分子生物学实验设计

试验流程：
样品采集，编号
CTAB法提取样品 DNA 检测DNA浓度及 纯度 PCR扩增
LSU和SSU 序列扩增 引物设计
PCR体系 参数的优 化
DNA检测及 琼脂糖凝胶 DNA的回收
测序
具体实验步骤：
3.4 DNA提取
采用改良的CTAB法提取牛肝菌基因组DNA。 ①称取0.12g左右的干燥样品，加入液氮后研磨至粉状，迅速加入-CTAB500µl， 混匀后置移至1.5mL离心管中，65℃水浴振荡抽提60min； ②冷却后加入300μl的氯仿和等体积的Tris饱和酚，混匀后65000r离心30min； ③重复步骤② 一次； ④取上清，先加入1000µl 无水乙醇，混匀，放入-20℃冰箱中沉淀1h或者过夜； ⑤取出，12000r离心10min，弃上清液，沉淀依次用1000μl 75%乙醇洗涤两次， 每次10000r离心2min，后弃上清、风干 ； ⑥加入50μl TE缓冲液或去离子水溶解，4℃冰箱保存。
四、数据分析
将所得数据输入EMGA软件，构建系统发育树。
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其中牛肝菌类是云南市场上最为重要的食用菌。牛肝菌类有近 40钟常见食用菌，主要分布有9属：牛肝菌属、疣柄牛肝菌属、绒 盖牛肝菌属、圆孔牛肝菌属、小牛肝菌属、粉孢牛肝菌属、褶孔牛 肝菌属、乳牛肝菌属和粉末牛肝菌属。滇中市场上以牛肝菌属为主， 占总贸易量至少70%。牛肝菌类以美味牛肝菌、黑牛肝菌、褐疣柄 牛肝菌最为常见,同时美味牛肝菌也是国际著名的食用菌,在欧洲国家 深受欢迎,是出口创汇的重要种类之一。
3.5 DNA纯度及浓度检测
原来是使用紫外分光光度计测定波长在230nm、260nm、280nm处的OD值， 根据260nm处的OD值计算DNA浓度，根据260/280、260/230值确定DNA的纯 度。现在可用核酸蛋白仪测定提取的DNA的浓度和纯度。
3.6LSU和SSU序列扩增引物
使用NCBI或其他引物设Βιβλιοθήκη Baidu软件设计特异性引物。
具体实验步骤：
3.7.4DNA检测
1.取0.1g琼脂糖加入100mL电解液中溶解，放入微波炉中加热30s，重复此步骤直 到溶液澄清（一般2次）左右，后取出，等溶液冷却至50~60℃左右； 2.取核酸染料滴入上述缓冲液（5滴），导入电泳槽中，插入梳子，等其冷却至凝 固后拔出梳子； 3.点样：取溴酚蓝2uL与5uL的DNA样品混合； 4.80V电压下电泳20~30min; 5.电泳结束后取出凝胶，在紫外灯下检测。
3.7.3最佳退火温度的确定
分别设定LSU和SSU退火温度，并对扩增产物电泳检测： 取PCR产物5μl，上样缓冲液2μl，混匀，点入含0.75μl核酸染料的1.8%琼脂糖 凝胶中，点入DL2000 Marker，用1×TAE缓冲液，80V电压下电泳80min，于紫外 检测仪下观察条带。因此确定牛肝菌LSU-PCR中最佳退火温度和SSU-PCR中最 佳退火温度。 综合以上PCR体系参数的优化，可的得出最优反应条件
目前,核糖体 DNA的转录间隔区 ITS区、 大亚基片断 LSU r DNA (即 28S RNA )以及小亚基片断SS U r DNA (即 18S RNA) 等基因在原核生物研究中得到了广泛、 有效地应用，但在大型 真菌鉴定中的应用较少。 其中 LSU r DNA虽然较 ITS区保守 ,但它较 SSU r DNA变异 高 ,是一段由保守区与高变区相互镶嵌的 DNA片段,适合从种到 属的分类鉴定。
具体实验步骤：
3.7.1 PCR体系参数的优化
PCR扩增体系中，Taq酶用量、镁离子浓度、dNTP、引物及模板浓度 及退火温度均会对扩增结果产生影响，其中扩增模板浓度与退火温度对其 影响最大，直接关系到扩增产物的多少和有无。采用正交实验设计方法， 以Taq酶浓度、镁离子浓度、dNTP浓度、引物浓度四种因素，取A、B、C 3种水平，见表2，对PCR反应体系进行优化。
一、研究概况
在云南，可食用的牛肝菌主要根据子实体的颜色被通俗地分为“白牛肝”， “黄牛肝”和“黑牛肝”，其中“白牛肝”即实际分类学上的“美味牛肝菌” 在贸易中占有重要的地位。从分类学上看，广义的美味牛肝菌复合群包括以下 5个种:美味牛肝菌(Boletus edulis Ball.ex Fr)、褐红牛肝菌(B.pinophilus Pilát & Dermek)、铜色牛肝菌(B.aereus Ball.ex Fr)、网纹牛肝菌(B.Reticulates Schaeff)和夏生牛肝菌(B.aestivalis(Paul.)Fr)这5个种。
一、研究概况
云南省具有复杂的地形地貌和特殊的气候条件以及多种多样的 森林类型和土壤种类。在这样得天独厚的自然生态条件下，孕育了 丰富多彩的食用菌资源。云南的野生食用菌加上人工栽培种类食用 菌有800种左右，食用菌种类约占世界的约40%，占全国的85.3%左 右；绝大多数属于口蘑科、牛肝菌科、红菇科、蘑菇科、裂褶菌科、 多孔菌科、珊瑚菌科和丝膜菌科等类群。
