P53基因在血细胞中的表达

RT PCR 方法检测细胞中p53基因的特异表达预习报告1310301315 张铨一、RT PCR技术1.基本原理聚合酶链反应(PCR)技术是利用DNA聚合酶在体外条件F．催化一对特异引物之间特异DNA片段合成的基因扩增技术。

PCR包括三个基本过程：(1)变性，在高温度条件下使双链模板DNA变性、解链，成为两条单链DNA；(2)退火，在较低温度时使加入的引物单链DNA模板特异性结合；(3)延伸，在适当的温度下，Taq DNA聚合酶从结合到DNA模板上的引物3’-OH 端开始．根据碱基互补配对原则，按照DNA模板核苷酸序列，进行DNA链的延伸，合成与模板互补的新的DNA分子，，这三个过程组成一个循环周期；每个周期合成的产物又可作为下一个周期的模板，如此循环往复，经过若干次循环后，目的DNA片段的拷贝数大最增加。

RT-PCR方法由两部分组成：(1)cDNA的合成：以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下以Oligo（dT）16或特异的下游引物合成与mRNA互补的cDNA片段(2)PCR扩增：以已合成的cDNA为模板，使用上、下游引物在耐热的DNA聚合酶作用下进行标准的PCR扩增。

12.实验方法【实验材料】1．试剂(1)β-actin引物上游引物：5 7一ATG CGA ATT CCC AAC CGT GAA AAG ATG A-3’下游引物：5 7一ATG CGG ATC CGA AGG AAG GCT GGA AAA一3’(2)Promega RT-PCR试剂盒(3)酚／氯仿：1：1混合(4)醋酸钠：3mol／L，pH5．2(5)无水乙醇2．仪器基因扩增仪(PCR仪)，5415R型离心机，电泳仪，电泳槽，紫外检测仪，制冰机，低温冰箱，可调式取液器，解剖用具。

3．耗材0．2ml、1．5ml Ep管，20μl和200μl吸头若干个。

【实验步骤】1．反转录合成cDNA(1)RNA预变性(打开RNA二级结构)：取1支0．2ml Ep管加入样品RNA 2μl无RNase水 7μl70℃，10min，立即置冰上。

RT-PCR方法检测细胞中p53基因的特异表达一、实验原理细胞内RNA通常与蛋白质结核，防止RNA酶讲解，以核蛋白形式存在。

分离制备RNA 是必须先破碎细胞，使得核蛋白释放到溶液中，并进一步与蛋白质分离，然后再讲RNA 与其他成分分离，并保证RNA的完整性。

1、Trizol法该法分离提取RNA产率高、纯度好且不易降解，是目前实验室中最常用的提取RNA的方法。

Trizol是一种总RNS抽提试剂，含有苯酚（蛋白质变性，膜蛋白变性、膜磷脂溶解、RNA酶变性保护RNA）、异硫氰酸胍（蛋白质变性、RNS酶抑制剂）等物质，可以迅速溶解细胞同时保护RNA完整性。

之后再加入氯仿抽提，离心后，RNA位于水相，用异丙醇可沉淀回收水相中的RNA。

2、RNA质量标准RNA的均一性以及完整性，均一性在于有效去除其他成分，完整性在于最大限度减少RNA酶对RNA的讲解。

通常采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度：A260/A280=1.7~2.0，低于该值表明有蛋白污染。

PCR3、PCR聚合酶链式反应是一种体外大量扩增特异DNA片段的分子生物学技术。

利用两段已知序列度寡核苷酸作为引物，将两引物间特定的DNA片段进行复制，经过多次循环，使得模板上特定DNA拷贝数呈指数级增长。

其基本过程分为变性、退火、延伸三个步骤。

变性是高温加热导致模板DNA双链间的解离，退火是降低温度使得模板DNA与高浓度引物间发生互补结合，延伸是在耐热DNA聚合酶参与下延伸引物。

每次循环可作为下一次循环的模板，因此每经过一次循环特定DNA的分子数目扩增一倍。

4、RT-PCR反转录聚合酶链式反应是将mRNA反转录合成cDNA后再经PCR进行大量扩增。

RT-PCR实质上是对mRNA的扩增，我们常用此法克隆cDNA或分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况。

