］）。

1试验方法和步骤1.1试验设备恒温培养箱1台、干燥灭菌箱1台、酒精灯1个、接种棒（带接种环）1个（接种环可用回形针自制）、手术剪1把、镊子1个、普通营养琼脂1瓶、玻璃平皿（直径90mm）数个、烧杯（500ml）1个、玻璃棒1个、普通电炉1台、定性滤纸1盒、蒸馏水适量、生理盐水适量、小玻璃瓶（如链霉素瓶）数个（洗净晾干）、钢笔1支、细针头数个、高压蒸汽灭菌锅（可选）1个、普通天平1台、药勺1个、尺子1个。

1.2普通营养琼脂平皿制备1.2.1平皿消毒将玻璃平皿洗净，晾干。

用干燥灭菌箱120℃灭菌1小时；也可用酒精灯火焰消毒，将玻璃平皿内壁靠近火焰，同时慢慢转动平皿使之均匀受热，待平皿内壁上水珠烤干并发烫为止。

1.2.2琼脂消毒营养琼脂与蒸馏水（或生理盐水）以3g：100ml的比例加入烧杯（先加蒸馏水，后加营养琼脂），用电炉加热同时用玻璃棒搅拌，使营养琼脂溶化均匀。

如有高压蒸汽灭菌锅可将溶化的琼脂液装入生理盐水瓶中（不超过其容量的2/3），瓶口留一通气孔（一般用16号针头刺入瓶盖），将瓶站立放入锅内，加热至121℃保持15分钟即可；如无高压锅可直接用电炉加热至沸腾后立即将烧杯从炉上拿下来，待泡沫消了，再放到炉上，如此煮约20分钟（煮时不断搅拌）。

实验6 抗生素等对细菌的药敏性检测antimicrobial susceptibility testing in vitro（圆盘滤纸片法disc diffusion test）一、实验目的：1、了解抗生素及化学试剂对微生物生长的影响2、掌握不同化学试剂的作用原理、常用浓度及使用方法二、实验原理许多微生物可以产生抗生素，能选择性的抑制或杀死其他微生物。

凡是抗菌谱即抗菌范围不广泛的抗生素称为窄谱抗生素，如青霉素只对革兰氏阳性菌有抗菌作用，而对革兰氏阴性菌、结核菌、立克次体等均无疗效，故青霉素就属于窄谱抗生素。

原来窄谱的抗生素如青霉素经过改造，产生了许多半合成的青霉素，扩大了原来的抗菌范围，如氨苄青霉素，不但对革兰氏阳性菌有效，而且对革兰氏阴性菌也很有效，对伤寒杆菌、痢疾杆菌效果也不错。

不同化学药品或同一化学药品对不同微生物的杀菌能力不同，此外，试剂浓度、作用时间及环境条件不同，其效果也不同。

应用前需进行试验，灵活选择。

三、实验器材1、菌种：培养24~28 h大肠杆菌、金黄色葡萄球菌斜面菌种。

2、培养基和试剂：牛肉膏蛋白胨培养基，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌液3、仪器与其他用品：无菌平皿，无菌吸管（1ml），酒精灯，接种环，涂布棒，无菌滤纸片，无菌镊子，记号笔, 消毒棉球和培养箱。

四、实验步骤（以金黄色葡萄球菌操作为例）（1）菌液制备：将待检菌接种于普通营养琼脂平板，37℃培养16～18小时，然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养菌落，悬于3ml生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊。

以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管（0.5麦氏单位）相同。

（2）倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板，注意平皿中培养基厚度均匀，倒3套平板。

（平板厚度均匀，滤纸片大小一致）（3）涂平板：无菌操作，用无菌棉棒儿蘸取菌液（金葡）。

将多余菌液在液面上方管壁内轻轻旋转挤出，涂布在MH琼脂平板整个平面三次，每次旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀。

纸片扩散法药敏试验纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。

中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论目录.1试验原理.2试验步骤.3结果分析.4注意事项基本信息中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论试验原理纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。

药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。

试验步骤1. 待测菌株接种物制备（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。

（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。

2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。

（2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。

（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。

近期随着畜禽养殖业的快速发展，大肠杆菌病已成为危害养殖业的主要传染病之一。

近年来，由于长期大量抗菌药物的滥用，造成大肠杆菌耐药菌株不断产生，尤其是兽医临床已出现多重耐药性、超强耐药的大肠杆菌，即同时对兽医临床常用抗菌药物：如β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类和氟喹诺酮类等产生耐药性[1]，导致常规药物的药效降低甚至消失，临床可供选择药物的余地越来越少，大肠杆菌病的防治难度日益增加，给养殖业造成了严重的损失。

