猪血中SOD的制备

一、原理1.超氧化物歧化酶（SOD）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一种能专一地清除超氧离子自由基O-2（）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、抗炎及抗癌等作用因而在医药、化妆品及食品工业等方面有了广泛的应用前景。

SOD是一种酸性蛋白，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。

按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD（二聚体，蓝绿色）、Mn-SOD（紫红色）和Fe-SOD（黄褐色）三种。

H+O-2 H2O2O2O-2SOD催化下述反应：2+2→+。

机体内的过量和不足均对机体不利，O-2O-2O-2SOD对过量的的及时清除保证了机体内的含量相对的平衡。

机体内的形成可分为O-2生理性和病理性两方面。

在一些正常生理过程中会形成一些。

例如：呼吸链中电子传递O-2O-2结果可产生一些。

在某些疾病（如氩中毒、辐射病等）过程中会产生大量的。

过量O-2O-2 H2O2O2的如不及时清除，会对细胞损伤。

SOD将歧化为和，而过氧化氢（物）酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化或氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。

2.有机溶剂沉淀法分离纯化蛋白质本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行分离纯化。

有机溶剂沉淀法的基本原理：①亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀；②水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。

常见的有机溶剂有丙酮和乙醇等。

3.邻苯三酚自氧化法测定酶活力酶活性测定的方法有以下几种方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法及亚硝酸法等。

本实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为1个酶单位。

邻苯三酚自氧化法的原理：利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自O-2氧化，产生，生成有颜色的中间产物。

实验8 猪血SOD的提取1969年，Maccord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物歧化酶。

超氧化物歧化酶，简称SOD（ superoxide dismutase），是一种广泛存在于动、植特及微生物中的金属酶。

自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大的差异。

迄今为止人们已从各种生物体内分离得到SOD。

为拓宽SOD的原料，筛选或基因过程开发SOD量较高的菌株。

目前研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯SOD.一、实验目的1．学习从血液中提取SOD，并了解天然酶提取的一般过程。

2．学习使用酸度计。

二、实验内容1．原材料的预处理；2．粗酶液的制备；3.离子交换色谱精制；4．紫外分光光度计检测蛋白质含量；5．酶活力的检测。

三、实验原理酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子——生物催化剂，其中绝大多数是蛋白质，可在一定浓度的酸、碱、盐溶液中溶解，又可在一定浓度的有机溶剂中沉淀。

国内多采用Maccord和Fridovich法制备SOD，其主要工业过程为：第一步，乙醇－氯仿除去血红蛋白；第二步，有机溶剂和硫酸铵分级沉淀；第三步，离子交换色谱精制。

四、实验材料1．实验仪器离心机，单盘天平(DT-100)，搅拌器(电动)，电冰箱(BCD-228B)，7530G 型紫外可见分光光度计(上海分析仪器厂)，pHS-2型酸度计。

2．实验试剂5％的柠檬酸三钠，生理盐水，95％乙醇，2.5mmol／LpH值为7．6的磷酸钾缓冲液，丙酮，氯仿，聚丙烯酸，P2O5五、实验过程1．分离红细胞取新鲜猪血，然后迅速将7份血(每份20m1)加1份5％的柠檬酸三钠搅匀，并放人离心沉淀器中，以3000r／min离心处理15min，吸除上清液(血浆)，收集下层红细胞沉淀。

2．除血红蛋白把收集的红细胞加2倍0.9％的氯化钠溶液，以3000r／min离心处理7min，重复3次，得洗涤红细胞(洗涤后的红细胞在一15℃条件下可保存60天)，然后在洗净的红细胞中加入等体积的蒸馏水，在0～4℃条件下，搅拌溶血30min，在0～4℃下放置10h以上，使红细胞充分破裂。

从动物血液提取SOD的工艺流程及技术ＳＯＤ(过氧化物岐化酶，Superoxide dismutase)存在于动物、植物及微生物中的金属酶，主要分为以下几种类型(如表)。

表　ＳＯＤ的分类及存在类　ＳＯＤ用于延缓人体衰老，防止色素沉着，并治疗慢性多发性关节炎等症，也被广泛地应用于生产日用化工品，如ＳＯＤ化妆护肤品，对抗衰老、去除脸面雀斑等有明显的效果。

随着日用化工产品的发展及ＳＯＤ在临床上的应用，ＳＯＤ的需求量越来越大。

我国动物血源丰富，牛血、猪血的价格较低，生产ＳＯＤ工艺简单。

所以，用牛血、猪血来提取ＳＯＤ具有较大的发展前途。

现介绍用牛血、猪血来提取ＳＯＤ的方法。

1、工艺流程2、技术操作要点（1）分离：新鲜动物血(牛血或猪血)收集后，用纱布滤出血液，以除去血液中的杂毛及其它异物，然后加入柠檬酸钠(一般10ｋｇ血液中加380ｍｇ柠檬酸钠)，充分搅拌均匀后以3000转/分的速度(以下如同)离心15～20分钟，收集血球，血浆可用于凝血酶的提取。

