动物细胞融合
**班姓名：*** 实验时间：2013.09.16 同组者：***
一、实验目的
1、了解动物细胞融合的常用方法
2、学习化学融合和电融合的基本操作过程
3、观察动物细胞融和过程中细胞的行为和变化
二、实验原理
细胞融合是指在自发或诱导的条件下两个或两个以上细胞合并为双核或多核细胞的过程。融合得到的细胞可以是同核体（成活率高），也可以是异核体（成活率低）。融合方法有以下几种：
1、病毒诱导融合（1958）
原理：改变细胞膜的结构。
2、化学诱导融合（1975）以聚乙二醇（PEG)为例。
原理：结构相对稳定；相似相溶，亲脂剂扰乱破坏酯双分子层的分子结构；与氢键结合导致细胞脱水。
分子量越大，融合率越高，PEG分子量一般400~6000，科研中多使用800~1000，本实验使用4000。PEG浓度一般40%~60%。作用时间1~5min。控制PH值8.0~8.2。温度38~40℃。
3、电激诱导融合（1978）
原理：电诱导是先使细胞在电场中极化为偶极子（细胞通常带负电），沿电场线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜由于张力作用，两细胞融合。
优点：易控制；高效；无毒。
二、细胞融合的应用
1、动物细胞融合：杂合抗生素生产；动物疾病防治；生产单克隆抗体（骨髓瘤与淋巴细胞杂交瘤，发现致病细胞，制作靶向药物，作为免疫试剂）；改良创造新菌种；基因定位和绘制人类基因图谱（杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与否细胞的某一性状表达与否相联系，从而可以实现把基因定位于某一染色体或某一区段上）；生产树突状细胞抗肿瘤疫苗；用于动物育种；用于细胞疗法（将患者的任何体细胞与去核卵细胞融合，融合子进行有丝分裂形成囊胚，囊胚的内细胞团是多能干细胞，对多能干细胞进行诱导使其定向分化可形成所需的组织和器官用于器官移植，不仅解决了器官和组织来源问题，并且也避免了宿主对外来物的免疫排斥。）
2、植物细胞融合：植物病害防治；新品种开发。
三、实验用品
1、材料
鸡血红细胞
2、试剂
50%PEG、Hank’s溶液（pH7.4）、Alsever’s细胞保存液（氯化钠、柠檬酸钠、葡萄糖，抗凝血）、0.6mol/L 甘露醇溶液、0.85%氯化钠溶液
3、器材
倒置显微镜、离心机、恒温水浴锅、电融合仪、血细胞计数器、量筒、注射器、烧杯、载玻片、盖玻片、200μL及1mL微量移液器、枪头、离心管、废液缸等。
四、实验步骤
1、取鸡血1ml+4ml 0.85%的NaCl溶液，在1200r/min的离心机内离心5分钟。
2、将上一步的沉降血球（去上清液后，约0.1-0.2ml），加入GKN 液至1-2ml，使之成10%的细胞悬液。
3、取上述10%的血球悬液1ml，加入3ml GKN液，使每毫升含血球1500万个。
4. 分别取上述1ml+0.5ml 50%的PEG液、0.5ml+0.5ml 50%的PEG液、0.5ml+1ml 50%的PEG液混匀滴定，待液体分层后停留1-2min，再摇匀，停留1-2分钟，即可镜下观察。
五、实验结果
显微镜下（10*40）
（刚刚相接触的两个细胞）
（形成纺锤状的两细胞）
（细胞融为一体）
七、讨论与结论
1、制备的鸡血红细胞悬液的浓度不宜过高，否则细胞容易聚集，融合效果受影响。
2、PEG的分子量应为400-6000之间，PEG溶液浓度为40%-60% 融合时间1-5分钟。若超过以上三个条件，可能超过了细胞膜的自我修复限度，导致细胞膜破损，无法修复；若低于以上三个条件，可能细胞的破损程度较低，不能进行融合。
3、温度为：38-40℃。适当地提高温度可以使细胞融合得更充分但温度不能过高，以免细胞蛋白质变性。
4、加入PEG形成液面后，应该先反应（1min）后混合，否则会导致细胞融合不充分，可用注射器向内注射气泡的方式混匀。
细胞培养实验和Western Blot实验报告 姓名：张人龙学号：YX16100508115 专业：中医骨伤科学 实验一：细胞培养 1.实验目的 初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物工程在医学上的应用打下基础。 2.实验原理 从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。近年来，在体细胞遗传、分化、胚胎发生、肿瘤发生、免疫学、细胞工程、放射生物学以及老年学等一系列的研究领域中得到广泛的应用，并取得了丰硕的成果。细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。 细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。 3.实验用品 3.1 材料和标本乳兔、HeLa细胞(人宫颈癌细胞) 3.2 器材和仪器手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。 2.3 试剂含有5％小牛血清的MEM培养液、0.01mol／L PBS，0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液、75％乙醇。 4.实验方法 4.1 原代细胞培养 4.1.1 原理 细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
苏州大学实验报告 院、系医学部年级专业姓名学号 课程名称医学免疫学实验成绩 指导老师葛彦同组实验者实验日期 2020/6/3
