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3 基因表达检测

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药理实验报告小鼠

药理实验报告小鼠

一、实验目的本研究旨在探讨某新型抗抑郁药物的疗效，并通过小鼠模型对其药理作用进行评估。

通过比较实验组与空白对照组的行为学、神经生化指标和基因表达等方面的差异，评估该药物的潜在抗抑郁效果。

二、实验材料与仪器1. 实验动物：SPF级雄性C57BL/6小鼠，体重18-22g，由某动物实验中心提供。

2. 药物：实验药物（以下简称“药物A”）和空白对照组药物（以下简称“药物B”）。

3. 仪器：小鼠行为学测试系统、酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒、实时荧光定量PCR仪、凝胶成像系统等。

三、实验方法1. 实验分组：将实验动物随机分为实验组（药物A组）和空白对照组（药物B 组），每组10只小鼠。

2. 药物给药：实验组小鼠每天给予药物A，剂量为20mg/kg体重，空白对照组小鼠给予等体积的生理盐水。

3. 行为学测试：在给药第1天、第7天和第14天，分别进行旷场实验和强迫游泳实验，观察小鼠的行为学变化。

4. 神经生化指标检测：在给药第14天，处死小鼠，收集脑组织，采用ELISA试剂盒检测脑组织中5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）和乙酰胆碱（ACh）水平。

5. 基因表达检测：在给药第14天，提取小鼠脑组织总RNA，采用实时荧光定量PCR检测5-HT转运体（SERT）、单胺氧化酶A（MAOA）和5-HT受体（5-HT1A）的mRNA表达水平。

四、实验结果1. 行为学测试：与空白对照组相比，实验组小鼠在旷场实验和强迫游泳实验中的行为学评分均显著降低，表明药物A具有改善小鼠抑郁行为的作用。

2. 神经生化指标检测：与空白对照组相比，实验组小鼠脑组织中5-HT、NE和ACh水平均显著升高，表明药物A能够调节小鼠脑内神经递质水平。

3. 基因表达检测：与空白对照组相比，实验组小鼠脑组织中SERT、MAOA和5-HT1A的mRNA表达水平均显著降低，表明药物A可能通过调节相关基因表达发挥抗抑郁作用。

五、讨论本研究结果表明，药物A在动物抑郁模型中具有良好的抗抑郁作用。

CD4+CD25+Treg细胞的分选＼表型鉴定及Foxp3表达鉴定

CD4+CD25+Treg细胞的分选＼表型鉴定及Foxp3表达鉴定

CD4+CD25+Treg细胞的分选＼表型鉴定及Foxp3表达鉴定目的为验证从C57BL/6小鼠脾脏中分离出高纯度CD4+CD25+Treg细胞及证实CD4+CD25+Treg细胞中Foxp3基因的表达。

方法使用免疫磁珠分选出CD4+CD25+Treg细胞,流式细胞仪检测纯度;使用TRIZOL抽提Foxp3基因mRNA,使用RT-PCR方法逆转录出Foxp3基因的cDNA。

结果从C57BL/6小鼠脾脏中分离出了纯度达到90%CD4+CD25+Treg。

进一步应用RT-PCR技术克隆出Foxp3的cDNA,通过凝胶电泳证实了克隆出了Foxp3的cDNA。

结论使用免疫磁珠方法能够分离出C57BL/6小鼠CD4+CD25+Treg细胞,并进行了Foxp3基因表达的鉴定。

【Abstract】Objective To confirm high purity CD4+CD25+Treg cells can be separated from the spleen of C57BL/6 mice and Foxp3 gene can be express in CD4+CD25+Treg cells.Methods CD4+CD25+Treg cells are separated with immunomagnetic beads,and purity is detected by flow cytometry.Foxp3 gene mRNA is extracted using TRIZOL.Foxp3 gene cDNA is reverse transcription using RT-PCR technology.Results This study separated CD4+CD25+Treg cell of 90%purity from the spleen of C57BL/6 mice,to advance used technology of RT-PCR to make the clone of Foxp3 gene cDNA,and confirmed it is the cDNA of foxp3.Conclusion This study CD4+CD25+Treg cell can be separated from the spleen of C57BL/6 mice with immunomagnetic beads,and identified foxp3 gene expression.【Key words】Immunomagnetic beads;CD4+CD25+Treg cells;Foxp3 gene肿瘤患者体内的免疫耐受是影响免疫治疗效果的重要原因,肿瘤免疫耐受的产生可能有两方面的原因:①肿瘤本身所产生的IL-10、TGF-β等免疫抑制性细胞因子;②机体自身的免疫抑制状态。

DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍

DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍

原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。

如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。

反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。

经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。

后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。

荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。

20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。

1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。

1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。

目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。

如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。

人教版高中生物选择性必修第3册 (基因工程) 基因工程(3)

人教版高中生物选择性必修第3册 (基因工程) 基因工程(3)
2. 能运用流程图的形式概括出基因工程的基本操作程序。
3.基于基因工程原理和操作程序，尝试提出某一转基因植物的方案并就其中的操作程序展开探究。
教学重点
基因工程基本操作程序的四个测与鉴定的方法。
教学过程(表格描述)
教学环节
主要教学活动
设置意图
如果不能直接导入棉花，那下一步应该怎么做？
观察基因表达载体的构成元件，用已有知识分析每一个元件的功能。构建重组质粒需用哪些工具酶？利用已学DNA重组技术的基本工具设计。
重组表达载体的筛选
目的基因导入受体细胞——大肠杆菌
问题：连接混合物能直接导入棉花受体细胞吗？如何改பைடு நூலகம்？
虽然体外构建表达载体，解决了目的基因的导入、复制和表达问题，但是连接产物仍然是混合物，如果直接导入棉花受体细胞，转化率低，需要筛选大量转化植株。为了提高转化率，可以先导入到大肠杆菌中，筛选正确的重组表达载体。导入大肠杆菌，需要先用CaCl2处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞，再将体外重组混合物分子（包含着重组质粒、质粒自身环化物、目的基因自身环化物等）溶于缓冲液中与感受态细胞混合，42℃短暂热激处理，完成转化过程。
引入新课
培育转基因抗虫棉的步骤
小结
教师创设转基因抗虫棉的产生背景和推广应用情况的情境，并利用这一情境，提出问题：“转基因抗虫棉是怎么获得的？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？”引发学生思考。
一、目的基因的获取
二、基因表达载体的构建
问题：怎样将Bt基因转入棉花？能否直接导入？引导学生说出已制备的目的基因，如果没有合适载体的协助，是很难进入受体细胞的，即使能进入，往往也不能进行复制和表达。
用概念图总结基因工程的基本操作程序的四部曲。
转基因抗虫棉是我国科学家自主取得的重大科技成果，了解相关知识背景能增强学生的民族自豪感和自信心，教师提出的问题又可以启迪学生

酵母双杂交.三杂交

酵母双杂交.三杂交
由于三杂交筛选是在细胞核中进行，而细胞核并非许多反应 发生的最佳场所，如有些蛋白质需要胞质酶的修饰，或在其定位 到核时的错误折叠及不稳定性，常不能检测到相互作用。有些哺 乳动物蛋白在酵母菌中不能正确折叠表达，以细菌、哺乳动物细 胞为宿主的杂交系统现已建立，能更真实的模拟相互作用发生的 自然细胞环境。对不能被转运到细胞核的蛋白质，如跨膜蛋白和 分泌型蛋白，酵母三杂交系统则不能应用。目前，酵母三杂交系 统仍是研究蛋白质与配体相互作用的有力手段，以后还可能发展 出研究RNA-RNA，多蛋白相互作用及功能更加强大的杂交系统。
其中第一个融合蛋白由两部分组成，一部分为能 结合lexA启动子的DNA结合结构域，另一部分为噬菌 体衣壳蛋白MS2。第二个融合蛋白也由两部分组成， 一部分为能激活lexA启动子的转录激活结构域，另一 部分为有待研究的RNA结合蛋白“Y”。
这两个融合蛋白通过第三个融合的RNA分子相连，其一 端为含有噬菌体衣壳蛋白MS2结合位点的MS2RNA，另 一端为有待研究的RNA“X”。一旦“X”和“Y”能有相互 作用就使得这个复合物形成一个功能性的转录激活因 子，从而使得下游的LacZ基因和His3基因得以表达。 LacZ基因的表达水平能够通过在体外检测β半乳糖苷酶 的活性来确定,His3基因的表达赋予了酵母细胞在缺乏 组氨酸的培养基上生存的能力。通过缺陷培养基及β半 乳糖苷酶的活性的测定就能判断在酵母菌内是否发生 了RNA“X”和蛋白质“Y”的相互作用。
negative selection by adding FOA)
酵母双杂交操作主要流程
1. 分别构建BD和AD融合蛋白载体
BD
2. 分别将重组载体转化酵母菌细胞
BD
3. 对酵母转化子进行自激活检测
AD AD