成熟的mRNA3’端有Poly尾可与Oligo特异性结合，然后在反转录酶催化下以mRNA为模板合成一条互补DNA链称为cDNA。

人野生型p53基因的克隆及原核表达王继;高瑞娟;袁大巍;王丽【期刊名称】《吉林大学学报（理学版）》【年(卷),期】2009(47)5【摘要】利用RT-PCR方法由人外周静脉血淋巴细胞中获得人p53 cDNA片段,并将其克隆入原核表达载体pQE40中,构建重组质粒pQE40-p53;转化于E.coliM15宿主菌,经IPTG诱导,表达了N端融合6His的p53融合蛋白.利用6His与Ni2+高亲合力结合的性质,经镍柱纯化、透析袋分级透析复性、 Western Blot鉴定,结果表明获得了纯化的6His-p53融合蛋白.【总页数】4页(P1077-1080)【作者】王继;高瑞娟;袁大巍;王丽【作者单位】东北师范大学,遗传与细胞研究所,长春,130024;东北师范大学,遗传与细胞研究所,长春,130024;东北师范大学,遗传与细胞研究所,长春,130024;东北师范大学,遗传与细胞研究所,长春,130024【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.卵巢癌的p53基因治疗实验研究——人野生型p53基因真核细胞表达质粒的构建 [J], 关婷;崔满华;李守柔PIO增强MRI检测人野生型p53基因转染动脉粥样硬化易损斑块的研究 [J],陈荣红;祁春梅;李东野;蔡文标;武维恒;姚丽娜;张超3.稳定表达野生型p53基因人骨肉瘤细胞株的建立与鉴定 [J], 雷晓晶;韩鹏飞;吕智4.脉冲电场联合野生型p53基因诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡 [J], 李好山;熊正爱;周玮;李成祥;姚陈果;孙才新5.尿刊酸修饰的壳聚糖介导野生型p53基因转染对人肺腺癌细胞系H1299增殖和凋亡的影响 [J], 王伟;姚静;周建平;李夷平;陶磊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

doi ：10．3969/j．issn．1002－7386．2019．04．007·论著·不同大肠组织中PTTG 、p53和TSP-1的表达及与血管生成的关系马艳会作者单位：100000北京市房山区良乡医院【摘要】目的检测不同大肠组织中垂体肿瘤转化基因PTTG 的表达，并分析其与凝血酶敏感蛋白TSP-1及p53蛋白表达和微血管密度计数（MVD ）的相关性，探讨其在大肠癌发生、发展中的作用。

方法采用免疫组织化学EnVision 法进行检测表达，CD34标记血管内皮细胞并计数MVD 。

结果PTTG 在正常组与腺瘤组，正常组与大肠腺癌比较差异有统计学意义（P ＜0．05）。

PTTG 蛋白与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移及分化程度有关（P ＜0．05）。

TSP-1蛋白在正常大肠组织及大肠腺瘤组和大肠腺癌组比较差异有统计学意义（P ＜0．05），且与浸润深度有关（P ＜0．05）。

P53在正常大肠组织中无表达，在大肠腺瘤及大肠腺癌中表达则依次增多，正常大肠组织和腺瘤组与大肠腺癌组相比较有统计学意义（P ＜0．05）。

在正常大肠组织、大肠腺瘤、大肠癌中的平均微血管密度分别是（67ʃ26，30ʃ7，11ʃ4）。

PTTG 表达与MVD 、p53表达均呈正相关（P ＜0．05），p53表达与MVD 呈正相关（P ＜0．05），PTTG 与TSP-1呈负相关（P ＜0．05），TSP-1与p53呈负相关（P ＜0．05），PTTG 与TSP-1表达呈负相关（P ＜0．05），TSP-1阳性表达与MVD 呈负相关（P ＜0．05），P53与TSP-1呈负相关（P ＜0．05）。