六、思考题 1.阐述脾脏细胞和骨髓瘤细胞融合后的五种状态，以及在HAT选择性培养基里生存与否的原理。 1)五种状态：未融合的B细胞；未融合的骨髓瘤细胞；B细胞融合B细胞；骨髓瘤细胞融合骨 髓瘤细胞；B细胞融合骨髓瘤细胞。 2)生存与否的原因 B细胞无法在体外长期大量生存，故未融合的B细胞和B细胞相互融合都无法在HAT选择性 培养基生存； 骨髓瘤细胞和骨髓瘤同核融合细胞在HAT培养液中时，DNA合成的主要途径被A阻断，由于缺乏HGPRT或/及TK，不能利用培养基中的H及T，无法完成DNA的合成； B细胞和骨髓瘤细胞的异核融合体即杂交瘤细胞，既从B细胞获得了HGPRT和TK，从而利用培养液中的H和T合成DNA，又从骨髓瘤细胞获得了无限增殖的能力，因此，只有杂交瘤细胞能在HAT选择培养液中生存下来。 2.现需要利用杂交瘤技术制备鼠抗人CD3单克隆抗体，请设计一个实验计划，阐述各阶段的实验 方案和过程，以及所需的实验材料 1)实验材料 人CD3抗原、小鼠、小鼠骨髓瘤细胞、细胞融合剂、PBS、HAT培养液、120目钢丝筛网、 玻璃平板、96孔细胞培养板、温控离心机。 2)实验方案和过程 a)将人CD3抗原注入小鼠体内，进行几周加强免疫； b)取小鼠脾脏 处死小鼠，固定于解剖架上打开腹腔，取出脾脏。置于120目的钢丝网中，将网移入 盛有生理盐水的平皿中，轻轻压磨，使其成为单个细胞悬液，吸取细胞悬液，与骨髓 瘤细胞SP2/0按比例混合，离心后弃上清； c)用HAT培养基培养纯化，得到杂交瘤细胞，使其产生抗人CD3单克隆抗体。
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目动物细胞融合 【实验题目】 动物细胞融合 【实验目的】 1.了解动物细胞融合的常用方法。 2.学习化学融合的基本操作过程。 3.观察动物细胞融合过程中细胞的行为与变化。 【实验材料与用品】 1、材料 鸡血红细胞 2、试剂 50%PEG、GKN溶液、Alsever’s细胞保存液、0.85%氯化钠溶液。 3、器材 倒置显微镜、离心机、载玻片、盖玻片、离心管、废液缸、滴管等。 【实验原理】 细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括：病毒诱导融合、化学诱导融和和电激诱导融合。 1、病毒诱导融合 仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。 2、化学诱导融合 很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG 是广泛使用的化学融合剂。 3、电激诱导融合
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目动物细胞融合 包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。 【实验步骤】 在本次实验中采用的是化学诱导融合的方法，利用PEG使鸡血红细胞发生融合。具体实验步骤如下： 1、取鸡血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混匀后制悬液（4℃保存）【老师已做好，可直接使用】 2、取（1）中悬液1ml+4ml的0.85%的NaCl溶液，进行以下三次离心处理： ①在1200r/min下离心5min，去掉上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5ml； ②1000-1200r/min下离心5min，去掉上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5ml； ③1000-1200r/min下离心7min 【因时间关系此次实验只离心一次】 3、将离心后的沉降血球（去上清后约0.1-0.2ml）加入GKN至1-2ml，使之成为10%的细胞悬液； 4、取上述10%的血球悬液1ml,加入3mlGKN液，使每毫升含血球15000000个； 5、分别取（4）1ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+1.0ml50%PEG，混匀滴片，编号分别为①②③号溶液。在常温下2-3min后，显微镜下观察。 【实验结果】 1、实验中可观察到两个和多个细胞发生质膜融合现象,可看到不同融合状态的细胞： ①两细胞的细胞膜相互接触、粘连； ②接触部分的细胞膜崩解，两细胞的细胞质相同，形成一个细胞质的通道，呈现哑铃状； ③通道扩大，两个细胞连成一体，呈现一个长椭圆形细胞； ④细胞融合完成形成含有双核或者多核的细胞，呈圆形。 比较典型的细胞融合时的形态如下图：
原理，实验步骤或实验方法，实验结果与分析，注意事项，实验感悟 实验一培养基母液的配制 一、实验目的 通过配置MS培养基母液，掌握母液的配置和保存方法 二、实验原理 配置培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配置，即按培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配置即可。 三、实验材料、试剂和仪器设备 1.试剂 NH 4NO 3 ,KNO 3 ,KH 2 PO 4 , CaCl 2 ·2H 2 O ,MgSO 4 ·7H 2 O,FeSO 4 ·7H 2 O Na 2-EDTA,MnSO 4 ·4H 2 O,ZnSO 4 ·7H 2 O, , KI,CuSO 4 ·5H 2 O,CoCl 2 ·6H 2 O,肌醇，甘氨酸， 盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸，蒸馏水NAA,6-BA 2.仪器设备 电子天平，烧杯（50ml、100ml、500ml、1000ml）量筒（1000ml、100ml、25ml），容量瓶(1000ml、500ml、100ml)，试剂瓶，玻璃棒数支，药芍，称量纸等。 