基于LSU基因和SSU基因的 广义美味牛肝菌系统发育研究
姓名：李静娴 专业：生物工程 导师：马绍宾 学号：12015002274
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一、研究背景
二、研究目的及意义 三、实验设计 四、数据分析
核糖体 DNA ( ribos omal DNA, r DNA)是国际上公认的生物 各类群各分类水平比较研究的一个很好的分子指标 ,它是一类中 等重复的 DNA序列 ,每个重复单位都由非转录间隔区、 转录间 隔区和 3种 RNA ( 18SRNA, 5 . 8S RNA)基因编码组成.核糖体 DNA在细胞中以一种协同方式进化 ,在个体和群体内有着较好 的均质性 ,因此个体的 rDNA通常具有种代表性 ,即少量个体的 抽样亦能有效地代表其来源群体的 DNA变异情况。
二、研究目的及意义
牛肝菌科(Boletaceae)真菌具有重要的生态和经济价值。云南省是美味牛肝菌 最重要的主产区，但是由于近年来不合理的采收、生存环境的破坏以及人工栽培 技术的滞后，使美味牛肝菌呈现出产量日益减少。要发展和壮大我国牛肝菌产业， 使资源得到可持续利用，正确认识物种及其生物学特性是进行研究工作的基础。 目前针对牛肝菌属进行的分子系统学研究，多采用多个基因（3~4个）。综合 利用多个基因序列、形态特征及生态特征进行联合系统发育分析，可得到较为准 确的能反映牛肝菌属的种类多样性状况及系统发育关系的结果。 基于LSU和SSU的系统发育分析，国外和国内都很少有报道。本研究试图选 取牛肝菌科中的广义美味牛肝菌属，选用LSU和SSU分析构建系统树。研究的主 要目的一是分析牛肝菌的类群划分及类群下已知种间的关系，为羊广义美味牛肝
具体实验步骤：
3.7.5琼脂糖凝胶DNA的回收
回收的步骤如下： ⑴在长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽量切掉不含 DNA的凝胶。 ⑵先秤取空的1.5ml的离心管的重量，然后将切下含有DNA条带的凝胶放入 1.5ml离心管中秤重，两次秤得的重量相减便是凝胶的重量。 ⑶向1.5ml的离心管中加入600μl的凝胶/结合液DB。 ⑷56℃水浴放置10min直到凝胶完全溶解，并且每2-3min斡旋振荡一次帮助凝 胶加速溶解。 ⑸加入150μl的异丙醇，并振荡混匀。 ⑹将步骤⑸获得的溶液加入到吸附柱AC中，并将吸附柱放入到收集管中，在 12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液 ⑺加入700μl漂洗液WB，12000rpm离心1min，弃掉废液。 ⑻加入500μl漂洗液WB，12000rpm离心1min，弃掉废液，重复一次。 ⑼12000rpm下离心2min。 ⑽将吸附柱AC放回空收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免 漂洗液中残留乙醇而抑制下游反应。 ⑾取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加35μl洗脱 缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心1min。 测序：送至测序公司测序。
菌菌属系统发育提供详实的分子证据。
三、实验设计
3.1实验材料 在野外调查时采集研究材料，新鲜牛肝菌采集后用硅胶干燥或自然风干 后备用。 3.2实验仪器 电子天平；水浴箱；常温超速离心机；北京六一仪器厂电泳槽；Bio Rad电泳仪；WD-9403F型手持紫外分析仪；GE9700 PCR仪； Beckman UV640型紫外分光光度计；Gensnap凝胶成像仪。 3.3 实验试剂 1×CTAB DNA提取液；TE缓冲液；氯仿；苯酚；异戊醇；异丙醇；β巯基乙醇；乙酸钠；70%乙醇；76%乙醇；核酸染料；上样缓冲液（含 0.25%溴酚蓝，40%蔗糖）；dNTP；DL2000Marker；DL5000Marker； MgCl2；10×Buffer；TapDNA聚合酶；NS1/NS8引物；LROR/LR5引 物。
具体实验步骤：
3.7.2模板浓度的确定
扩增产物电泳检测：取PCR产物5μl，上样缓冲液（含0.25%溴酚蓝，40%蔗 糖）3μl，混匀，点入含0.5μg/ml溴化乙锭（2μl）的1 %琼脂糖凝胶中，点入 DL2000 Marker，用1×TAE缓冲液，80V电压电泳80min，于紫外检测仪下观察， 条带清晰度，并比较以确定牛肝菌LSU和SSU-PCR中模板的最佳浓度。
具体实验步骤：
根据上面的因素及其水平的设计，进行4因素3水平正交试验，即L9（34），9个 处理结果存在明显差异（见图1），并根据这9中处理结果分析正交试验极差分析（见 表3）。
据ki值大小可知，各因素优化水平组合为：TaqDNApolymerase 2U，Mg2+ 2.0 mmol· L－1，Primer 0.4µmol· L－1，dNTP 0.2 mmol· L－1 。