双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法

DNA双脱氧末端终止法一、引言DNA双脱氧末端终止法（DNA double-stranded termination method），又称为Sanger测序法（Sanger sequencing），是一种经典的测序技术，于1977年由Frederick Sanger等人首次发表。

它是一种利用DNA聚合酶合成DNA链过程中的特殊终止作用分析DNA序列的方法。

本文将从原理、步骤、优缺点等方面对DNA双脱氧末端终止法进行详细的解释和探讨。

二、原理DNA双脱氧末端终止法基于DNA聚合酶的特殊性质，即当DNA聚合酶在合成DNA链过程中遇到双脱氧末端核苷酸（ddNTP）时，合成过程会终止。

与普通核苷酸（dNTP）不同，双脱氧末端核苷酸缺少3’位的羟基，无法连接到新的核苷酸，导致DNA链的延伸终止。

根据不同的碱基，分别使用带有不同荧光标记的ddNTP，例如A荧光标记的ddATP、C荧光标记的ddCTP、G荧光标记的ddGTP和T荧光标记的ddTTP。

将DNA模板与DNA聚合酶、引物、dNTP和ddNTP一起反应，可以合成出含有不同长度的DNA片段。

通过将反应产物进行电泳分离，并利用自动DNA测序仪检测不同荧光标记的信号，就可以得到DNA序列。

三、步骤DNA双脱氧末端终止法包括以下主要步骤：1. PCR扩增首先需要从待测DNA样本中进行PCR扩增，以获得足够数量的DNA模板。

PCR扩增可以使用特定引物选择性地扩增目标DNA片段，增加检测的敏感性和特异性。

2. 反应体系制备在反应管中将PCR产物与适量的DNA聚合酶、引物、dNTP和荧光标记的ddNTP混合，制备合适的反应体系。

其中不同颜色荧光标记的ddNTP分别代表A、C、G和T。

3. DNA链合成将反应体系进行热循环反应，通过不断提高和降低温度，使DNA链聚合酶合成DNA 链。

在这个过程中，当聚合酶遇到带有荧光标记的ddNTP时，会发生终止，形成不同长度的DNA片段。

Sanger测序，也被称为双脱氧链终止法，是一种用于确定DNA或RNA序列的技术。

以下是其原理和步骤：
原理：
Sanger测序基于DNA聚合酶的DNA合成过程，通过添加双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）来终止DNA链的延伸，从而得到一系列不同长度的DNA片段。

ddNTP与普通dNTP的区别在于其3′端缺少一个羟基，这使得ddNTP在DNA合成过程中不能形成磷酸二酯键，从而导致DNA合成反应中断。

通过在反应中加入四种不同的ddNTP，可以得到包含不同长度的DNA片段，从而揭示出DNA分子中核苷酸的顺序。

步骤：
DNA模板制备：从待测序的DNA样品中提取出目标DNA片段，并进行PCR扩增，得到足够的DNA模板。

DNA合成反应：在PCR扩增反应中，加入四种不同的dNTP和一种ddNTP。

由于ddNTP可以随机地终止DNA链的延伸，因此可以得到一系列不同长度的DNA片段。

电泳分离：将得到的DNA片段进行电泳分离，使不同长度的DNA 片段得以分离。

检测：通过放射自显影等技术对电泳结果进行检测，从而确定DNA 序列。

[目的]掌握双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法[原理]DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3’-OH末端上进行的。

由于2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)的3’-位脱氧而失去游离-OH，当它参入到DNA链后，3’-OH末端消失，使DNA链的延伸终止。

本实验根据此原理，将待测DNA片段插入单链噬菌体M13载体，并用合成的寡聚核苷酸引物与该载体上插入待测片段的上游顺序退火，随后在T7DNA聚合酶催化下进行延伸反应。

实际操作中同时进行，分别终止于A、G、C和T的4个反应体系。

每个反应体系均含4种脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)底物，其中—种dATP为32P标记物，以便能用放射自显影法读序。

但在这4个反应体系中，分别加一种低浓度的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP)，这样ddN TP可随机参入正在延伸的DNA链上，使链延伸终止。