四、实验步骤 1 大量元素母液的配制 先用量筒称量适当蒸馏水放入500ml烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取： NH 4NO 3 ,KNO 3 , KH 2 PO 4 , MgSO 4 ·7H 2 O, CaCl 2 ·2H 2 O，待第一种化合物完全溶解后再 加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液转移至500ml容量瓶中，用蒸馏水定容至500ml，然后转移至细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。 2 微量元素母液的配制 按照配方表中用量用电子天平依次称取MnSO 4·4H 2 O, ZnSO 4 ·7H 2 O H3BO3 , KI, Na 2 MoO 4 ·2H 2 O，CuSO 4 ·5H 2 O, CoCl 2 ·6H 2 O,按制备母液I的方法逐个 溶解，转移至容量瓶中，然后定容至500ml，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。 3铁盐母液的制备
鸡血细胞的体外融合 【实验目的】 1．掌握聚乙二醇（PEG ）诱导体外细胞融合的基本原理。 2．通过PEG 体外诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。 【实验原理】 细胞融合(cell fusion ）又称体细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞(hybrid cell ）。细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。 显微镜下的细胞融合过程 融合过程中两个细胞膜的变化过程
依据融合过程采用的助融剂的不同，细胞融合可分为：（1）病毒诱导的细胞融合，如：仙台病毒（hemagglutinating virus of Japan，HVJ）；（2）化学因子诱导的细胞融合，如：聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）；（3）电场诱导的细胞融合；（4）激光诱导的细胞融合。 PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子质量的多聚体。PEG可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，引起细胞融合。该方法应用分子质量为400—6000的PEG溶液引起细胞的聚集和粘连，产生高频率的细胞融合。融合的频率和活力与所用PEG的分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。 【方法与步骤】 1. 鸡血细胞的获得： 从家鸡的翼根静脉用注射器采血，注入试管后，迅速加入肝素（100U 肝素/ 5ml全血）混合，制成抗凝全血。 2. 鸡血细胞储备液的制备： 在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85 %NaCl溶液，制成红细胞储备液，置于4℃冰箱内可供一周内使用。 3. 鸡血细胞悬液的制备： 取鸡血细胞储备液1ml，加入4ml 0.85 %NaCl溶液，混匀后，1200rpm离心5min，弃去上清液，再加入5ml 0.85 %NaCl溶液按上述条件离心一次。最后，弃去上清液，加入10ml的GKN 溶液制成鸡血细胞悬液。 4. 计数： 取0.5ml鸡血细胞悬液，加3.5ml的GKN溶液进行稀释，在血细胞计数板上计数。若细胞浓度过大，用GKN溶液稀释至1X107个/ml左右。 5. 鸡血细胞的收集： 吸取1ml鸡血细胞悬液放入离心管中，加入4mlHanks液混匀，1000rpm离心5min。弃去上清液，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。 6. PEG诱导细胞融合： 吸取0.5ml 37℃的50%PEG4000溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴加入，边加边轻摇离心管，使PEG与细胞混匀，然后在37℃水浴中静置2min。
细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤
植物细胞工程综合大实验（一） ——培养基配制和无菌操作 一、实验目的与要求 熟练掌握器皿的洗涤 MS培养基的配制分装 培养基和物品的高压灭菌 实验室的消毒灭菌 植物材料的取材及流水冲洗 无菌操作 材料的培养观察 二、实验原理 植物细胞的全能性。 三、仪器设备与器具 电子天平、移液枪、冰箱、高压锅、超净工作台、 三角瓶、烧杯、容量瓶、培养皿、搪瓷缸、镊子、 解剖刀、酒精灯、试剂瓶、玻璃棒、线绳、pH试纸、封口膜、试管刷、洗涤剂、打火机等。 四、实验材料 彩云阁茎段（用于诱导愈伤组织） 茎节（用于诱导芽） 五、实验方法与步骤 （一）器皿的洗涤
一般器皿 有培养物但未污染的器皿 有培养物且污染的器皿 （二）MS培养基的配制分装 1、MS培养基母液的配制 母液A-F，每组配制A-E 100ml、F 50ml 0.1%升汞的配制 75%酒精的配制 6-BA NAA 2、MS培养基的配制 按每人配制100ml，分5小瓶。 过程如下；每组按1L配制，先取容器内加70%的蒸馏水； 加入蔗糖30g/L；量取母液A-F；加入PGR（自己设计）；用容量瓶定容；用0.1-1N NAOH或HCl调整pH5.6-5.8；每人分100ml；加琼脂粉8g/L；分装到5个小三角瓶中、封口。 （三）培养基和物品的高压灭菌 培养基、无菌水（每组至少5瓶）、空瓶（每组至少2个）、烧杯（每组至少1个）、培养皿（每组至少一套）、接种工具（2套），包好或者分好以备高压灭菌。 高压锅的使用。 （四）实验室的消毒灭菌