MAP3K3基因过表达通过多条信号通路激活CREB促进人肺腺癌细胞增殖及上皮-间质转化

MAP3K3基因过表达通过多条信号通路激活CREB促进人肺腺癌细胞增殖及上皮-间质转化

MAP3K3基因过表达通过多条信号通路激活CREB促进人肺腺癌细胞增殖及上皮-间质转化郭振辉;茆文莉;陈文雅;梁娇;侯聪艳;张韧;何彦丽【期刊名称】《广东医学》【年(卷),期】2022(43)8【摘要】目的通过体外干预有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3(MAP3K3)基因表达研究其对人肺腺癌细胞增殖、侵袭以及上皮-间质转化(EMT)的影响,探讨MAP3K3在肺腺癌发生、发展中的作用及可能的机制。

方法使用慢病毒转染构建稳定过表达MAP3K3的人肺腺癌细胞株H1299、A549,通过克隆形成实验、划痕实验及Transwell实验,检测细胞增殖、迁移及侵袭行为的变化;Western blot实验检测EMT相关蛋白波形蛋白(Vimentin)、钙黏蛋白E(E-cadherin)和钙黏蛋白N(N-cadherin)表达水平,检测MAP3K3下游信号分子AKT、mTOR、ERK1/2、JNK1/2及其磷酸化蛋白表达水平,检测过表达和敲低MAP3K3的H1299细胞p-CREB蛋白表达水平变化。

结果过表达MAP3K3基因后,H1299和A549细胞的增殖、迁移及侵袭能力明显增强,细胞的上皮表型分子E-cadherin下调,间质表型分子Vimentin和N-cadherin上调,p-AKT、p-mTOR、p-ERK1/2、p-JNK1/2以及p-CREB蛋白表达上调;使用shRNA稳定敲低MAP3K3后p-CREB蛋白表达明显下调。

结论人肺腺癌细胞株H1299和A549体外过表达MAP3K3基因后,可增强细胞增殖、迁移及侵袭能力,促进细胞EMT,其机制可能与MAP3K3通过激活多个下游信号通路,磷酸化激活CREB(环磷腺苷效应元件结合蛋白)有关,此研究可为基于该信号通路的新型靶向药物开发提供一些实验依据。

【总页数】6页(P939-944)【作者】郭振辉;茆文莉;陈文雅;梁娇;侯聪艳;张韧;何彦丽【作者单位】广州中医药大学基础医学院【正文语种】中文【中图分类】R329.21;R734.2【相关文献】1.瘦素激活PI3K/Akt信号通路分泌白介素8促进乳腺癌MCF-7细胞上皮间质转化2.基于TGF-β/smad信号通路探讨七方胃痛颗粒对人胃腺癌AGS细胞上皮间质转化过程的影响3.基于TGF-β/smad信号通路探讨七方胃痛颗粒对人胃腺癌AGS细胞上皮间质转化的影响4.肺腺癌细胞表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药相关上皮间质转化基因筛选及其调控通路分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

