石杉碱甲提取工艺研究(1)

浙江大学学报(农业与生命科学版)　28(6):591～595,2002Journal of Zhej i ang Un iversity (A gric 1&L ife Sci 1) 收稿日期:2001205230作者简介:沈生荣(1963—),男,浙江湖州人,博士,教授,主要从事植物有效成分的提取及其生物学活性研究和天然产物的安全性评价Λ文章编号:100829209(2002)0620591205石杉碱甲提取工艺研究沈生荣,于海宁,金超芳,徐月荣(浙江大学茶学系,浙江杭州310029)摘　要:系统研究了石杉碱甲的提取工艺Λ系用有机酸浸提、萃取、反萃取、脱色和重结晶等化学分离技术从千层塔中提取、纯化石杉碱甲Λ结果表明:①pH 对石杉碱甲的存在形态有很大影响;②一定酸度下的液液萃取除杂效果理想;③活性炭的用量及吸附条件对除杂效果影响显著;④低温下氯仿的重结晶可得到纯度大于99%的高纯度石杉碱甲Λ关　键　词:石杉碱甲;提取;纯化;pH ;影响中图分类号:R 282.71 文献标识码:ASH EN Sheng 2rong ,Yu H ai 2ning ,J I N Chao 2fang ,XU Yue 2rong (D ep t .of T ea S ciences ,Z hej iang U niv .,H ang z hou 310029,Ch ina )and pur if ication of Huperz i ne A .Journal of Zhejiang U niversity (A gric 1&L ife Sci 1),2002,28(6):5912595Abstract :T echnique of iso lati on and purificati on of H uperzine A from H uperzia serrata (T hunb )T rev .w as studied in th is paper .To get rid of som e p igm ents and o ther i m purities ,som e of chem ical tech 2niques fo r separati on such as extracti on w ith o rganic acid ,abso rp ti on w ith charco l and re 2crystallizati on w ith ch lo rofo r m w ere emp loyed .T he results suggested that :①pH value seri ously influenced H u 2perzine A in so luti on ;②T here are ideal p rocedures w ith extracti on under the certain environm ent of pH value ;③Charco l p lays an i m po rtant ro le in the p rocess ;④T he m easurem ent of re 2crystallizati on had crucial ro le in p romo ting the purity of H uperzine A .Key words :H uperzine A ;extracti on ;purificati on ;pH ;effect 石杉碱甲(H uperzine A ,简称H up A ),又名福定碱,是从石杉科石杉属蛇足杉(千层塔)中分离得到的一种天然生物碱,属强效的可逆性乙酰胆碱酯酶(A ChE )抑制剂,对早老性痴呆症,单纯记忆障碍以及重症肌无力症治疗有显著疗效,且药效持续时间较长,无严重不良反应[1～6],是目前国内外上述病症最有效的药物,深受关注Λ由于它的治疗指数高,且作用时间长,在国际上已被列为第二代胆碱酯酶的抑制剂之一[7～9]Λ但H up A 在自然界中存在量极低,且含有大量杂质,至今国内外有大量研究人员正在探索寻找理想的分离方法Λ曾有人利用溶剂萃取、硅胶柱层析等方法进行分离,虽然能获得少量产品,但终因费时(一个生产周期超过一个月),得率低(低于百万分之一),难于规模化生产Λ而人工合成品难于获得理想的疗效[10～12]Λ本试验巧妙地利用H up A 在不同pH 值下存在形态的变换特性,系统研究了H up A 高效提取的分离纯化技术,为天然H up A 的批量生产提供了技术支持Λ1　材料与方法1.1　材　料 