等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点【实验原理】等电聚焦电泳是利用具有pH梯度的两性电解质为载体，分离等电点(pI)不同的蛋白质等两性分子的电泳技术。
在IEF电泳系统中，具有一个从阳极到阴极，pH值逐渐增大的连续而稳定的pH梯度，处于此系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI值与所处位点的pH值的差别带上正电或负电。
当蛋白质分子向相反电极移动的过程中，其逐渐靠近与其DI相同的pH位点，直至到达pH=pI，净电荷为零而停止移动，从而达到聚焦。
因此，将pI不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分会分别聚焦在各自pI相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。
根据电泳装置的不同，IEF可分为管型IEF和平板型IEF，本实验介绍管犁PAGE—IEF．【试剂与器材】1．凝胶贮备液称取丙烯酰胺(Acr)20g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0．8g，蒸馏水溶解后定容至100mL，过滤，将未溶物滤去，盛于棕色瓶中，4℃冰箱保存。
2．1％(V/V)TEMED溶液。
3．5g/L过硫酸铵称取过硫酸铵0．5g，溶于蒸馏水100mL，冰箱存放，每周新配。
4．40％两性电解质载体。
5．0．5mmol/L磷酸溶液量取85％磷酸16mL，加蒸馏水定容至500mL。
6．0．5mmol/L NaOH溶液称取NaOH10g，加蒸馏水溶解并定容至500mL。
7．1g/L考马斯亮蓝固定染色液称取考马斯亮蓝R250 lg，溶于含甲醇200mL、乙酸100mL和蒸馏水700mL的混合液中，过滤后备用。
8．酸性乙醇脱色液乙醇25份，蒸馏水25份，冰醋酸8份，混匀备用。
9．血清样本血清无须稀释，但最好透析去除离子。
10．电泳仪选用电子管或晶体管整流电源，电压0~600V，电流0~300mA。
11．电泳槽圆盘电泳槽及电泳玻管。
12．锥形瓶，250px长针头或腰椎穿刺针头，5mL或10mL注射器。
食品安全检测农药兽药残留土壤成分分析焦炭成分分析【操作步骤】1．凝胶制备取洁净干燥的电泳玻璃管2支，将管底用胶布封闭，垂直放置在电泳管架上。
蛋白质等电点测定及性质实验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。
初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。
二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电外表附近的液体中必有与固体外表电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。
在界面上带电外表和反离子形成了双电层的结构。
在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。
对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。
最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。
根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用〔例如范德华力〕而和外表紧密结合，构成吸附层〔或称紧密层、斯特恩层〕。
其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层〔或称滑移面〕。
由于带电外表的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。
离外表越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。
紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体外表上。
其余反离子则构成扩散层。
滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。
滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。
固体颗粒带电量的大小及测量方式？ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。
ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高说明胶粒带电越多，扩散层越厚。
一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。
对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。
蛋白质等电点的测定蛋白质是生命体内构成最广泛的一类生物大分子，具有各种生物功能。
在生物体内，蛋白质具有正负电荷，并在不同PH值的溶液中表现出不同的电性质。
蛋白质在pH等于其等电点时，蛋白质的电荷处于中性状态，亦是纯蛋白质最稳定的情况，因此准确测定蛋白质等电点对于分离、纯化和鉴定蛋白质具有重要意义。
本文中将介绍三种测定蛋白质等电点的方法。
方法1. 等电点电泳法等电点电泳法是一种电泳分离方法，利用蛋白质在不同pH值下的电荷变化探测其等电点。
该方法的原理为将蛋白质经过电泳分离，直到电泳缓冲液pH等于蛋白质的等电点，此时蛋白质处于中性带中心。
与常规电泳仪不同的是，该仪器在酸性电极和碱性电极之间加入溶液，以确保酸碱缓冲系统能够维持所需的pH值。
等电点电泳法可以快速而准确地测定蛋白质等电点，但需要特殊仪器和耗时较长，且样品纯度较高。
方法2. 等电聚焦法等电聚焦法是一种电泳技术，利用在连续的pH梯度中，使具有等电点的蛋白质依次停止迁移，从而分离蛋白质。
该方法的原理是，利用蛋白质在不同pH值下的等电点特性，将样品置于pH梯度中，通过电压控制，使蛋白质在等电点处停止迁移，从而实现蛋白质分离。
等电聚焦法具有高分辨率和高分离效率，同时还可以同时分离出等电点相似但分子量不同的蛋白质，但样品量较小，需要特殊仪器和大量控制。
方法3. pH梯度管柱法pH梯度管柱法是一种可溶性蛋白质的标准测定方法，也是等电点法中最广泛应用的方法之一。
该方法的基本原理是，在含有不同pH值的缓冲液梯度的柱子上，蛋白质会在不同的pH值时呈现出不同的电荷状态。
在pH值等于其等电点时，蛋白质处于中性状态，停止迁移。
通过检测蛋白质在不同pH值下的吸收值，可以确定样品的等电点。
pH梯度管柱法的优点包括样品量较大，操作简单，数据可靠，但分辨率较低，需要特殊的柱子。
三种测定蛋白质等电点的方法各有侧重，实验操作难度大小也不同，一般来说，选择合适的测定方法应根据样品特点和实验条件。
实验四等电点聚焦测蛋白质等电点宫魁六组200928006841083一、实验原理：等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是这种分子的pI。
聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。
一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。
二、实验仪器和用具：玻璃管（4支）、封口膜、试管架、细长滴管、注射器和长针头、培养皿、刀片、烧杯、微量移液器、圆盘电泳槽及电泳仪三、试剂：0.1M磷酸（500ml）、0.1M氢氧化钠（1000ml）、丙烯酰胺储液、两性载体电解质、TEMED、牛血清蛋白样品（0.5mg/ml）、过硫酸铵（10%）、三氯乙酸（10%）等四、实验步骤：1、先将玻管洗净，用封口膜封的一端垂直放在架上；2、配胶：丙烯酰胺储液0、67ml两性载体电解质0、2mlTEMED 0、004ml牛血清蛋白质样品0、04ml蒸馏水 2.9ml过硫酸铵0.02ml3、用细长滴管加入溶液至10cm高处，胶面上加3—3cm高水层，进行封闭，聚合10—50min，吸出上层水，用滤纸稍微吸取；4、在电泳槽上槽加800ml磷酸，下槽500ml氢氧化钠；5、将管接入电泳槽，要求上端浸入液面，下端不接触下槽底面，注意排除凝胶下表面的气泡；6、接上电源，正极接酸，负极接碱；恒定160v，4h左右，电泳至电流为“0”；7、取胶将聚胶后的含蛋白质样品的凝胶借助注射器针头注水取出；8、量取三条胶的长度；9、pH梯度的测定取KCl溶液分别加入2ml于10只小管中，将欲测pH 梯度的胶条置于玻片上，用刀片切成1cm长的小段，按顺序放入有标号的小管中，盖好盖子，室温下过夜；10、次日用pH计测每只小瓶中浸泡液的pH值。