6-3基因的表达


[概念检测]
(1)线粒体中遗传信息的传递也遵循中心法则。
( √)
(2)DNA 病毒中没有 RNA，其遗传信息的传递不遵循中心法则。
( ×)
(3)若基因的碱基序列没有改变，则生物体的性状也不会发生改变。
( ×)
(4)吸烟会导致精子中 DNA 的甲基化水平升高，从而影响基因的表达。 (√)
[教材拾遗] 1．(必修 2 P73“思考讨论”)某种实验小鼠的毛色受一对等位基因 Avy 和 a 的控制， Avy
2． (必修 2 P75“拓展应用”)某种猫的雄性个体有两种毛色：黄色和黑色；而雌性 个体有三种毛色：黄色、黑色、黑黄相间。分析这种猫的基因，发现控制毛色 的基因是位于 X 染色体上的一对等位基因：XO(黄色)和 XB(黑色)，雄猫只有一 条 X 染色体，因此，毛色不是黄色就是黑色。而雌猫却出现了黑黄相间的类型。 请写出可行的解释。 提示：对于基因型为 XBXO 的雌猫，如果体细胞中携带黑毛基因 B 的 X 染色体失活， XB 就不能表达，而另一条 X 染色体上的 XO 表达，那么由该细胞增殖而来的皮肤上 会长出黄色体毛；同理，如果体细胞中携带黄毛基因 O 的 X 染色体失活，则 XO 不 表达，XB 表达，由该细胞增殖而来的皮肤上就会长出黑色体毛。因此，基因型为 XBXO 的雌猫会出现黑黄相间的类型。
4．表观遗传 (1)概念：生物体基因的碱基序列保持不变，但基因表达和表型发生可遗传变化的现 象。 (2)实例：柳穿鱼 Lcyc 基因和小鼠 Avy 基因的碱基序列没有变化，但部分碱基发生 了甲基化修饰，抑制了基因的表达，进而对表型产生影响。这种 DNA 甲基化修饰可以 遗传 给后代，使后代出现同样的表型。 (3)基因与性状的关系 基因与性状的关系并不是简单的一一对应 的关系。 ①一个性状可以受到多个基因的影响。 ②一个基因也可以影响多个性状。 ③生物体的性状也不完全是由基因决定的，环境 对性状也有着重要影响。

【高中生物二轮专题】《3基因工程》练习及详解

高三生物二轮复习专题练习3：基因工程一、选择题1.在基因工程操作中限制性核酸内切酶是不可缺少的工具酶。

下列有关限制性核酸内切酶的叙述错误的是( )A．一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B．限制性核酸内切酶的活性受温度和pH等因素的影响C．限制性核酸内切酶可以从某些原核生物中提取D．限制性核酸内切酶也可以识别和切割RNA2.已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如上图中箭头所指。

如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA 片段。

现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是( )线性DNA分子的酶切示意图A．3 B．4 C．9 D．123.质粒是基因工程中最常用的运载体，它存在于许多细菌体内。

质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。

外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，下表是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是( )①②③细菌在含氨苄青霉素能生长能生长不能生长培养基上的生长情况细菌在含四环素基上的能生长不能生长能生长生长情况A．①是c；②是b；③是aB．①是a和b；②是a；③是bC．①是a和b；②是b；③是aD．①是c；②是a；③是b4.下列叙述符合基因工程概念的是( )A．B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上5.一对等位基因经某种限制性核酸内切酶切割后形成的DNA片段长度存在差异，凝胶电泳分离酶切后的DNA片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱。

靶向调控大鼠海马 CNN3基因表达载体的构建及鉴定

靶向调控大鼠海马 CNN3基因表达载体的构建及鉴定孙俊梅;龙晶晶;韩雁冰;蔡雪梅;陆地;边立功;郭家智;李梅【摘要】目的：建立可调控大鼠局部脑区CNN3基因表达的技术，为进一步研究CNN3基因参与脑内病理生理过程奠定基础。

方法设计并合成针对CNN3基因的全长编码序列cDNA和3条shRNA干扰靶点序列，利用基因工程技术构建CNN3-OE和3个CNN3-shRNA慢病毒载体，在立体定位仪引导下注入大鼠海马，采用蛋白免疫印迹技术筛选CNN3基因的最佳沉默序列，并找出重组表达和沉默慢病毒载体调控海马CNN3基因的变化规律。

结果 CNN3-OE和3个CNN3-shRNA慢病毒干扰载体均构建成功，转染后8周内对海马CNN3基因水平均有一定调控作用，其中CNN3-shRNA2载体组在转染后的8周内海马CNN3基因编码蛋白calponin-3水平均显著性下调，最高抑制率为73.26％；CNN3-OE慢病毒载体组中海马calponin-3蛋白水平具有统计学意义的升高仅在转染后第14天，上调率为93.88％。