75%的酒精擦拭超净工作台内表面，新洁尔灭水进行超净工作台外表面、培养架表面、墙壁及其他房间表面的擦拭。 （五）植物材料的取材及流水冲洗 选取适宜的彩云阁茎节及茎段，切割成适宜大小后放在流水下冲洗。 （六）无菌操作 演示。 （七）材料的培养观察 接种完的材料放在培养室的培养架上进行培养。培养初期每天观察一次，持续1周。之后每2-3天观察一次。 统计指标： 污染率（%）= （污染的外植体个数／接种外植体的总数）×100%。 愈伤组织诱导率（%）= （长愈伤外植体个数／接种外植体总数）×100%。 芽诱导率（%）= （长芽外植体个数／接种外植体的总数）×100%。（八）结果与分析
题目：PEG促细胞融合 一．实验目的: 1.掌握细胞融合的方法 2.学习使用PEG促进细胞融合的方法和步骤 二．实验原理 1.细胞融合：在自然条件下或用人工方法（生物的、物理的、化学的）使两个或两个以上 的细胞合并形成一个细胞的过程。由于体外培养的细胞很少会发生自发融合融合频率大约在10?4-10?6之间，因此要采用生物、化学或物理的方法人为地促使细胞融合。 2.促进细胞融合的方法 a)生物方法：病毒（Sendai virus，Newcastle disease virus，Vaceine virus） b)化学方法：聚乙二醇、盐类融合剂、二甲亚砜（DMSO）、甘油-醋酸酯、油酸盐、脂 质、Ca2+配合物等。PEG相对分子质量在200-6000均可用作细胞融合剂。普遍认为 聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏 散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用， 从而使细胞发生融合。在众多的化学试剂中，PEG应用最为广泛，因PEG液比病毒 更易制备和控制、活性稳定、使用方便、而且促进细胞融合的能力更强。 c)物理方法：电融合:电处理融合法是20世纪80年代发展起来的细胞融合技术，是 融合率大为提高。电脉冲作用时引起膜结构局部扰乱，出现小孔洞。而相对的脂 双层间分子在范德华力作用下，形成脂分子桥。由于连接处的细胞膜表面曲率大， 处于高张力状态，在热力学上是不稳定的，所以最终导致两细胞逐渐融合成一个圆 形的大球状细胞。与ⅣG法比较，电融合法融合率高：重复性强：诱导仅发生在 质膜接触部位，对细胞或原生质体伤害小：融合是在同步状态下进行，活细胞数目 多；装置精巧，方法简单，可在显微镜下观察或录象融合过程：免去PEG诱导后的 洗涤过程，诱导过程可控制性强。 三．实验材料及设备 1.实验材料： a)50%PEG混合液
HUAZHONG AGRICULTURAL UNIVERSITY 烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生的研究Research on Callus Induction and Plant Regeneration of Tobacco Leaves 姓名: 黄金波 CANDIDATE：Huang-Jin Bo 学号: 2012304200510 STUDENT ID：2012304200510 课程: 植物细胞工程实验CURRICULUM：Plant Cell Engineering Experiment 班级: MAJOR: 生技1201班Biotechnology 1201 指导老师：SUPERVISOR：柳俊齐迎春陈浩 Liu-Jun Qi-Ying Chun Chen-Hao 中国武汉 WUHAN， CHINA
二○一四年十二月DEC, 2014
烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生的研究 黄金波 华中农业大学生命科学技术学院生技1201班 [摘要] [目的]以烟草叶片为材料，通过这次实验，基本掌握植物愈伤组织诱导与植株再 生的原理和方法，熟练掌握相关实验操作技术；另外，通过本次实验，完成烟草植株再生，并对比光照和黑暗等不同方法，对诱导愈伤组织状态和诱导率的影响，进行结果分析。 [方法]在无菌条件下，把烟草叶片剪成1cm2大小的小方块，先通过含0.25mg/L NAA和0.25mg/L BA的MS诱导培养基在光照和黑暗条件下诱导培养；三周后，转接到含0.25mg/L NAA和1.0mg/L BA的MS分化培养基中光照培养；两个月后，观察结果，统计分析。 [结果]诱导培养后，在光照条件下和在黑暗条件下培养的均有67.7%的被污染了；用剩下的33.3%全部接种到分化培养基上培养。结果表明分化率在光照条件下和在黑暗条件下无差别；每个愈伤组织分化芽数在光照条件下明显多于在黑暗条件下诱导；分化芽状态在黑暗和光照条件有一定的区别，分化植株苗在光照和黑暗条件下诱导没有明显区别。 [结论]光照条件和在黑暗条件下诱导可以影响愈伤分化芽数和分化芽状态。 [关键词] 烟草叶片；愈伤组织；细胞工程；分化；诱导；植株再生 Research on Callus Induction and Plant Regeneration of Tobacco Leaves Huang-Jin Bo Huazhong Agriculture University , College of Life Science and Technology , Biotechnology 1201 [Abstract] [Objective]Using tobacco leaves as materials, through the experiment, we should handle the basic principle and method of plant callus induction and plant regeneration，master related experiments’technology; In