分子机制研究套路（四）
选择性剪切
课题：激酶A通过RNA结合蛋白B影响C的选择性剪切
1．概念介绍：
真核生物结构基因的DNA序列由编码序列和非编码序列两部分组成，编码序列是不连续的，被非编码序列分割开来，成为断裂基因(Split gene)。
在结构基因中，编码序列称为外显子(Exon)，是表达多肤链序列，非编码序列称为内含子(Intron)，是不表达多肤链序列，又称插入序列。
真核生物DNA转录为前mKNA(Pre-mRNA)后经过mRNA的剪切，切去内含子，将有编码意义的外显子连接起来，转变为成熟mRNA。
真核基因转录产生的mRNA前体，在细胞分化、发育阶段和生理状态下，可按不同的方式剪切产生出两种或者更多种mRNA，进而翻译出两种或多种蛋白质，此过程为选择性剪切或称可变剪切(Altemative Splicing)。
选择性剪接的形式多样,最常见的主要是以下几种：1)外显子跳过，从而导致外显子保留或者不保留在成熟的mRNA中；2)外显子具有多个5’或者3’剪接位点，以此可能产生多种选择性剪切异构体；3)单个或者多个选择性剪接外显子可以位于组成型外显子(constitutive exon)中,以便选择性外显子可以有选择的保留或者不保留于成熟的mRNA中；4)内含子不剪切，内含子可以选择性保留在成熟mRNA中以便被翻译出来。
mRNA这种选择性剪切是少量基因产生大量mRNA和蛋白质的重要机制，也使得机体仅少量基因就能对千变万化的复杂的生物性状进行调控成为可能。
mRNA这种选择性剪切对扩充生物细胞遗传信息和增强生物细胞功能有着重要作用，并且大量研究证实，选择性剪切对基因表达的调节作用，在干细胞分化过程以及肿瘤的发生、发展过程中均发挥重要作用。
2．示意图：
图1：选择性剪切示意图
Pre-mRNA Altemative Splicing mRNA isoforms
图2：选择性剪切四种模式
3．研究思路：
假设激酶A在很多肿瘤中高表达或异常激活，C具有2种剪切体C-1和C-2，且二者在肿瘤中发挥截然相反的作用，C-1促癌，C-2抑癌。
肿瘤中C-1高表达，C-2低表达。
3.1 激酶A参与调控C选择性剪切方式 (3)
3.2激酶A可调控下游RNA结合蛋白B (4)
3.2.1激酶A的活性与RNA结合蛋白B表达水平相关 (4)
3.2.2免疫共沉淀检测激酶A与RNA结合蛋白B是否结合 (4)
3.2.3KD-激酶A使RNA结合蛋白B表达下调 (4)
3.3RNA结合蛋白B参与C选择性剪切的实验研究 (4)
3.3.1 RNA结合蛋白B可与C结合 (4)
3.3.2 KD-激酶A对RNA结合蛋白B与C结合能力的影响 (4)
3.3.3RNA结合蛋白B对C选择性剪切的影响 (5)
3.1 激酶A参与调控C选择性剪切方式
为研究激酶A是否影响C的选择性剪切方式，我们引入了KD-激酶A(Kinase-Dead，激酶活性缺失)腺病毒载体系统，抑制野生型激酶A的活性。
KD-激酶A腺病毒具有以下几个特点：具有野生型激酶A的结构，却没有野生型激酶A的活性，因此可以竞争性抑制细胞中正常激酶A的功能。
该重组腺病毒中携带GFP(green fluorescent protein，绿色荧光蛋白)，可对病毒转染过程进行追踪，并对感染的效率进行观察。
通过RT-PCR的方式证实激酶A激酶活性在基因C选择性剪切中的作用。
运用设计在C基因两种剪切体C-1/C-2选择性剪切位点前后的引物，RT-PCR对cell-1细胞中C的不同剪切体进行检测.
