分子生物学综合实验实验报告
本次试验报告分为三个部分：
第一：每个基本实验的目的，原理，材料，试剂与仪器。
第二：以GFP质粒，P38质粒，植物DNA和植物RNA为材料的四个综合试验的实验过程。第三：试验总结。
第一部分：每个基本实验的目的，原理，材料、试剂与仪器：质粒DNA的提取
一、目的
学习碱裂解法提取质粒的原理
二、原理
质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，经人工改造的质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。
质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
三、实验材料、试剂与主要仪器
（一）实验材料
含质粒的大肠杆菌DH5α
（二）试剂
1. LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于1000mL蒸馏水中，用NaOH调pH至7.0。高压灭菌20分钟。
2. LB平板培养基：在每1000mL LB液体培养基中中加入15g琼脂，高压灭菌20分钟。
3. 溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖,10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)。
4.溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH,1% SDS。（必须新鲜配制）
5.溶液Ⅲ：pH4.8的醋酸钾溶液（5mo1／L乙酸钾60 ml，冰乙酸11.5 ml，水28.5ml）。
6. TE缓冲液（pH 8.0）：10 mmol/L Tris-HCl,1mmol/ L EDTA。
7. 无水乙醇和70%乙醇。
（三）仪器
1. Eppendorf管、离心管架
2. 10，100，1000μl微量加样器
3. 台式高速离心机
4. 摇床、高压灭菌锅
琼脂糖凝胶电泳法检测DNA
一.目的
学习琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度，DNA的构型，含量以及分子量的大小。二.原理
琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方法，它简单易行，只需少量的DNA 就能检测。其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物；使得DNA发射的荧光，增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照，就可比较出待测样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外光下照射拍照，只需5~10ng DNA，就可以从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测到0.01~0.1ng的DNA。
在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着正极移动，在用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定，提高分辨率。同时适当降低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。
当然也可以用同样的方法检测RNA。
三、试剂与主要仪器
（一）试剂
1. DNA样品
2. TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍（配制见附录）
3. 点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油
4. 溴乙啶(EB)：10mg/ml溴乙啶（注意：该试剂具致癌作用，用时要小心）
5. 琼脂糖
（二）仪器
1. 电泳仪系统
2. 紫外灯
3. 恒温水浴箱
质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定
一、目的
学习质粒的酶切及电泳分析。
二、原理
限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。
质粒DNA在细胞内有三种构象：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；③线状DNA，双链DNA断开成线状。电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其
次是线状DNA和开环DNA。因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2~3条区带。
三、试剂与主要仪器
（一）试剂
1.EcoRⅠ酶
2.λDNA
3.TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍
4.点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油
5.溴乙啶(EB)：10mg/ml溴乙啶（注意：该试剂具致癌作用，用时要小心）
6.琼脂糖
（二）仪器
1.电泳仪系统
2.紫外灯
3.恒温水浴箱
聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA
一、目的
1.学习PCR反应的基本原理和实验技术。
2.了解引物设计的一般要求。
二、原理
聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术。利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片段，以用于基因工程操作。
PCR进行的基本条件：
⑴DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）
⑵引物
⑶dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）
⑷Taq DNA聚合酶
⑸反应缓冲体系
PCR循环由三个步骤组成：
⑴变性使模板DNA解离成单链；
⑵退火使引物与模板DNA所需扩增序列结合；
⑶延伸DNA聚合酶利用dNTP合成与模板碱基序列互补的DNA链。
每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
引物设计：要保证PCR反应能准确，特异，有效的对引物DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下原则：
⑴引物长度：15~25个核苷酸；
⑵GC含量为40%~60%；
⑶Tm值为55℃（Tm=4（C+G）+2（A+T）计算；
⑷引物与非特异配对位点的配对率小于70%；
⑸引物自身配对形成的茎环结构，茎的碱基对小于3，
⑹两条引物间配对碱基数小于5个。
由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计。
本实验以实验二中提取的质粒DNA为模板，进行PCR扩增，大量得到目的DNA片段。