例如在“A”管中加ddATP，反应结束时，管内所有新合成的DNA链都是以A结尾的不同长度的片段，而且这些片段都带放射性。

将反应物加在高分辨凝胶上电泳，DNA片段则因其长度不同(分子量大小不同)被分离，短的走在前端，长的泳动在后面。

其他3管则分别为以G，C或T结尾的不同长度DNA片段。

由于：①即使是长短相差一个核苷酸的DNA片段，亦可根据其电泳距离的差异而加以区分；②A、G、C和T4种反应体系的产物在电泳凝胶中相邻排列。

故而在阅读凝胶电泳的放射自显影图像时，由下至上按前后顺序即可将DNA的核苷酸顺序读出。

[操作]1．单链模板与引物退火(1)用无菌蒸馏水按1：5稀释通用引物(约4.44μg/ml)。

(2)取1.5ml微量离心管1只，加入下列试剂：模板DNA(1.5-2ugDNA/10μl)10μl；稀释通用引物2μl；退火缓冲液2μl,总体积14μl。

2．链延伸/终止反应(1)稀释T7DNA聚合酶：取2μl(或4μl)冷的酶稀释缓冲液至1只微量离心管中，加入0.5μl(或lμl)T7DNA聚合酶，用加样器轻轻抽吸和排出而混匀，置冰浴中待用。

双脱氧终止法的原理(一)双脱氧终止法1. 介绍•双脱氧终止法是一种常用的DNA测序技术，也被称为Sanger测序法。

它是由弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）在20世纪70年代开发的。

•这种技术基于DNA的合成与复制原理，通过测定DNA链上不同位置的碱基序列，从而揭示DNA分子的结构和功能。

2. 原理该方法主要包括以下步骤：DNA复制•首先，需要复制待测DNA片段。

这一步通过PCR（聚合酶链式反应）来实现，PCR能够使DNA在体外被扩增成大量拷贝。

dNTP与ddNTP的标记•在复制的过程中，需要加入一种更特殊的DNA构建块：ddNTP （2’, 3’- 二脱氧核苷三磷酸），与普通的dNTP（2’, 3’-二脱氧内苷三磷酸）有所不同。

•ddNTP会在DNA链的延伸过程中停止进一步延伸，而dNTP可以持续延伸。

反应体系•反应体系中，含有待测DNA片段的DNA模板、引物（合成DNA的起始点），dNTPs（分子内苷三磷酸）、ddNTPs和DNA聚合酶。

•反应体系中含有4种不同的ddNTP，分别对应A、T、C和G四种碱基。

DNA合成与终止•反应进行时，聚合酶从引物延伸模板，向复制链上加入适当碱基，与模板DNA的互补碱基对应。

•当遇到某个ddNTP时，链的延伸被终止，因为ddNTP没有羟基(OH)可以与下一个碱基连接。

•这样，在反应体系中就会产生一系列碱基长度不同的DNA片段。

碱基定序•终止反应后，产生的DNA片段通过电泳分离。

电泳是一种根据DNA片段大小和电荷质量之比进行分离的技术。

•在电泳过程中，DNA片段会根据其长度从短到长依次分离出来。

•最终，可以以碱基对应的顺序来识别不同长度的DNA片段，从而得出DNA的碱基序列。

3. 结论•双脱氧终止法是一种可靠而有效的DNA测序技术，被广泛应用于生物学、医学等领域。

•通过特殊标记的ddNTP与普通的dNTP的结合，可以在延伸过程中终止链的延伸，从而产生一系列长度不同的DNA片段。

Sanger双脱氧链终止法原理在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA 的核苷酸序列。

双脱氧链终止法是现在应用最多的核酸测序技术，由Sanger 等1977年提出。

其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。

如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。

反应终止后，分四个泳道进行电泳。

以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

(一) Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序操作程序是按DNA 复制和RNA反转录的原理设计的。

1.分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链。

2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记dATP，例如?32 PdATP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸)。

3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理)结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。

当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。

ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。