生物技术大实验

生物技术大实验陆挺王大慧汪成富苏州大学生命科学学院二零零七年六月前言脂类被广泛地定义为能溶于有机溶剂的一类生物分子【1】。

甘油脂类是指主链中含有甘油的脂类。

主要的甘油脂类包括三酰基甘油和各种磷脂。

由脂肪酸和甘油组成的三酰基甘油可在动物的脂肪组织，植物种子或果实中大量储藏。

脂肪酸是三酰基甘油的主要成分，其作为能量被储存在三酰基甘油中。

虽然在肝脏和肠内也发现三酰基甘油，但是发现它们主要存在脂肪组织中。

磷酸甘油酯(简称磷脂)，是另一种含有磷酸基的甘油脂类。

这类脂类的共同特点是它们都是具有亲水性和疏水性的兼性分子，水解以后都产生磷酸和脂肪酸。

可见，脂肪酸也是磷脂的主要成分。

在真核和原核细胞的生物膜（包括细胞膜，细胞器膜）中，磷脂是主要的结构脂类。

磷脂双层可构成两相界面，是各种分子的通透性屏障。

磷脂组成的变化对细胞膜的流动性，膜蛋白的活性等细胞生理功能由重要的调节的作用。

【2】溶血磷脂是一类重要的磷脂。

其中，溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid ,LPA）是目前已知的结构最简单的甘油磷脂。

它的系统命名为1或2－脂酰－甘油－3－磷酸（1 or 2-acyl sn-glycerol-3-phosphate）。

溶血磷脂酸在体内的信号转导途径中起着重要的作用，被称为多功能“磷脂信使”。

通过活化特定的G蛋白受体，LPA调控着多种细胞反应，如有丝分裂的发生、细胞粘附、细胞骨架重排、离子转运、细胞分化、平滑肌收缩以及细胞调亡等等【3】。

LPA存在于多种生物体体液中，如血清、血浆、眼球的水状体等。

多种类型的细胞均可产生LPA，并通过自分泌或旁分泌的形式释放到细胞外影响靶细胞的功能。

机体可由如下途径释放LPA：1）血小板在凝血酶刺激激活后可迅速产生和释放LPA；2）哺乳类的成纤维细胞在肽类生长因子刺激下可迅速产生LPA并释放到细胞外间质；3）人的脂肪细胞可产生LPA，并刺激前脂肪细胞的增殖[4]；4）在卵巢癌患者的腹水及血浆中可检测到增高的LPA[5]，其来源尚不清楚，但有可能是肿瘤细胞产生的；5）某些炎症细胞、内皮细胞、神经细胞及受损的细胞也可产生LPA[6]多方面研究表明，LPA的产生同多种病生理状态密切相关。

LPA是促使肿瘤细胞生长和浸润的一个强有力的因子[7，8]，它在包括癌症、肥胖以及动脉硬化等疾病中起着重要的作用，近年来，越来越多的证据显示LPA与人卵巢癌及其他人恶性肿瘤的病理生理学关系密切[9，10]。