结果显示：抑制激酶A活性可诱导Cell-1细胞C基因选择性剪切方式改变。
在转染KD-激酶A以后，C两种剪切体中抑癌的C-2明显增加，而促癌的C-1明显降低，C-2/C-1比例明显升高，提示抑制激酶A活性可影响C选择性剪切方式，从而改变两种剪切体的比例，促进癌症的发生。
注释：如果有激酶A特异性的小分子抑制剂，可以引入该部分实验中。
对于暂无抑制剂的激酶活性研究，KD-激酶的引入是一个重要的手段。
3.2激酶A可调控下游RNA结合蛋白B
目前研究认为激酶A并不能直接参与RNA剪切的调控，根据对激酶A激酶结构的分析，我们推测某些下游的RNA结合蛋白可能与激酶A结合，受到激酶A的调控，在转录后水平发挥选择性剪切的作用。
3.2.1激酶A的活性与RNA结合蛋白B表达水平相关
为了明确激酶A与哪些RNA结合蛋白相互作用并参与C基因的选择性剪切，通过聚丙酰胺二维凝胶电泳这一蛋白质组学的检测方法，寻找与激酶A活性相关的下游靶蛋白。
经过质谱分析，与对照组相比，转染KD-激酶A以后Cell-1细胞中出现＿个差异点蛋白，其中RNA结合蛋白B的表达水平明显下调。
该结果提示：激酶A的活性与RNA结合蛋白B表达水平密切相关。
3.2.2免疫共沉淀检测激酶A与RNA结合蛋白B是否结合
免疫共沉淀结果表明，激酶A能够与RNA结合蛋白B结合，而阴性对照(IgG)则无法捕获相应的蛋白，说明激酶A可能通过结合其下游的RNA结合蛋白B对靶基因起调控作用。
3.2.3KD-激酶A使RNA结合蛋白B表达下调
通过Western Blot对转染KD-激酶A前后的Cell-1细胞中RNA结合蛋白B表达水平进行了检测，结果显示抑制激酶A活性以后，RNA结合蛋白B表达明显下降，该结果进一步证实激酶A与RNA结合蛋白B表达水平之间有密切联系，与2D-PAGE结论一致。
3.3RNA结合蛋白B参与C选择性剪切的实验研究
3.3.1 RNA结合蛋白B可与C结合
RNA-免疫共沉淀(RNA-IP)检测结果表明RNA结合蛋白B可以与C结合。
3.3.2 KD-激酶A对RNA结合蛋白B与C结合能力的影响
Cell-1细胞转染KD-激酶A以后，RNA结合蛋白B与C的结合水平降低，说明抑制激酶A
的活性，可能通过影响RNA结合蛋白B的结合水平从而参与C的选择性剪切。
3.3.3RNA结合蛋白B对C选择性剪切的影响
用Ad-RNA结合蛋白B和Ad-RNA结合蛋白B RNAi的重组腺病毒载体感染Cell-1细胞，24小时后荧光显微镜下观察，感染效率达到几乎100%，Western Blot证实转染有效。
与未转染和转染空载体组相比，转染KD-激酶A组和转染Ad-RNA结合蛋白B RNAi组的Cell-1细胞中C-2/C-1比例明显增加；转染Ad-RNA结合蛋白B组的Cell-1细胞中C-2/C-1比例明显下降。
而当KD-激酶A与RNA结合蛋白B过表达腺病毒共转染Cell-1细胞后，C-2/C-1比例仍高于正常对照组，但不及KD-激酶A组，该结果说明，受到激酶A活性调控而导致的RNA结合蛋白B表达水平改变可以影响C基因选择性剪切的方式，在Cell-1细胞中，RNA结合蛋白B的过表达在抑制C-2的同时，增加了C-1的表达，而且它的过表达可以拯救由转染KD-激酶A引起的C-2/C-1比例升高。
4．应用案例：
1.Chen ZY, Cai L, Zhu J, Chen M, Chen J, Li ZH, Liu XD, Wang SG, Bie P, Jiang P et al: Fyn requires
HnRNPA2B1 and Sam68 to synergistically regulate apoptosis in pancreatic cancer.
Carcinogenesis 2011, 32(10):1419-1426.。