氟苯尼考（Florfenicol）属动物专用的广谱抗生素，具有广谱、高效、低毒、吸收良好体内分布广泛和不致再生障碍性贫血等特点。

多西环素(Doxycycline)是四环素类药物中毒性小、抗菌活性强和与天然品交叉耐药不明显而被广泛应用。

喹诺酮类（quinolones）是指一类具有4-喹诺酮环结构的药物，具有抗菌谱广，杀菌力强，吸收快、体内分布广泛，抗菌作用独特，与其他抗菌药物无交叉耐药性。

克林沙星属于第四代喹诺酮类药物，抗菌谱广、杀菌力强、吸收快、体内分布广、血浆半衰期较长,有望在临床上广泛用于各种感染[2,3]。

阿米卡星（Amikacin）又名丁胺卡那霉素，属半合成的氨基糖苷类抗生素。

磺胺类药物是20世纪30年代发现并最早应用于临床的化学治疗药物，曾在细菌感染性疾病的控制方面起到了重要的作用。

此类药物具有一个氨苯磺酰胺的基本结构，与细菌生长繁殖所必需的对氨基苯甲酸的化学结构相似，能竞争性地与二氢叶酸合成酶结合，是细菌不能利用对氨基苯甲酸合成叶酸，进而核酸合成受阻细菌生长繁殖受到抑制。

SMM是磺胺类中抗菌活性最强的药物，甲氧苄啶（TMP）是抑制叶酸合成中的二氢叶酸还原酶活性，也是细菌叶酸合成抑制，核酸无法合成，与磺胺类药物伍用，对叶酸代谢的双重阻断作用而起到增强抗菌的协同作用[3]。

鉴于各种药物的抗菌机理以及抗菌谱，为了更好的指导临床用药及减少耐药菌株产生，故此，对河南部分地区的畜禽大杆菌进行简单药敏分析。

纸片扩散法药敏试验纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。

中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论目录.1试验原理.2试验步骤.3结果分析.4注意事项基本信息中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论试验原理纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。

药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。

试验步骤1. 待测菌株接种物制备（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。

（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。

2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。

（2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。

（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。

纸片扩散法测大肠杆菌对几种抗生素的敏感性1 实验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测定菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分，溶解后便不断的向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。

在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。

该抑菌圈表示药物对该种细菌的生长繁殖具有抑制作用。

通过测定抑菌圈的直径大小，可以判定药物的抑菌强弱，抑菌圈直径越大表示药物抑菌作用越强，抑菌圈直径越小表示药物抑菌作用弱，没有抑菌圈表示该药物没有抑菌作用。

并且，经稀释法测得的MIC的对数和用纸片测定相应的菌株得到的抑菌直径之间大致呈直线相关，因此将两种方法相对应地测试各种据菌株所得数据，进行统计学的相关回归分析处理，可得到一条回归线，依此可推断该菌株的MIC，两者呈负相关关系，即MIC 愈小，抑菌圈直径愈大。

2 实验材料2.1 菌液江山大农庄拉稀的猪仔肠道黏膜物中提取的大肠杆菌。

2.2药品链霉素、四环素、多粘菌素B、万古霉素、庆大霉素、红霉素、氨苄青霉素、新霉素、利福平、青霉素、菌必治、羧苄青霉素。

3 实验步骤3.1药敏纸片的准备纸片内抗菌药物含量抗生素纸片浓度U/μg/片抗生素纸片浓度U/μg /片抗生素纸片浓度U/μg /片氨苄青霉素10μg 链霉素10μg 万古霉素30μg 羧苄青霉素100μg 新霉素30μg 多粘菌素B 300U头孢菌素类30μg 庆大霉素10μg 四环素类30μg菌必治30μg 利福平5μg 红霉素15μg3.2细菌的制备从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至3～5mLMH肉汤培养液中37℃培养2～8h，以待生长至轻微或中等浊度。

为保证药敏试验的准确度和精度，必须对接种菌液的浓度做相应的控制。

因此，将菌液稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度，稀释时使用无菌肉汤或生理盐水，此时菌液的浓度约为1.5×108个/L。

3.3 接种平板制备好的接种菌液必须在15min内使用。

纸片琼脂扩散法检测抗菌药物敏感试验方法分析抗菌药物敏感试验(AST)是指在体外测定药物抑制或杀死细菌能力的试验，纸片琼脂扩散法又称K－B法，是将含有一定量抗菌药物的纸片贴在已接种待测菌的琼脂平板表面，药物将在培养基中由纸片往周围扩散，且浓度递减。