addition, through this experiment, to complete the tobacco plant regeneration, and compared different methods of callus induction, such as light and dark state, and the effects to the state and induction rate, then analyzing the results. [Method]The tobacco leaf was cut into 1 cm2 size small squares under aseptic conditions. Firstly induced in the MS induction medium with 0.25 mg/L NAA and 0.25 mg/L BA, under the condition of light and dark, respectively; Three weeks later, transferred to MS differentiation medium with 0.25 mg/L NAA and 1.0 mg/L BA culturing under light; Two months later , observing the results, and analyzing the statistics. [Results]After the induction culturing, 67.7% materials were polluted both under the condition of light and dark; rest 33.3% materials were inoculated to the differentiation medium, continuing to cultivate. As a result, it was successfully. The results show that there are no obvious differences between with the light condition and dark condition. Each number of callus bud differentiation under the condition of the light induced significantly more than in the
细胞生物学与细胞工程实验 课程编号：2511240 英文名称：Cell Biology and Cell Engineering 课程负责人：王昌留 师资队伍：王昌留、黄玲、李清、曲明娟、孙振兴 适用专业：生物科学 开课学期：秋季学期 课程类型：专业基础必修课 实验课性质：独立设课/非独立设课 先修课程：植物学实验/2511110、动物学实验/2580070、生物化学实验/2501040 总学时：理论学时实践学时 36 课外学时 总学分：1 采用教材及参考书： 1. 安利国主编：《细胞生物学实验教程》，科学出版社，2004 2. 杨汉民主编：《细胞生物学实验》第二版，高等教育出版社，1997 3. 李志勇：《细胞工程》第一版，科学出版社，2003 4. 徐承水，党本元主编：《现代细胞生物学技术》，青岛海洋大学出版社，1995 5. 王金发主编：《细胞生物学实验教程》，科学出版社，2003 内容简介： 本课程是一门理论性和技术性都很强的课程，是在学生已修完生物学、生物化学、细胞遗传学、细胞生物学与细胞工程、微生物学、免疫学基础上而设立的，是生物科学专业的必修课程。 本课程既包括细胞生物学基础实验又包括细胞工程综合实验，是一门对实验仪器要求较高的课程。开设本课程的目的是使学生掌握细胞生物学与细胞工程实验设备的操作方法，具备观察和研究细胞结构、功能与生命活动的基本方法，学会发现问题和解决问题的基本技能，为毕业后从事生物学相关的科研和教学工作奠定基础。 本课程考核成绩由平时成绩（占30%）、实验报告成绩（占30%）和终期考核成绩（占40%）三部分构成。 本实验包括的实验项目包括：
2.1.1植物细胞工程的基本技术 【学习目标】1、简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术。 2、尝试进行植物组织培养。 【学习重点】1、植物组织培养的原理和过程 2、植物体细胞杂交的原则 【学习难点】植物组织培养的实验 课 前 案 读课本，独立完成下列问题 （要求：能准确写出关键词与句，以课本为准） 一、细胞工程 1．概念：应用 和 的原理和方法，通过 或 上的操作，按照人的意愿来改变细胞内的 或获得 的一门综合科学技术。 2．分类：根据操作对象不同，可分为 、 。 二、植物细胞的全能性 1、植物细胞的基本结构包括 、 、 、 。 2、植物细胞主要的增殖方式是 ，细胞分化是指 ，_____________________________________________________________________________原因是 。 3、全能性是指 ，表现为全能性的原因是 。 4．在理论上，生物的任何一个细胞都具有 ，但在生物的生长发育过程中，细胞并不表现 ，而是分化成各种 。 5．特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会有 地表达出各种 ，分化形成 不同的细胞，从而构成生物体的不同 。 三、植物组织培养技术 1．原理：植物细胞具有 ，具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成 的潜能。 2．过程: 离体植物的 ??→ ?脱分化 _ 组织??→ ?