结论大肠腺癌组织中PTTG 蛋白过表达参与了大肠腺癌的发生及演变过程。

PTTG 、p53和TSP-1在大肠腺癌的表达失衡是其肿瘤血管异常生成的重要原因。

【关键词】垂体瘤转化因子；p53；凝血酶敏感蛋白；微血管密度；大肠腺癌；免疫组化【中图分类号】Ｒ730．2【文献标识码】A 【文章编号】1002－7386（2019）04－0511－05The expession of PTTG ，p 53，TSP-1in colonrectal adenocarcinoma and its correlation with angiogenesis MA Yanhui．Department of Gastroenterology ，Liangxiang Teaching Hospital of Capital Medical University ，Beijing 102400，China【Abstract 】Objective To detect the expressions of pituitary tumor-transforming gene （PTTG ）in different largeintestine tissues ，and to analyze its correlation with thrombospondin-1（TSP-1）and p53expression as well as microvesseldensity （MVD ），and to investigate its rile in pathogenesis and development of carcinoma of large intestine．Methods The expression levels of PTTG were detected by immunohistochemical staining in 18cases of normal tissue ，20cases of colon adenoma and 44cases of colon carcinoma．Moreover the vascular endothelium cells were marked by CD34and MVD was counted．Ｒesults There were significant differences in the expression levels of PTTG between control group and colon adenoma group and between control group and colon adenocarcinoma group （P ＜0．01）．The expression of PTTG was closely correlated with lymph node metastasis ，invasive depth ，differentiation degree of tumor．There were significant differences in the expression levels of TSP-1between control group and colon adenoma group and between control group and colonadenocarcinoma group （P ＜0．05），moreover ，which were closely correlated with invasive depth of tumor （P ＜0．05）．P53was not expressed in normal colon tissues ，and the expression levels of p53in colon carcinoma group were significantly higher than those in colon adenoma group （P ＜0．05）．MVD in normal colon tissues ，colon carcinoma group and colon adenocarcinoma group was 67ʃ26，30ʃ7，11ʃ4．There was a postive correlation between expression of PTTG and MVD ，p53and between expression of p53and MVD．There was a significant negative correlation between the expression of PTTG and TSP-1andbetween TSP-1and MVD as well as between P53and TSP-1．Conclusion The overexpression of PTTG in colonadenocarcinoma tissues is involved in the pathogenesis and development of colon adenocarcinom ，and the expression unbalance of PTTG ，p53and TSP in colon adenocarcinoma tissues is the main cause of abnormal vascularization of tumor vessel．【Key words 】pituitary tumor-transforming gene ；p53；thrombospondin ；microvessel density ；colorectal adenocarcinoma ；immunohistochemistry垂体瘤转化基因（PTTG ）是涉及姐妹染色单体分离的原癌基因，是Pie 等［1］首次从大鼠垂体瘤组织中分离鉴定并克隆，随后Zhang 等［2］又从从人体胎儿肝细胞组织cDNA 文库中分离出人垂体瘤转化基因hPTTG ，并证实其至少有3个家族成员：PTTG1、PTTG2、PTTG3。

大肠癌中P53基因突变对化疗前后血清CEA水平变化的影响赵金伟;王秀芹
【期刊名称】《中国实验诊断学》
【年(卷),期】2001(005)004
【摘要】@@ 目前人们发现,p53基因突变在肿瘤的发生发展中占有重要地
位.p53基因参与细胞凋亡,因而p53的失活可能影响肿瘤细胞对化疗的敏感
性.CEA是大肠癌细胞去分化过程中表达的一个重要标志,是最有价值的肿瘤标记物,在大肠癌复发转移患者化疗过程中,动态测定血清CEA水平,可以反映对化疗的敏感性[1].但二者的相关性研究国内报道较少,本文通过对大肠癌中p53基因突变对化疔前后血清CEA水平变化的影响,探讨P53基因突变对化疗疗效的敏感性.
【总页数】1页(P186)
【作者】赵金伟;王秀芹
【作者单位】武警吉林省总队医院外一科,吉林长春,130052;北华大学东校区医院【正文语种】中文
【中图分类】R73
【相关文献】
1.EGFR19/21基因突变与NSCLC组织中p53蛋白表达的关系及对预后的影响[J], 陈焱;宋小平
2.舒林酸在防治小鼠大肠癌中对p53和 p21WAF1影响的初步研究 [J], 阎雪燕;孙保存;赵秀兰;李龙;刘易欣;王邦茂
3.大肠癌中p53基因突变的研究 [J], 吴国俊
4.大肠癌中p53基因突变与HPV研究进展 [J], 张焱桥;陶慧敏
5.p53基因突变和肿瘤标志物对大肠癌患者预后的影响 [J], 李铭;王灏;郁宝铭;郑民华
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·19·维持基因组序列信息的完整性对于生物体的存在至关重要，细胞应对各种类型损伤因子所导致的DNA损伤主要是通过激活复杂而精细的DNA 损伤应答 （DNA damage response，DDR ） 通路［1］。

具有细胞毒性的双链断裂损伤 （double strand breaks，DSBs ） 是最为严重的DNA损伤形式之一，未得到正确处理的DSBs除可增加细胞的致死率外，还会增加· 论著 ·DNA损伤修复通路因子53BP1在骨髓干细胞自我更新和分化发育中的作用尤放，王美莲（中国医科大学基础医学院病原生物学教研室，沈阳 110122） 摘要 目的 探讨DNA 损伤修复通路因子53BP1在骨髓干细胞自我更新及定向分化过程中发挥的作用。