当前，LPA已经被用作卵巢癌检测的一个重要的分子指标[10，11]。

虽然LPA被广泛认作是一种类似于生长因子的磷脂分子，但是在早期的研究中，LPA是作为生物膜的一种成分以及脂类生物合成的代谢中间体为人们所认识。

肝脏和脂肪组织是合成三酰基甘油最活跃的组织。

其反应如下：3磷酸甘油↓溶血磷脂酸↓磷脂酸↓甘油二酯↓甘油三酯LPA转化成的PA是所有甘油酯类的前体物质[13]。

作为脂类生物合成的代谢中间体之一，PA同时也参加与磷脂信号转导，在细胞活化和有丝分裂期间表达量能够快速上调[14，15]。

LPA转化成PA的反应是磷脂合成的第二步反应，这步反应有溶血磷脂酸脂酰基转移酶（LPAAT）所催化。

LPAAT被发现存在于微粒体以及质膜上[16]，能被白细胞介素-1引发的磷酸化作用所调控[16，17]。

在内质网上，LPA以非常高的速度被LPAAT转化成PA。

通过经典遗传学方法或者序列同源比较的方法，已经从多种非乳动物和哺乳动物中得到了编码LPAAT的基因。

生物信息学的发展大大促使了在人类中进行LPAAT基因的克隆，迄今为止，已经报导了不少LPAAT基因。

在这当中，有多个研究小组是同时报到了这方面的研究工作[18，19，20，21]。

在本次大实验中，我们的主要工作就是对小鼠的LPAAT基因进行克隆和小鼠LPAAT-EGFPN融合蛋白的表达。

材料与方法1.材料1.1 PCR引物：由上海生工生物工程有限公司合成。

特异性引物： mLPAAT-F 5- ACCATGTTCCTGTTGCTACCTTTTG-3mLPAAT-R 5- GGAGGCTCAGGACCGGCT-3带酶切位点的引物：mLPAAT－EGFPN-XhoⅠ-F 5- GGCCTCGAGATGTTCCTGTTGCTACCTTTTGA -3 mLPAAT－EGFPN-BamHⅠ-R 5- TTTGGATCCAAGGACCGGCTGCGGTCCTCATG -3 表达载体和宿主菌1.2.1 载体pEGFP-N1图1. pEGFP-N1表达载体图谱1.2.2 克隆菌株： DH5α菌株，表达菌株：BL21 菌株1.3 基因克隆相关分子生物学实验材料1.3.1 λDNA Hind III/EcoR I双酶切DNA标准分子量1.3.2 PCR产物纯化试剂盒1.3.3 限制性内切酶1.3.4 DNA连接酶1.3.5 凝胶回收纯化试剂盒1.3.6 质粒抽提试剂盒1.3.7 DNA测序试剂盒：采用BigDye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction1.3.8 克隆用的人脑cDNA文库和人胎脑cDNA文库1.4 实验试剂1.4.1LB培养基多聚蛋白胨10.0 g酵母抽提物 5.0 gNaCl 10.0 gO定容至1000 ml加ddH2灭菌条件为121℃，高压湿热灭菌20 min；1.4.2 蛋白分析1.4.2.1 SDS-PAGE胶配方：12%分离胶 5%浓缩胶HO 3.4 ml 3.675 ml230%Gel 4 ml 0.65 mlTris-HCL 2.5 ml (1.5M,pH8.8) 0.625 ml (1.0M,PH6.8)10%SDS 100μl 50μl10%APS 50μl 25μlTEMED 5μl 5μl＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿10ml 5ml1.4.2.2 5×Tris-Gly电泳缓冲液：15.1g Tris碱，94g Gly，50ml 10% SDS，加水至1L1.4.2.3 2×SDS-PAGE上样缓冲液：2.0ml 0.5M Tris-HCL， 2.0ml甘油，2.0ml 20%（W/V）SDS，0.5ml 0.1%（W/V）溴酚蓝，1.0ml β-巯基乙醇，2.5ml ddHO21.4.2.4 SDS-PAGE染色液：90ml 甲醇：水（1：1，V/V）；10ml冰乙酸；0.25g考马斯亮蓝R250 1.4.2.5 SDS-PAGE脱色液90ml 甲醇：水（1：1，V/V）；10ml冰乙酸1.4.2.6 异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）2 主要仪器设备2.1 PCR扩增仪：PTC-2002.2 Suprafuge 22型高速冷冻离心机2.3 TGL-16台式离心机2.4 ABI377型全自动DNA测序电泳仪2.5 MODEL4001型DNA测序电泳仪2.6 MODEL SA型DNA测序电泳槽2.7 凝胶成像系统2.8 HZ-C型台式恒温振荡器2.9 电脉冲仪2.10 微量加样器：1000 μl/200 μl/20 μl3 国际生物学信息途径：3.1 国际NCBI（Nation Center for Biotechnology Information）非重复数据库(Non-redundant Database)BLASTN: /blastn/nr/BLASTP: /blastp/nr/3.2 核酸及蛋白质序列分析软件：Protscale ( /cgi-bin/protscale.pl/ )CLUSTALW ( /clustalw/ )3.3蛋白质分析软件包Vector NTI4实验方法技术路线和实验方案设计引物↓扩增mLPAAT特异的片段↓构建原核表达载体↓载体转化感受态细菌↓抽质粒鉴定↓质粒转化BL21↓融合蛋白的诱导表达↓融合蛋白的纯化↓蛋白质的检测分析4.2 PCR体系：25 μM 引物mLPAAT up 0.5 μl25 μM 引物mLPAAT down 0.5 μl10×Taq buffer 2.5 μl1.0 μl25 mM MgCl220 mM dNTP 0.5 μl模板质粒DNA 0.5 μlTaq DNA聚合酶0.5 μlddHO补充至总体积25 μl2PCR条件：95℃ 5 min 1 cycle95℃60℃30cycle72℃72℃10 min 1 cycle4.2.1 PCR产物回收采用凝胶回收纯化试剂盒4.2.2 载体的构建4.2.2.1 运用相应限制性内切酶双酶切载体pEGFP-N1，纯化并定量。

反应体系：pEGFP-N1 6 μl10× buffer 2 μlBamH I 1 μlXho I 1 μlddHO补充至20 μl2反应条件：37 ℃ 4 h4.2.2.2 mLPAAT片段的酶切运用相应限制性内切酶双酶切PCR产物，纯化并定量。

反应体系：PCR产物12 μl10× buffer 4 μlBamH I 2 μlXho I 2 μlO补充至40 μlddH2反应条件：37 ℃ 4 h4.2.3酶切产物与pEGFP-N1载体标准连接体系（standard reaction）及条件：连接体系：酶切MLPAAT片段PCR产物5μl酶切pEGFP-N1载体 1.5 μl连接酶buffer 1.0 μl10×T4连接酶（5 Unit/μl） 1.0 μlT4O补充至15.0 μlddH2连接条件：4℃连接过夜4.2.4 以连接产物转化DH5α感受态菌株4.2.4.1 DH5α感受态菌株的制备a. 从于 37℃培养16-20小时的新鲜平板上挑取一个单克隆DH5α菌落（直径2-3mm ），转到一个含有5ml试管中。

于37℃剧烈振摇培养过夜（旋转摇床，250转/min ）。

b. 从过夜的LB中吸取1 ml加入到100 ml LB的烧瓶中。

于37℃剧烈振摇培养2-2.5小时（旋转摇床，300转/min）。

c. 培养物冰上放置10 min，转移到50ml 无菌离心管中，4100 rpm 4℃10 min。

d. 倒出培养液，将管倒置1 min 以使最后残留的痕量培养液流尽。

重悬每份沉淀，放置于冰上10 min。

e. 以 10 ml用冰预冷的0.1 mol/ L CaCl2f. 于4℃以 5000 rpm 离心 10 min，以回收细胞。

g. 倒出培养液，将管倒置1 min 以使最后残留的痕量培养液流尽。

（含有10%h. 每50 ml初始培养物用 2 ml 用冰预冷的0.1 mol/ L CaCl2甘油）重悬每份细胞沉淀。

i. 用冷却的无菌吸头从DH5α感受态细胞悬液中各取100μl转移到无菌的微量离心管中。