再分化幼根和芽或 胚状体 ??→ ?发育 完整植株。 3．细胞脱分化：已 的细胞经过诱导后，失去其特有的 而转变成未分化 细胞的过程。 4．植物组织培养：在 和 的条件下，将 的植物器官、组织、细 胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生 、丛芽，最终形 成完整植株。 四、胡萝卜的组织培养实验 1、实验原理 生物体细胞一般都是由受精卵经过有丝分裂形成的，因而都含有该生物的全套的遗传信息，都 具有发育成完整个体的潜能。因此，植物体的根、茎、叶细胞都具有 ，在一定的营养和激素条件下，可以脱分化形成 。将愈伤组织转接到含有不同激素成分的培养基上，就可以诱导其再分化生成胚状体或丛芽，进而发育成 。 2、实验步骤 ①．将 用自来水充分洗净，削去外皮，并切成段。用酒精棉球擦手 。 ②．在超净工作台(或接种箱)上将胡萝卜段用酒精溶液消毒30s 后，立即用 清洗2～3次，再用 处理30min 后，立即用无菌水清洗2～3次。 ③．用 的滤纸吸去胡萝卜段表面的水分。然后，在 瓷砖上，用无菌的解剖刀将胡萝卜段切成1 cm 厚的横切片，再选取有 的部位，切取1 cm 。左右的小块。 ④．将 接种到培养基上，用锡箔纸封盖瓶口，并用橡皮筋扎紧。然后，在培养瓶上贴上标签，写明材料名称、接种日期和小组号。 ⑤．将接种后的胡萝卜组织块，放在 恒温避光条件下培养。4d 后，检查培养材料的污染情况；14d 后，观察愈伤组织的生长状况。然后，在恒温箱中继续避光培养。在培养过程中，注意定期观察和记录愈伤组织的生长情况。 ⑥．培养一段时间后，将生长良好的 转接到分化培养基上，培养一段时间后，胡萝卜的愈伤组织就可以诱导出 。然后将试管苗移栽到大田，培养成 。 五、植物体细胞杂交技术 1．概念：不同种植物的 ，在一定条件下融合成 ，并把杂种细胞培育成新的 的技术。 2．过程 离体的细胞果胶酶纤维素酶???→ ?不同细胞原生质体--------→原生质体融合 →杂种细胞→杂种植株。 【预习自测】 1、下列细胞的全能性最高的是 ( ) A 、植物的卵细胞 B 、植物的花粉 C 、被子植物的受精卵 D 、被子植物的叶肉细胞 2．下列属于组织培养的是 ( ) A ．花粉培育成单倍体植株 B ．芽发育成枝条 C ．根尖分生区发育成成熟区 D ．未受精的卵细胞发育成个体 3．组织培养的理论根据是 ( ) A ．培养基中营养物质全面 B ．细胞的全能性 C ．细胞的分裂 D ．细胞的分化 4．愈伤组织细胞在一种包含所有必需物质的培养基中培养了几个小时，其中一种化合物具有放射性(氚标记)。当这些细胞被固定后镜检．利用放射自显影技术发现放射性物质集中于细胞核、线粒体和叶绿体。可以肯定标记的化合物是 （ ） A 一种氨基酸 B ．尿嘧啶核苷酸 C ．胸腺嘧啶脱氧核苷酸 D ．葡萄糖
细胞传代培养 一.实验目的 初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物技术在医学上的 应用打下基础。 二、原理 从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生 长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接 观察 活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可 以与 体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较 经济， 因此成为生物学研究的重要手段。 细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养 为 原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞 分散 后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养， 传 代培养的累积次数就是细胞的代数。 细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受 温度、渗透压、ph值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌 操 作是细胞培养成败的关键。 三、材料和试剂 1、细胞：293细胞株 2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清） 3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、电动枪，培养板，吸液枪，5ml玻璃吸管、酒精 灯等 四、操作步骤 1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。 2、加入1~2ml 0.25％胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中。 3、马上吸走胰酶液，再次加入2ml左右的胰酶，同样马上吸去，再加入几滴胰酶放入 培养箱中消化几分钟 4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，再按照观察的生长情况确定的传代比例传代 5.根据确定的比例来取需要的量（剩余的细胞拿来做细胞计数），加入4ml左右的培养液 6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养板放入培养箱 7.收拾整理超净台 附：消化液配制方法： 称取2.5克胰酶蛋白酶，加入100ml10xpbs+纯水溶解到1l，滤器过滤除菌，4℃保存， 用前可在37℃下回温。 10x pbs配方：na2hpo4(14.2g) kh2po4(2.32g) nacl(80g) kcl(2.02g) (调至ph=7.4） 五、实验结果