结论通过定位注射CNN3-OE和CNN3-shRNA慢病毒载体可在体调控局部脑区CNN3基因表达，为后续的机制研究和开拓疾病防治新途径奠定基础。

%Objective To establish a method focusing on regulation of CNN3 gene in the rat hippocampus and help to explore the role of CNN3 gene played in the brain physiology and pathology.Methods One cDNA sequence and three shRNAs targeting CNN3 gene were designed and synthesized.The recombinant lentivirus-mediated expressing and three short hairpin RNA ( shRNA) vectors targeting CNN3 gene in the rats were constructed with engineering technology.All recombinant vectors were intravenously injected into rats hippocampi guided by stereotaxic apparatus.Western blot was performed to explore the best shRNA and tostudy the changes of CNN3 gene in the rat hippocampus after transfection with the silence and over-expressed vectors.Results The lentivirus-mediated vector expressing CNN3-OE and three shRNA vectors targeting CNN3 gene were successfully constructed.Within eight weeks after transfection, the vectors of CNN3-OE and three CNN3-shRNAs changed the expression of CNN3 gene in the rat hippocampus, in particular, all the protein levels of calponin-3 encoded by CNN3 gene were significantly down-regulated along with the time, with the highest inhibitory rate of 73.6%in the CNN3-shRNA2 group.Significant up-regulation of calponin-3 protein level by 93.88%, was found only on the 14th day after transfection.Conclusions Lentivirus-mediated vectors of CNN3-OE and CNN3-shRNAs may regulate in vivo the CNN3 gene level in the local brain region of rats via stereotactic injection.The study lays a foundation for disease prevention and treatment in the future.【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2016(026)002【总页数】7页(P55-61)【关键词】CNN3;基因;沉默;重组;慢病毒载体【作者】孙俊梅;龙晶晶;韩雁冰;蔡雪梅;陆地;边立功;郭家智;李梅【作者单位】昆明医科大学第一附属医院神经内科，昆明 650031;昆明医科大学第一附属医院神经内科，昆明 650031;昆明医科大学第一附属医院神经内科，昆明 650031;昆明医科大学第一附属医院检验科，昆明 650031;昆明医科大学生物医学工程研究中心，昆明 650500;昆明医科大学生物医学工程研究中心，昆明650500;昆明医科大学生物医学工程研究中心，昆明 650500;昆明医科大学第一附属医院神经内科，昆明 650031【正文语种】中文【中图分类】R-331995年Maguchi等[1]首次分离出CNN3基因，其编码的calponin-3蛋白可与肌动蛋白、钙调蛋白、肌钙蛋白和原肌球蛋白结合，不仅分布在肝、肺、肾、肌肉、皮肤、卵巢[2-5]，还是calponin家族中唯一分布在中枢神经系统的一个亚型，在大脑、小脑和脑血管均有表达[6-8]，尤其是近年来研究显示CNN3基因及calponin-3蛋白异常可能改变大脑海马内神经元形态，甚至导致突触重塑[9，10]。

小鼠大脑基因实验报告(3篇)

第1篇一、实验背景随着神经科学研究的深入，理解大脑的基因调控机制对于揭示神经疾病的发生机理和开发新的治疗方法具有重要意义。

本研究旨在通过基因编辑技术，探究特定基因在小鼠大脑发育和功能中的作用，为相关疾病的预防和治疗提供新的思路。

二、实验目的1. 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除小鼠大脑中特定基因。

2. 观察基因敲除对小鼠大脑发育、行为和认知功能的影响。

3. 分析敲除基因对小鼠大脑中相关通路和基因表达的影响。

三、实验材料与方法1. 实验材料- 小鼠胚胎干细胞（ES细胞）- CRISPR/Cas9系统- 实验小鼠（C57BL/6小鼠）- 实验试剂：DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶、PCR引物等2. 实验方法（1）基因编辑1. 设计靶向特定基因的CRISPR/Cas9系统，包括sgRNA和Cas9蛋白。