（2）去除血红蛋白：用0.9%氯化钠溶液离心洗涤已收集的血球三次，每次氯化钠溶液用量为血球体积的2倍为宜。

往已离心洗涤的血球中加入等体积的去离子水(或蒸馏水)，在温度2℃左右的条件下剧烈搅拌30～40分钟，并在同温下放置24小时左右。

因为牛血ＳＯＤ对热较稳定，但猪血ＳＯＤ对热敏感，所以在分离或提取整个过程中温度控制在0～4℃，时间不要超过3天。

若因其它原因，不能及时处理时，可以冷冻保存溶血溶液，并不影响其ＳＯＤ的活力。

（3）萃取：往溶血溶液中分别缓慢加入溶血的血球0.25～0.3倍体积的95%冷乙醇和0.15～0.2倍体积的冷氯仿，充分搅拌30分钟，静置30分钟，然后进行离心分离，收集上清液。

此时应注意有机溶剂的适当比例，才能有效地分离去除蛋白质等杂质，同时必须控制温度在2℃左右(不要超过5℃)，才能达到最佳分离效果。

（4）沉淀：向上述上清液中加入1～2倍体积的冷丙酮，充分搅拌均匀，此时可产生大量白色沉淀，静置30分钟，然后进行离心分离，收集沉淀物。

实验三猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定生物化学与分子生物学刘志坚S2*******一、超氧化物歧化酶（SOD）概述SOD是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅基，因此它对热、PH以及某些理化性质表现出异常的稳定性。

SOD根据所含金属辅基不同可分为三种：第一种是铜（Cu）锌（Zn）金属辅基称（Cu/Zn-SOD）最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于肌体细胞浆中。

它为同源二聚体酶，其中一个亚基结合一个Cu原子，另一个亚基结合一个Zn原子，两个亚基间的相互作用提高了酶的催化活性和稳定性，金属原子的氧化还原完成了酶的催化功能。

第二种是含锰（Mn）金属辅基的称（Mn—SOD），呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内。

Mn—SOD是由203个氨基酸残基构成的四聚体，Mn3+处于三角双锥配位环境中，其中一轴向配位为水分子，另一轴向被蛋白质辅基的配位His-28占据，另3个配位His-83、His-170和Asp-166位于赤道平面。

第三种是含铁（Fe）金属辅基的称（Fe—SOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。

其活性中心是3个His，1个Asp和1个H2O扭曲四面体配位而成。

其中，Mn—SOD 、Fe—SOD的结构特征是不含半胱氨酸，含有较多的色氨酸和酪氨酸，因此紫外吸收光谱类似一般蛋白质，在280nm附近有最大吸收峰，Mn—SOD的可见光谱在475nm处附近有最大吸收，Fe—SOD在350nm处有最大吸收，这都反映了所含金属离子的光学性质。

SOD为自由基清除剂，它广泛存在于生物体的各种组织中，能清除O2-（超氧阴离子）自由基，而超氧阴离子自由基具有细胞毒性，可使脂质过氧化，损伤细胞膜，引起炎症，肿瘤和自身免疫性疾病，并可能促使机体衰老。

它的功能为：（1）抑制心脑血管疾病：机体的衰老与体内氧自由基的产生与积累密切相关，SOD课清除人体内过多的有害的氧自由基，是对健康的有益的功效成分。

前段工作总结前段工艺流程：猪血球液超滤浓缩脱盐主要工艺参数与关键点：1.理论上血球液与纯水的比例为1:1，当前考虑到反应罐的现实情况参数设置为猪血球液1800Kg、纯水1600L2.溶血时间为1小时，一般选择在血水比为1：1时开始溶血计时。