植物细胞工程 实验一 培养基母液的制备 一、实验目的与意义 学习和掌握培养基母液的配制方法。 在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。当配制培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。 二、实验器材 电子天平（称量为0.0001g ）、电子天平（称量为0.01g ）、烧杯（500ml 、100ml 、50ml ）、容量瓶（1000ml 、100 ml 、50 ml 、25 ml ）、细口瓶（1000 ml 、100 ml 、50 ml 、25 ml ）、药勺、玻璃棒、电炉。 三、实验药品 NH 4NO 3、KNO 3、CaCl 2·2H 2O 、MgSO 4·7H 2O 、KH 2PO 4、KI 、 H 3BO 3、 MnSO 4·4H 2O 、 ZnSO 4·7H 2O 、 Na 2MoO 4·2H 2O 、CuSO 4·5H 2O 、CoCl 2·6H 2O 、FeSO 4·7H 2O 、Na 2-EDTA·2H 2O 、肌醇 、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B 6)、盐酸硫胺素(维生素B 1)、甘氨酸。 四、实验步骤 每种母液均配制500ml ，各成分的质量如下： 1、大量元素母液的配制 表1 MS 培养基大量元素母液制备 序号 药品名称 培养基浓度（mg/L ） 扩大20称量(mg) 备注 1 NH 4NO 3 1650 16500 蒸馏水定容至500ml 2 KNO 3 1900 19000 3 CaCl 2·2H 2O 440 4400 4 MgSO 4·7H 2O 370 3700 5 KH 2PO 4 170 1700 各成分按照表1培养基浓度含量扩大20倍，用称量为0.01g 的电子天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到500ml 的容量瓶中，即为20倍的大量元素母液。到入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，每配1L 培养基取此液50ml 。 注意： ①配制大量元素母液时，某些无机成分如Ca 2+、SO 42一 、Mg 2十 和H 2PO 4一 等在一起可能 发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，母液配制时要用纯度高的双蒸水溶解，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须先以少量双蒸水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。特别应将Ca 2+、SO 42一 、Mg 2十 和H 2PO 4一 等离子错开混合，速度宜慢， 边搅拌边混合。
山东大学实验报告2018年4月9日 ________________________________________ _________________________ 姓名：丁志康系年级：2016级组别：1-1 科目：细胞生物学实验题目：动物细胞融合实验学号：201600140055 实验序号：4 一、目的要求 1.了解动物细胞融合的常用方法。 2.学习化学融合的基本操作过程。 3.观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化。 二、实验原理 1、细胞融合的概念 细胞融合(cell fusion)，细胞遗传学名词，是在自发或人工诱导下，两个细胞或原生质体融合形成一个双核或多核的杂种细胞的过程，也被称为细胞杂交（cell hybridization）。 基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。 同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱导融合。 2、细胞融合的方法及发展简史 ①诱导细胞融合的方法： a.生物法（病毒诱导融合）： 某些病毒因为其被膜中含有融合蛋白，可以介导病毒同宿主细胞融合，同时也可以介导细胞 与细胞的融合，所以这些病毒经紫外线灭活后可作为细胞融合的生物诱导剂使用，例如仙台 病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等。 b.化学法（化学诱导融合）： 很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性 卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后， 细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的 相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导 融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG是广 泛使用的化学融合剂。 c.物理法（电激诱导融合）： 包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排 布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表 面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。 ②细胞融合的发展简史 Muller于1838年观察到脊椎动物肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。 Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。