方法 构建53BP1全身敲除C57/6小鼠模型，免疫荧光染色检测53BP1在细胞中的定位，Western blotting 对53BP1蛋白表达水平进行检测及鉴定；流式细胞术进行细胞分选和计数、细胞周期检测、以及细胞表面分子marker 分析，对比WT 组和Mut 组细胞生长速率以及定向分化过程，Co -IP 检测分析表观遗传学磷酸化修饰蛋白，SPSS 22.0对数据进行统计学分析。

结果 体内和体外实验证实伴随KSL 细胞分化发育进行，53BP1表达含量显著增加，53BP1基因敲除可影响KSL 细胞的自我更新和定向分化以及表面分子标记的表达；53BP1基因敲除与否并不显著影响处于细胞周期G 1/G 0的KSL 细胞百分含量；53BP1可影响磷酸化修饰蛋白的表达水平，53BP1基因敲除后磷酸化修饰蛋白p -H4 （k20） 和p -H3 （k79） 表达水平明显增加，但p -ATM 和p -53-Ser -20含量显著减少。

结论 53BP1参与并影响骨髓干细胞的自我更新及定向分化过程，53BP1基因敲除可显著影响磷酸化蛋白p -H4 （k20）、p -H3 （k79）、p -ATM 和p -53-Ser -20的表达水平。

P53基因的功能1 阻滞细胞周期在细胞周期中，P53的调节功能主要体现在G1和G2/M期校正点的监测，与转录激活作用密切相关。

P53下游基因P21编码蛋白是一个依赖Cyclin(细胞周期蛋白)的蛋白激酶抑制剂，一方面P21可与一系列Cyclin-cdk （细胞周期蛋白依赖性激酶）复合物结合，抑制相应的蛋白激酶活性，导致高磷酸化Rb 蛋白（视网膜母细胞瘤蛋白）堆积，后者使E2F转录因子（参与细胞周期调控的细胞因子）不能活化，引起G1期阻滞；另外P53的另外3个下游基因Cyclin B1,CADD45 和14-3-3σ则参与G2/M期阻滞。

2 促进细胞调亡Bcl-2（调控线粒体外膜通透性的基因家族）可阻止凋亡形成因子如细胞色素C等从线粒体释放出来，具有抗凋亡作用，而Bax （促凋亡基因）可与线粒体上的电压依赖性离子通道相互作用，介导细胞色素c的释放，具有凋亡作用，p53可以上调Bax的表达水平，以及下调Bcl-2的表达共同完成促进细胞凋亡作用。

P53还可通过死亡信号受体蛋白途径诱导凋亡，T NF受体（在真核细胞表达具有生物活性的可溶性肿瘤坏死因子）和Fas蛋白（一种细胞膜抗原，主要功能是介导细胞凋亡）。

3 维持基因组稳定DNA受损后，由于错配修复的累积，导致基因组不稳定，遗传信息发生改变。

P53可参与DNA的修复过程，其DNA结合结构域本身具有核酸内切酶的活性，可切除错配核苷酸，结合并调节核苷酸内切修复因子XPB和XPD的活性，影响其DNA重组和修复功能。

4 抑制肿瘤血管生成肿瘤生长到一定程度后，可以通过自分泌途径形成促血管生成因子，刺激营养血管在瘤体实质内增生。

P53蛋白能刺激抑制血管生成基因Smad4等表达，抑制肿瘤血管形成。

在肿瘤进展阶段，P53基因突变导致新生血管生成，有利于肿瘤的快速生长，这常常是肿瘤进入晚期的表现。

p53既可阻滞细胞周期，也可诱导细胞凋亡。

两种作用方式都是为了维护基因组的稳定，但二者的性质截然不同。

血管内皮生长因子和p53基因在非小细胞肺癌组织中的表达及其与肿瘤血管形成的相关性董雷【期刊名称】《吉林医学》【年(卷),期】2022(43)11【摘要】目的:研究血管内皮生长因子(VEGF)和p53基因在非小细胞肺癌组织中的表达,并分析其与肿瘤血管形成的相关性。

方法:选择42例非小细胞肺癌患者为研究对象,取非小细胞肺癌和癌旁肺组织,应用免疫组织化学法测试VEGF和p53表达,进一步分析VEGF和p53表达与非小细胞肺癌临床病理主要参数的关系。