开始打血前打开上搅拌、当料液浸没下电机时打开下搅拌。

（打料时切记将出料管用罐盖压紧防止跳出导致浪费）3.溶血结束后开始用小烧杯取样检测样品的PH，并且留样检测溶血酶活。

4.添加保护性试剂，等几分钟后取样检测PH，根据PH值决定应该添加多少酸液，使其最后能将PH控制在6.0～6.2之间（冬）、其他季节一般为6.2±0.1。

5.打开蒸汽给料液加热进行第一次热变性反应，最终使之温度到达60℃。

秋冬季节由于气温比较低因此在溶血的过程中即对料液进行缓慢的升温。

6.温度到达之后立即关闭蒸汽，并通知锅炉房停止蒸汽供应，开始进入保温阶段，保温时间为50分钟。

7.当保温阶段完成后开始对料液进行降温，使其温度降至50℃以下方可进行压滤，板框压滤机的额定最高压滤温度为50℃。

8.将洗干净的滤布装在压滤机上（在放板框时要保证其切面的平整），压紧压滤机（在压紧的过程中一定要远离压滤机防止出现事故导致人员伤亡）。

9.开压。

压滤的过程中要专人负责看守机器，保证其压力不超过0.15MPa（取样检测第一次热变后的酶活）。

10.将第一次的压滤液又用泵打入反应罐中，打开搅拌、蒸汽，对其升温。

当压滤液打完之后将保护性试剂一并打入，过3分钟左右当其搅拌均匀后取样其PH。

11.根据所测的PH值决定添加多少碱液，最后保证其PH值在5.3～5.5之间，保证最后的滤液为蓝色或蓝绿色。

12.当温度达到70℃时，开始保温，保温时间为20分钟。

之后开始降温，当温度降至60℃时把硅藻土打入料液之中（硅藻土的添加量为5～7Kg）。

13.第二次当料液的温度降至44℃以下开始压滤，本次用细布压滤。

14.取样检测第二次压滤液的酶活，在压滤过程中不但要留意表压不能超过0.15MPa，而且还要关注流出的液体是否澄清，如果出现浑浊应立即关闭阀门，防止污染压滤液。

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD）的测定方法2009年12月08日 16:17法适用于以各类鲜活的动植物组织器官及初加工品（如生鱼片、动物血等初加工肉制品）、乳制品、各类水果蔬菜、果汁等食品中超氧化物歧化酶活性的测定。

超氧化物歧化酶是催化以下反应的金属酶，测酶活方法很多，本文介绍氮蓝四唑法与连苯三酚自氧化法。

（一）氮蓝四唑法1. 方法提要在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。

在氧气中，还原的核黄素与氧化反应产生，将无色（或微黄）的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性僭，SOD通过催化歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色形成。

按抑制蓝色特形成的50%为一酶活单位。

酶活力越高，抑制50%蓝色形成所需酶量越少。

2. 仪器荧光灯管。

离心机。

分光光度计。

pH计。

3. 试剂（1）磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），甲硫氨酸（Met），氮蓝四唑（NBT），核黄素，乙二胺四乙酸（EDTA），以上试剂均为分析纯级；所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。

（2）pH7.8, 5.0×10-2mol/L的K2HPO4- KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存）。

4. 测定步骤（1）酶液的制备：称取5~10g样品，加预先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液，缓冲液的量为所用样品的10倍以上，在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min，取上清液用于酶活测定。

（2）酶反应酬体系液的制备：取上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液30ml，依次溶入Met，NBT，核黄素与EDTA，使它们的浓度分别为 1.3×10-2mol/L, 6.3×10-5mol/L, 1.3×10-6mol/L与1×10-4mol/L，放冰箱中避光保存。

（3）测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液3mL，移入试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。

动物血中超氧化物歧化酶的提取与纯化一、超氧化物歧化酶的提取［原理］1969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。

自然界中SOD 分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。

迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。

藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到吧OD。

为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。

目前，研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯SOD。

从动物血液材料中制备CuZn-SOD纯化工艺分为三个主要步骤：（1）原材料的预处理；（2）粗酶液的制备；（3）离子交换柱层析精制。

国内多采用Mccord和Fridovich法，其主要工艺过程为：第一步，乙醇-氯仿除去血红蛋白；第二步，有机溶剂和硫酸铵分级沉淀；第三步，离子交换柱层析精制。

［试剂和器材］1、试剂3.8%（质量分数）柠檬酸三钠；0.9%（质量分数）氯化钠；95%（体积分数）乙醇；氯仿；丙酮；pH7.6、2.5mmo1/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液；DEAE-SephadexA-502、器材猪血；恒温水浴；离心机；布氏漏斗；抽滤瓶；烧杯、量筒、搅棒等；透析袋［方法和步骤］1、从猪血中提取SOD（1）分离血球取新鲜猪血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4000r/min离心20min，收集红血球。

（2）除血红蛋白红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4000r/min离心20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入1〜1.1倍体积去离子水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后4000r/min 离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。

猪血中超氧化物歧化酶S O D分离纯化及活力测定TTA standardization office【TTA 5AB- TTAK 08- TTA 2C】实验二猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定一、原理超氧化物岐化酶SOD广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。

它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。

SOD是一种酸性蛋白，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。

根据金属辅基的不同，它可以分为四类，分别为Mn-SOD、Cu-Zn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD，其中最常见CuZn-SOD，主要存在于真核细胞的细胞质中。

CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为×104，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体，每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。

SOD作为机体内最重要的抗氧化酶体之一，可以直接清除过量的超氧自由基，阻止机体的过氧化，对机体有较高的防护作用及保健价值。

本实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定。

酶活性单位定义为:在1ml的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个活力单位。

二、试剂与器材1、试剂：ACD抗凝剂、%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯亮蓝G-250、50mmol/L 磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐溶液、3mmol/L 邻苯三酚溶液等。

2、器材：752分光光度计、分析天平、具塞试管、刻度吸管、离心机、烧杯、电泳装置、微量进样器、注射器等。

三、操作步骤提取取新鲜猪血20ml，加入到檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为：1，轻轻搅拌均匀，4000r/min离心10min，收集红血球。

然后用2倍体积生理盐水洗涤，4000r/min离心10min，弃上清液；重复2次，得洗净的血红球浓稠液。

然后向洗净的红血球加入等倍体积去蒸馏水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入倍体积的预冷95%乙醇和倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，4000r/min离心10min，除去变性蛋白沉淀，取清液。