科目细胞生物学实验实验题目动物细胞融合日期2013.03.07 姓名*** 系年级2011级生物基地学号*** 实验一利用聚乙二醇为媒介物进行细胞融合 摘要 细胞融合(cell fusion)是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合形成异核体(heterokaryon)、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。 诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（离心，震动，电刺激）。某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。 关键词 细胞融合；人工诱导；PEG 前言 人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。 细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。细胞融合另一个重要应用就是制备单克隆抗体，单克隆抗体可以用作诊断试剂，治疗疾病和运载药物，具有准确，高效，简易，快速等优点。因此，融合细胞的研究为生物学无论在基础理论上或生产实践上开辟了一条新的道路。这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。 一．实验目的 1.了解动物细胞融合的常用方法及原理。 2.掌握利用PEG为介导物对细胞进行诱导融合的方法。 3.观察动物细胞融和过程中细胞的行为和变化。 二．实验原理
河北科技师范学院学报 第19卷第1期,2005年3月 Jo ur nal o f Hebei N or mal U niver sity of Science&T echnolog y Co llege V o l.19 No1.1M arch2005 植物细胞融合的研究进展(综述) 郭学民1,2,徐兴友1,2,王同坤1,王华芳2,尹伟伦2 (1河北科技师范学院生命科学系,河北秦皇岛,066600;2北京林业大学生物科学与技术学院)摘要:概述了原生质体分离和培养的影响因素,介绍了近年来国内外原生质体培养与融合及杂种细胞、筛选和鉴定的动态。 关键词:细胞融合;原生质体;筛选与鉴定 中图分类号:Q321+.2 文献标识码:A 文章编号:1672-7983(2005)01-0065-05 细胞融合(cy to mixis),亦称细胞杂交(cell fusio n),是指亲本的两个细胞在特定的物理和化学因子处理下合并为一个杂种细胞的过程[1]。植物细胞融合可分为体细胞杂交(somatic hybridizatio n)和配子-体细胞杂交(gameto-somatic hy br idizatio n),前者是指不经过有性过程,而直接由体细胞原生质体融合产生杂种细胞,形成愈伤组织,并再生出植株的过程[2],后者是指性细胞(如小孢子四分体、精子、精细胞、幼嫩花粉、成熟花粉、卵细胞、助细胞和中央细胞等)原生质体和二倍体原生质体融合产生三倍体杂种细胞,形成愈伤组织,并再生出植株的过程[3]。植物细胞融合是植物细胞工程的一个重要分支,是一种突破物种生殖隔离、创造远缘杂种的新途径,原生质体技术还可用于细胞突变体的筛选、细胞器移植和外源DNA的导入。 自1960年Cocking[4]用酶法分离出番茄根原生质体后,Natag a和T akebe[5]1970年首次利用烟草叶分离原生质体,经培养获得再生植株;1975年以色列的Vardi等[6]首次从木本植物Sham onti甜橙珠心组织诱导胚性愈伤组织,并从愈伤组织分离原生质体,经培养通过胚状体再生出植株;在禾本科植物中,除在珍珠谷、紫狼尾草用悬浮细胞为材料,较早获得原生质体再生植株外,直到1985年Fujim ur a[7]等率先在水稻原生质体培养中获得了再生植株,才出现了重大突破。现已从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株。随着多种植物原生质体的成功培养和融合技术的不断改进,植物细胞融合获得了巨大成功。植物细胞融合包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养,以及植株的再生和鉴定等环节。 1 原生质体的分离和培养 1.1 起始材料 起始材料及其生理状态对原生质体的制备及其活力有很大的影响。在以往的双子叶植物培养中,大多以叶片为分离原生质体的材料,近年来,起始材料的适用范围有了较大扩展。目前,以愈伤组织、悬浮细胞和体细胞胚为材料制备原生质体是最主要的方式;禾本科植物原生质体培养获得成功的试验,几乎都是用从幼胚或成熟胚诱导形成的胚性愈伤组织或胚性细胞系来游离原生质体。采用这些材料制备原生质体方法简便、产量高、不污染、不易破碎。 1.2 基因型 同一植物不同基因型的原生质体脱分化与再分化所要求的条件不同,所以在相同条件下,不同品种的再生能力不同。王光远和夏镇澳[8]在水稻原生质体培养中曾用26个品种进行组织培养,其中仅有3个品种(粳稻农虎6号、国香1号和上农香糯)能成功地用于原生质体培养,获得再生植株。据统计,小麦获得原生质体再生植株的基因型只有大约10个[9]。基因型的选择在植物原生质体培养中起着重要作用,它不仅影响原生质体的产量和活力,而且还影响植株的再生。Cheng和Veillenux证明芙薯(Solanum phureja)从原生质体培养到愈伤组织形成受2个独立位点的显性基因的调控[10]。因此,现有 收稿日期:2004-03-09;修改稿收到日期:2004-12-12