2. 将sgRNA和Cas9蛋白导入小鼠ES细胞，进行基因编辑。

3. 对编辑后的ES细胞进行筛选，获得基因敲除的细胞系。

4. 将基因敲除的细胞系注射到C57BL/6小鼠的受精卵中，获得基因敲除的小鼠。

（2）小鼠行为和认知功能测试1. 观察基因敲除小鼠的生长发育、行为和运动能力。

2. 对小鼠进行认知功能测试，包括Morris水迷宫实验、Y迷宫实验等。

（3）基因表达分析1. 提取小鼠大脑样本，进行RNA提取和cDNA合成。

2. 利用PCR、RT-qPCR等方法检测敲除基因的表达水平。

3. 对小鼠大脑样本进行蛋白质组学分析，检测相关蛋白的表达水平。

四、实验结果1. 基因敲除成功敲除了小鼠大脑中特定基因，并通过PCR、RT-qPCR等方法验证了基因敲除的效果。

2. 小鼠行为和认知功能与野生型小鼠相比，基因敲除小鼠在Morris水迷宫实验中表现出明显的空间学习障碍，提示该基因可能参与小鼠的认知功能。

3. 基因表达分析敲除基因后，小鼠大脑中相关通路和基因表达发生了显著变化。

具体表现为：1. 神经递质合成酶的表达水平降低。

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每管加1ml Trizol 试剂（样品体积不超过Trizol 试剂体积的10％）， 迅速混匀（若样品较多可先将混好的样品置于冰上）；室温下净置5 －10分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离；
1. 加200 µ l的氯仿，用手剧烈摇荡15秒，室温下静置5分钟左右； 2. 2-8 ℃ ，12000g 离心10-15分钟；
第三部分：基因表达检测
基因表达检测的应用范畴
检测自然变异等位基因的表达差异； 检测突变体基因功能的丧失或获得； 检测转基因的表达：OX & 抑制 & 突变。
基因表达检测的技术手段
RT-PCR (Reverse transcription PCR) Real-time PCR=qRT-PCR Northern Blotting
2. PCR反应循环条件设置： 根据引物及基因的表达水平设 置循环参数：如扩增片段的长度及mRNA 的丰度等； 3. 检测：加2 l溴酚蓝，混匀，取15 l反应产物电泳； 4. 在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察。
PCR产物的电泳检测时出现拖带或 非特异性扩增带的可能原因
1. Taq酶过多； 2. Mg2+浓度不合适：Optimize [Mg2+] in a ladder of 0.5 mM; 3. 引物不特异、浓度过高、Tm值过高、引物形成二聚体; 4. 复性温度过低：三度幅度梯度提高; 5. 循环次数过多； 6. 模板量过多。
RT的两种关键酶
DNase I: 是将单链或双链DNA同等程度的随机分解，生
成具有5’－P末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。体外
转录后除去模板DNA。
反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶。如常见的鼠白
血病毒反转录酶 M-MLV
实验设计
本实验以水稻叶片RNA为材料，检测水稻种子大 小基因GS5突变体(或内源任意基因)的基因表达；
RNA的琼脂糖凝胶电泳进行质量检测
1. 用乙二醛/甲酰胺对RNA进行预变性，然后进 行琼脂糖凝胶电泳 2. 用甲醛和二甲基亚砜对RNA进行预处理，在 含6％或2.2mol/L甲醛的凝胶中电泳 3. 检测 0.5×TBE 4. 电泳：1× MOPS（3-(N-吗啉基）丙磺酸 ） 80 —150V 40 min —1h
基因表达分析的一般流程
Northern Blotting 反转录 RT-PCR (qRT-PCR)
RNA抽提
cDNA
基因特异性引导
Oligo(dT)引导
随机六核苷酸引物引导
Northern Blotting
PCR
Invented by Kary Mullis in 1983 and Awarded Nobel Prize for Chemistry in 1993
Contaminant Good ？ Degradation
Callus
Leaf
RNA降解的主要原因
1. 取样后没有立即抽提RNA； 2. 抽提过程中超作不当，样品量超过了许可的范围； 3. 样品运输、保藏不当，或RNA保藏不当，应放入70 ℃ ，而不是-20 ℃ ）； 4. 使用的溶液或器皿有RNase污染； 5. 琼脂糖变性胶（甲醛）电泳时pH值低于3.5。
7. 引物设计不合理，与模板不配对等。
RT-PCR与Northern杂交分析结果示意图（GS5）
1 l
1 l 1 l 20 l
6. incubate at 37℃ for 1 h. (The total volume should now be 20 l) ； 7. Inactive the reaction by heating at 70℃ for 10 min, then the first strand of cDNA can be used as a template for amplification in PCR；add 20-60ul ddH2O; -20-70 ℃; 8. To remove the RNA complementary to the cDNA, add 1 l (2 units) of RNase H and incubate at 37℃ for 20 min.
各个阶段严重威胁RNA的完整性。
用来使RNA酶不发挥作用的RNA酶抑制剂主要有：
1. DEPC（焦碳酸二乙酯 ）：形成组胺基团破坏RNase的活性；
2. 氧钒核糖核苷复合物：能与多种RNA酶活性位点结合RNA酶； 3. 蛋白质抑制剂：可与RNase形成非共价的复合物。