千层塔购于浙江安吉,经鉴定符合药典规定,用前磨成干粉Λ酒石酸、氯仿、氢氧化钠、浓盐酸、三乙醇胺均为国产分析纯试剂,甲醇为色谱纯ΛH up A 纯品由宁波立华制药公司馈赠Λ1.2　分析方法 采用日本岛津L C 210A 型高效液相色谱仪检测H up A ;日本岛津UV 22110型紫外可见分光光度计进行紫外扫描Λ高效液相色谱分析条件如下[13]: 流动相:甲醇 三蒸水 三乙醇胺= 500 1,等比例洗脱,流量为0.8mL m in ;柱温35℃;色谱柱:OD S 2C 18(150mm ×6mm i .d .);灵敏度:0.01aufs ,紫外检测波长:310nm Λ上述条件下的H up A 分离效果如图1Λ图1　对照品Hup A 的HPLC 色谱图F ig .1　H PL C ch rom atogram of H up A standard samp le2　提取工艺2.1　提取工艺流程 千层塔干粗粉→①氯仿流浸膏总碱→②萃取除杂→③脱色→④重结晶→成品2.2　工艺分析2.2.1　氯仿流浸膏总碱的制备 取千层塔干燥粗粉,用1%酒石酸溶液浸泡24h ,放出浸液,再加原1 3用量的1%酒石酸液浸提12h ,放出溶液并浓缩,离心分离得上清液,用稀氨水调pH 至弱碱性后用氯仿反复萃取,浓缩氯仿萃取液,并用1%N aOH 水溶液反复萃取,至萃取颜色很淡为止,合并萃取液,用浓盐酸调pH 至弱酸性,再用氨水调pH 至碱性,此液用氯仿反复萃取,合并氯仿相,并浓缩至流浸膏总碱,其H PL C 分析结果如下(图2)Λ图2　总碱氯仿溶液的HPLC 色谱图F ig .2　H PL C ch rom atogram of alkaline m ixturein ch lo rofo r m 上述提取过程中,氨水浓度及其调节的pH 值影响着石杉碱甲在溶液中的存在形态,以石杉碱甲形成分子态为佳,过多或过少的氨水调pH 值均不利于氯仿的完全萃取,由于该化合物能溶于弱酸性的水中,通过在不同pH 条件下不同形态间的转换,达到去杂浓缩富集石杉碱甲的目的Λ 由图2可知,在所用色谱分析条件下,总碱中的主成分明显,纯度约为15%Λ该步平均回收率约为92%Λ2.2.2　萃取除杂 总碱氯仿溶液是颜色深暗的粘稠状液体,其中的色素及H PL C 图谱中1号和3号峰是影响其纯度的重要杂质Λ用等体积的碱性蒸馏水萃取,并经适当稀释后的总碱氯仿溶液,水层呈红色透明,经H PL C 分析检验可较多地除去1号杂质峰,但对3号峰影响不大Λ用不同pH 值的氨水溶液萃取总碱的295 浙江大学学报(农业与生命科学版)　第28卷　氯仿溶液,其去杂结果见表1Λ表1　不同pH 值氨水溶液对总碱氯仿溶液去除杂质的影响T able 1　Influence of different pH value in ammonia sp iriton purifying alkaline m ixture in ch lo rofo r m%pH789101号峰去除率35.650.047.037.22号峰H up A 的损失率3.75.54.94.8由表1可知,碱性过高(pH >9)或过低(pH <8)对1号峰的去除率较低,但在试验条件下,2号峰的损失均不大,且萃取2次以上的效果相近,因此以pH 值8～9的氨水溶液萃取氯仿溶液,去杂质率高,且有效成分损失最少Λ上述用碱水洗涤后的氯仿层颜色暗红色,还须进一步纯化Λ由于酸浓度严重影响着石杉碱甲在溶液中的存在形态,一定酸性条件下,可以正离子形态存在,若采用一定浓度的酸水溶液萃取氯仿溶液应可以将非离子杂质除去(氯仿层),而离子态的石杉碱甲等物质则进入极性溶剂层(水层),达到净化去杂的目的Λ 在试验中,以0.0001,0.01,0.1,0.2,0.5,1.0m o l L 浓度不等的盐酸等体积萃取水洗后的氯仿溶液Λ对水层,氯仿层均作H PL C 分析(图3)Λ 试验结果表明,0.001～0.1m o l L HC l 萃取率极低,而0.5m o l L 以上的盐酸萃取后,H PL C 分析谱形扭曲,杂质量增加Λ以上现象的可能原因是酸浓度过低时,H up A 离子化程度低,不溶于酸液;而酸浓度过高时,H up A 等分子可能异构化,致使谱形改变Λ因此,用盐酸去除杂质,浓度以0.2～0.5m o l L 为宜Λ本试验选用0.2m o l L 的盐酸Λ通过3次0.2m o l L 盐酸等体积萃取,萃取可接近完全,萃取后的酸水层,为红色透明溶液;氯仿层为暗红色且不透明,较多的色素以及杂质留在氯仿层中;萃取过程还可除去水不溶性的污垢状物Λ萃取前的氯仿溶液,萃取后的酸水层,氯仿层H PL C 分析图谱如图3(在酸水层中H up A 以正离子形态存在,所以出峰时间有差异)Λa —萃取前的氯仿溶液;b —萃取后的酸水层;c —萃取后的氯仿层图3　酸萃取对纯化的影响F ig .3　Influence of acidic extracti on on purificati on2.2.3　脱　色 脱色除杂是本工艺关键环节之一,经阳离子交换树脂、大孔吸附树脂、Sephadex L H 220柱分离,虽然都能去除一部分杂质,但不是去杂效果不明显,就是费时和得率极低,均无实用价值Λ改用活性炭脱色后效果极为显著Λ为保证脱色的同时能最大量地保留有效成分,试验对溶液pH 值、稀释度、吸附时间及活性炭用量等进行了考察Λ ①吸附时间的确定 试验中,将试液3等分,分别加入等量的活性炭,吸附5m in 、30m in 和3h Λ经H PL C 分析发现,活性炭吸附很快,且随时间延长并不明显增加吸附量,因此吸附时间以5～10m in 为宜Λ ②吸附溶液pH 值的确定395　第6期　沈生荣,等 石杉碱甲提取工艺研究 取等体积酸水溶液3份,分别调至pH 1～2、3～4和5～6,活性炭用量为酸水液体积的10%,吸附后过滤,结果发现滤液颜色随pH 值下降而变浅,表明活性炭吸附效果与酸度有关,以选用pH 1～2为最佳Λ ③稀释度与活性炭用量的确定 根据条件试验,活性炭用量初选为酸水液体积的10%～20%Λ为找到合适的稀释倍数及活性炭用量,不同稀释度下石杉碱甲的得率如图4Λ图4　母液稀释倍数与石杉碱甲得率的关系F ig .4　R elati onsh i p betw een diluti on rate of mo therliquo r and recovery rate of H up A 将酸液稀释5、10、15、20、25和30倍,pH 调至1～2,各等分为两份:第一份,以母液体积10%的活性炭处理,结果滤液均呈浅黄绿色;第二份,以母液体积15%的活性炭处理,结果滤液无色,H PL C 分析活性炭处理后的滤液得率与稀释倍数的关系如图4Λ由图4可见稀释15倍,H up A 得率最高,约为70%Λ 根据上述试验,活性炭脱色优化条件为:酸水萃取液稀释15倍,调pH 1～2,活性炭用量为稀释前体积的15%,脱色时间5～10m in ,可得无色透明液体,H PL C 分析同时发现,1、3号峰大量除去,但纯度仍低于99%Λ2.2.4　重结晶 活性炭脱色后,H PL C 分析表明,溶液中除H up A 外,还存在其它杂质,要得到高纯度的H up A 必须进行重结晶Λ将溶液用浓氨水调至pH 9以上(此时滤液由无色变成黄绿色),用等体积氯仿萃取一次,待H up A 萃取接近完全,而黄绿色留在水层,将氯仿层蒸干,得微红色固体Λ加适量丙酮,加热回流使之完全溶解,静置,冷却至室温后,放入冰箱(约5℃)静置24h ,得锅巴状固体结晶,稍带红色,H PL C 检验纯度为90%Λ重结晶一次得类白色固体,即为产品Λ再用少量氯仿溶解后,丙酮重结晶,可得97%的白色固体Λ三次结晶后,可得纯度大于99%的纯品Λ2.3　产品分析 将结晶所得固体于烘箱中干燥5h 以上,后用H PL C 、UV 、熔点法来鉴定Λ H PL C 分析得产品纯度为96%～105%,熔点试验,229℃,紫外扫描结果与对照品完全吻合(两个吸收峰分别为231nm 和313nm ,见图5)Λ图5　石杉碱甲的紫外扫描光谱F ig .5　UV spectrum of H up A 采用本工艺流程,完成一个周期生产需3～4d (远少于旧工艺30d ),得率为十万分之五左右Λ3　讨　论图6　石杉碱甲的分子结构图F ig .6　Structure of H up A3.1　由石杉碱甲分子结构(图6)可知,分子中含有吡啶酮内酰胺氢和氨基氢,两者对pH 值敏感,稀氨水碱性(pH 9)条件下以形成不带电荷的分子态易被非极性有机溶剂萃取;而在稀盐酸酸性(pH <3)条件下形成带正电分子,易495 浙江大学学报(农业与生命科学版)　第28卷　被极性溶剂萃取Λ在这同时,体系中的其他物质(如杂质)不具备与之完全相同的性质,因此可用变换pH 的办法去除杂质Λ3.2　由于晶体中存在分子间氢键,改变了键的力学性质,使石杉碱甲在一定条件下可轻易获得结晶体,且少有混晶现象,因此,重结晶纯化是切实可行的Λ3.3　由于石杉碱甲在氯仿中易溶,在水中难溶和在酸中能溶的特性,且具有不同酸度下其存在形态不同和晶体中能形成分子间氢健的特点,本工艺恰到好处地应用了这些特性,使石杉碱甲得以顺利提取并纯化ΛReferences :[1]　CHAN G J ian 2jun (常建军).H uperzine A vs pyritino l intreating dem entia fro3333333333:３３５］。