并用抗CD34测定肿瘤血管的密度(MVD),分析VEGF和p53表达与肿瘤血管形成的相关性。

结果:相比癌旁组织标本,肺癌组织标本中VEGF和p53阳性表达率、MVD 计数明显更高,差异有统计学意义(P<0.05)。

非小细胞肺癌组织中VEGF和p53表达、MVD计数与TNM分期、分化程度、肿瘤直径密切相关(P<0.05)。

经Spearman秩相关检验分析发现,非小细胞肺癌组织中VEGF和p53表达与MVD 计数呈正相关性。

结论:在非小细胞肺癌组织中VEGF和p53阳性表达率较高,与肿瘤血管形成密切相关。

【总页数】3页(P2959-2961)【作者】董雷【作者单位】佳木斯市中心医院胸外科【正文语种】中文【中图分类】R73【相关文献】1.乙酰肝素酶、肝细胞生长因子和血管内皮生长因子在非小细胞肺癌组织中的表达及其相关性2.直肠癌组织中神经纤毛蛋白-1及血管内皮生长因子的表达与微血管形成的相关性3.舌癌组织中P53和血管内皮生长因子的表达及其与肿瘤血管形成的关系4.血管内皮生长因子、p53蛋白与微血管密度在非小细胞肺癌中的表达及其相关性5.微血管密度及血管内皮生长因子、p53表达与非小细胞肺癌预后的相关性研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

P53基因概述及应用实例姓名;赵飞1.P53基因概述1.1 P53基因的发现1979年，在大家都在研究SV40病毒的癌蛋白时，好几个科研小组都无意中分别独立发现了P53蛋白。

当时在伦敦癌症研究所(London Research Institute)工作的David Lane和Lionel Crawford发现，用感染了SV40病毒的动物血清与SV40大T抗原发生免疫沉淀反应时能共沉淀下来一个分子量约为53kDa的宿主细胞蛋白。

另外三个科研小组也都在1979年同时发表文章报道了同样的结论，他们分别是法国的Pierre May科研小组、美国纽约的Robert Carroll科研小组和英国的Alan Smith科研小组。

1.2P53基因的命名在这个基因在发现之初，每一个发现它的实验室分别给这种分子量为53 kDa的蛋白质取了各自的名字，并且使用这些名字发表了很多论文，这样就造成极大的混乱。

它的真正命名是在1983年在英国牛津举办的第一届国际P53蛋白研讨会上，来自各国的代表专门就这个蛋白的命名进行了讨论。

经过一番激烈争论之后，大家一致认为，P53这个名字最为合适，自此被保留下来一直沿用至今。

其实P53这个名字根本就不是一个名字，只是因为这个蛋白在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试验中表现出的分子量大约为53 kDa才因此而得名。

后来大家才发现，这个表观分子量其实也只是一个大概的估计，因为该蛋白富含脯氨酸，所以在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试验中的迁移率偏慢，表现出来的分子量要比它实际的分子量大。

该蛋白的实际分子量只有43.7 kDa，而小鼠体内P53蛋白的分子量会更小。

1.3P53 基因的功能P53基因是因编码一种分子质量为53 kDa 的蛋白质而得名，是一种抗癌基因。

其表达产物为基因调节蛋白( P53 蛋白) ，当DNA 受到损伤时表达产物急剧增加，可抑制细胞周期进一步运转。

一旦P53 基因发生突变，P53 蛋白失活，细胞分裂失去节制，发生癌变，人类癌症中约有一半是由于该基因发生突变失活。

血清P53抗体——一种新的肿瘤标志物
邹学森
【期刊名称】《国外医学：肿瘤学分册》
【年(卷),期】1998(025)001
【摘要】Ｐ５３基因突变导致突变型Ｐ５３蛋白过度表达并在细胞内聚积，除参与肿瘤恶性表型形成外，还可引起机体的免疫应答产生Ｐ５３抗估。

对Ｐ５３基因突变、Ｐ５３聚积和抗Ｐ５３体液反应关系的研究结果向我们昭示，血甭Ｐ５３抗体是一种新的肿瘤标志物。

【总页数】3页(P12-14)
【作者】邹学森
【作者单位】江西省肿瘤医院肿瘤研究院
【正文语种】中文
【中图分类】R730.4
【相关文献】
1.一种新的肿瘤标志物-抗存活素抗体 [J], 赵新华;邹亚峰
2.一种检测非小细胞肺癌患者血清中p53自身抗体的新方法 [J], 唐恺;岳文涛;王玥;张丽娜;许绍发
3.一种新的肿瘤标志物-抗存活素抗体 [J], 赵新华;邹亚峰
4.血清p53抗体是消化系肿瘤新的标志物 [J], 王福生;蒋丹斌;王国政;王汉仁;朱建清
5.贝伐珠单抗联合盐酸厄洛替尼对晚期非小细胞肺癌患者血清肿瘤标志物和p53抗体水平的影响 [J], 徐子惠
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