实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳
RNA的纯度和完整性对于Northern blot, RT-PCR和cDNA的构建等分子生物学实验都至关重要；
RNA分离的方法很多，最关键的因素是尽量减少
RNA酶的污染。
RNA操作中应注意的关键问题：
防止RNase污染
外源RNase的主要来源： 被污染的试剂，缓冲液 移液器 使用的器皿及tip等
Total RNA RNase-free DNase
x l (~5g)
１l (１u / l)
10× DNase buffer
add DEPC-treated ddH2O
1 l
to 10l
4. Incubate at 37℃ or room-temperature for 15 min, then adding 50mM EDTA 1l and, incubated at 70℃ for 10 min to inactive DNase I；
操作步骤（三）: PCR
1. 在冰上配制下列反应体系 :
First strand cDNA Taq (5 u / 1 l) 10 × Ex Taq buffer dNTP mixture (2 mM) Primer F (10 mM) Primer R (10 mM) ddH2O 2l 0.3 l 2 l 2 l 0.25 l 0.25 l 13.2 l
4. 防止外源RNase的污染：
应戴口罩和手套，环境洁净； 玻璃器皿180º C烘烤3 hrs以上； 一次性用品如tube、 tip、塑料制品等使用DEPC蛋白质变 性剂处理，或者用新的、无RNA酶的产品； 电泳槽相关的用0.4M 的NaOH处理，再用DEPC水洗3遍。
操作步骤
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液氮取样，液氮磨样，每管分装0.1克样品；
RNA抽提前应准备的其它试剂及物品
1. 75％乙醇（in DEPC-treated water) 2. 氯仿、异丙醇（RNA专用） 3. RNase-free water：Draw water to RNase-free glass bottles. Add diethylpyrocarbonate （DEPC）to 0.1% . Let stand overnight and autoclave.
带评价RNA质量
实验材料：水稻幼嫩叶片
提取方法
苯酚/氯仿反复抽提 ，价廉但质不优， 尤其是对多酚等含量高的材料不适 蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法 强变性剂法。硫氰酸胍，盐酸胍等，可
配合氯化铯离心或有机溶剂提取。
Trizol Reagent
利用Trizol试剂抽提植物总RNA原理
操作者的手、口、头发等
防止外源RNase污染的主要措施
1. 处理并专用：移液器、玻璃器皿、离心管、枪头、溶液、 缓冲液、RNA电泳装置用0.1％的DEPC在37º C处理溶液1小 时后，有的再高压蒸气灭菌15 min，烘干备用；
2. 180－300º C烘烤玻璃器皿4hrs以上或用其它灭活RNA酶的 商品化产品处理塑料制品；
RNA产量低的原因
1. 样品研磨不彻底，没有混匀，裂解不彻底
2. RNA没有完全溶解
DNA污染的原因
样品太多，所加试剂相对太少
用来分离RNA的样品中含有机溶剂
（乙醇，DMSO等），或碱溶液等
RT-PCR (Reverse transcription PCR)
实验目的：学习RT-PCR的原理及其操作过程 实验材料：水稻幼嫩叶片RNA
实验中设置一个内参基因作为阳性对照，判断
RNA的定量及反转录、PCR等过程是否有问题； 设置一个不加模板RNA的阴性对照，主要是消除 DNA及PCR试剂方面引起的假阳性； 同时设置一个以叶片DNA为阳性对照，检验扩增 带型是否来源于反转录的cDNA。
操作步骤（一）RNA Preparation
1. Prepare the plant total RNA by TRIzol Reagent； 2. Test the RNA concentration by Nano2000； 3. Combine the following in a 0.5 ml sterile eppendorf tube:
导致PCR产物很少或无扩增产物的原因
1. 点样或染胶问题;
2. 反应体系中忘记加入某种成分(无扩增产物）或分装mixture时 出了问题；
3. 目的片段太大，使用的DNA Polymerase无法扩增出目的片段；
4. DNA溶液中或反应体系中含有Taq酶抑制剂；
5. 退火温度太高； 6. Taq 酶活力不够或其他试剂有问题；
Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽
提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解 细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分 离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA; 用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少，可 以用来做Northern，RT-PCR，分离mRNA，体外翻译和分子 克隆等。
有溴化乙锭存在时，电泳后28S rRNA和18S rRNA
在紫外灯下应当很清楚的看得到，还应当有一条由 tRNA，5.8S rRNA和5S rRNA组成的较模糊的迁移较快 的带。如果RNA没有降解， 28S rRNA的亮度应当是18S rRNA的2倍，且这两条带都没有弥散现象。