在抑菌浓度范围内待测菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。

根据抑菌圈的大小可判断待测菌对测定药物的敏感程度[1]。

该法操作简便、选药灵活，适用于快速生长的需氧菌及兼性厌氧菌。

1 实验材料抗菌药物纸片选择直径6.35mm，吸水量20μL的专用药敏纸片，灭菌后，经逐片加样或浸泡的方法使每片的含药量相当于所示浓度。

纸片冷冻干燥后储藏于密封瓶内，－20℃保存。

日常工作用的少量纸片可保存于4℃冰箱内，1周内使用。

培养基水解酪蛋白(M－H)培养基是CLSI推荐采用的需氧菌和兼性厌氧菌药敏试验标准培养基，pH7.2～7.4，溶化后倾注平板(琼脂厚度为4 mm)。

使用前应将琼脂平板放入35℃孵育至表面干燥。

药敏试验菌液：浓度应为0.5麦氏比浊标准。

①生长法：挑取已分离纯化的菌落4～5个，接种于3～5mLM－H肉汤中，35℃孵育4h，用生理盐水或肉汤校正菌液浓度至0.5麦氏比浊标准。

②直接调制法：用接种环挑取纯菌落数个，混悬于生理盐水或肉汤中，充分混匀并调整浓度为0.5麦氏比浊标准[1]。

2 实验方法2.1接种以无菌棉拭子蘸取试验菌液，在管内壁旋转挤压除去多余的菌液后，涂布于整个M－H琼脂平板表面，涂布3次，每次旋转平板60°，最后沿平板边缘涂抹1圈。

盖上表面皿盖，置室温放置3～5min，使平皿表面稍干。

2.2 贴放药物纸片：用无菌镊子或纸片分配器将含药纸片平整地贴于平板表面，稍加按压使纸片贴紧。

注意纸片分布均匀，各纸片中心相距24mm以上，纸片距平板内缘应大于15mm。

纸片贴牢后切勿移动，否则会影响抑菌圈的形状。

2.3培养：贴好纸片后，须于15min内将平板置于35℃培养箱中，孵育至规定时间(一般为18～24h)。

6种抗生素类药物对大肠杆菌的体外抑菌试验xxx（山东农业大学）摘要:研究6种抗生素药物对大肠杆菌体外抑菌的作用。

通过在琼脂平皿上贴药敏片，测量抑菌圈的直径来确定抑菌作用。

结果表明大肠杆菌对青霉素、头孢他啶表现中度敏感，其他表现为高度敏感关键词:抗生素；大肠杆菌；抑菌文献综述：大肠杆菌是肠杆菌科埃希菌属中具有代表性的菌种，主要寄居在人和动物肠道中，其特性为革兰氏阴性，对营养要求不高，在普通培养基上就能很好的生长，并广泛分布于水、土壤或腐败物中。

禽大肠杆菌病是由埃希氏大肠杆菌引起的多种病的总称，包括大肠杆菌性肉芽肿、腹膜炎、输卵管炎、脐炎、滑膜炎、气囊炎、眼炎、卵黄性腹膜炎等疾病，对养禽业危害严重。

大肠杆菌病的发生，常与许多不利的外界条件密切相关。

发生时具备如下特点：发病率高，死亡率高，复发率高；各日龄均易感染，症状典型；混合感染严重；传播途径较多：呼吸道、消化道（包括滥用药物引起的肠道菌群失调）、垂直传播；治疗困难。

多年来，随着抗生素的大量应用致使大肠杆菌病的耐药菌株越来越多，耐药谱也越来越广。

本实验通过6种临床常用抗生素对大肠杆菌的药敏试验，检测临床常用的六种抗生素对大肠杆菌的敏感性以便准确有效的利用药物进行治疗。

1 药敏实验简介抗菌药物敏感性试验（AST，简称药敏试验）：用于测试抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制作用。

常用最低抑菌浓度（MIC）表示，即体外能够抑制细菌生长的最低药物浓度。

通常根据MIC结合常用剂量时体内该药所能达到的血药浓度，划定细菌对各种抗生素敏感或耐药的界限，给出S（敏感）、I（中介）、R（耐药）等定性的结果来分别表示实验菌对抗菌药物的敏感性。

高度敏感（s ）表示用某种药物治疗某种细菌引起的感染常用剂量就有效，或者说常规剂量达到的平均血药浓度超过该药对细菌的MIC 的5 倍以上；中度敏感（I ）表示用某种药物治疗某种细菌引起的感染仅在高剂量时才有效，或者说常规剂量达到的血药浓度相当于或略高于对细菌的MIC ; 耐药（R ）表示药物对某一细菌的MIC（最低抑菌浓度）高于治疗量的药物在血液或体液内可能达到的浓度，或细菌能产生灭活抗菌药的酶，无论其MIC 值大小都要判定为耐药。