脾脏单个核细胞的制备
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脾脏单个核细胞的制备脾脏单个核细胞的制备: 将5 只小鼠断颈椎处死, 无菌取出脾脏, 分别剪碎, 置200 目无菌尼龙网上, 分次滴入4~ 5 ml RPMI1640 培养液, 轻轻研磨脾脏, 直到脾脏变白;收集细胞悬液( 由于红细胞所占比例很低且对实验影响不大, 故无需作红细胞裂解处理) , 1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5 min, 弃上清; 加入2 ml pH7. 4 的PBS, 混匀后1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5min, 弃上清; 加入4 ml RPMI1640 培养液, 混匀, 用RPMI1640 培养液稀释200 倍后滴加在细胞计数板上进行细胞计数, 根据计数结果用RPMI1640 将细胞悬液调成2 × 10 / 300 µl 的浓度。
《流式细胞术检测小鼠脾细胞内细胞因子刺激方案的筛选》单细胞悬液的制备:将大鼠颈椎脱位处死后, 置70%乙醇中浸泡5 m in, 无菌取出脾脏和胸腺置于平皿中, 除掉结缔组织, 用生理盐水清洗3次。
加入2 mL RPM I- 1640完全培养液, 用剪刀分别将脾和胸腺剪成1 mm 1 mm 1 mm 碎块后, 用毛玻片轻柔研磨组织碎片, 经8层纱布过滤制成单细胞悬液, 经H anks液离心洗涤后, 将细胞悬浮于含10%小牛血清的RPM I- 1640 培养液。
台盼蓝染色, 计数活细胞在95%以上, 调整细胞数至5×10 cells /L。
《粗江蓠多糖对大鼠淋巴细胞周期的影响》610制备脾细胞悬液脾淋巴细胞的获取:手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳等手术器械,300 目尼龙网等须经消毒处理; 以颈椎脱臼法处死小鼠, 用7 5 % 乙醇浸泡小鼠10-15min 。
沿腹腔中线剪开小鼠胸腔, 取出脾脏置于培养皿中, 剪去脂肪和筋膜组织, 用R PMI-1640培养液漂洗。
粗剪成小块, 用注射器芯轻轻挤压, 加人基础培养液, 混悬, 用300目尼龙网过滤到玻璃离心管中, 再加人基础培养液冲洗网上剩余组织细胞。
第1篇一、实验目的1. 掌握单细胞制备的基本原理和方法。
2. 熟悉细胞培养的无菌操作技术。
3. 学习使用显微镜观察细胞形态和生长状态。
4. 了解细胞计数和细胞活力检测的基本方法。
二、实验原理单细胞制备是指从组织中分离出单个细胞,以便于进行细胞培养、分子生物学研究等实验。
本实验采用胰蛋白酶消化法进行单细胞制备,该方法能够有效破坏细胞间的连接,使细胞离散成单个细胞。
三、实验材料1. 实验动物:小白鼠2. 实验试剂:胰蛋白酶、Hank's液、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、无菌注射器、无菌剪刀、无菌镊子、无菌培养皿、无菌吸管、显微镜、血球计数板等。
四、实验步骤1. 组织块制备:取小白鼠脾脏,用无菌剪刀剪成1mm³大小的组织块,放入无菌培养皿中。
2. 消化:向组织块中加入适量胰蛋白酶,在37℃水浴中消化10-15分钟。
3. 分散:用无菌吸管轻轻吹打组织块,使细胞离散成单个细胞。
4. 计数:用血球计数板计数细胞数量,计算细胞活力。
5. 洗涤:用Hank's液洗涤细胞悬液3次,去除未消化的组织碎片和残留的胰蛋白酶。
6. 调整细胞浓度:用DMEM培养基调整细胞浓度至1×10⁵细胞/毫升。
7. 接种:将细胞悬液接种于无菌培养皿中,放入培养箱中培养。
8. 观察:用显微镜观察细胞的生长状态,包括细胞形态、大小、核质比等。
五、实验结果1. 细胞形态:接种后24小时,可见细胞开始贴壁生长,细胞呈圆形、椭圆形或不规则形。
2. 细胞活力:计数结果显示,细胞活力达到95%以上。
3. 生长状态:接种后3-4天,细胞开始分裂增殖,形成致密的单层细胞。
六、实验讨论1. 胰蛋白酶消化法是单细胞制备的常用方法,具有操作简单、效率高等优点。
2. 消化时间和温度对细胞活力和细胞形态有重要影响。
消化时间过长或温度过高可能导致细胞损伤。
3. 细胞计数和活力检测是评估细胞质量的重要指标。
4. 单细胞制备是细胞生物学研究的重要基础,对于细胞培养、分子生物学研究等实验具有重要意义。
小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间:____________ 实验地点:_____________ 实验人:__________________ 1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧,体积较大,长条形,属于外周免疫器官。
外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域,所以富含各类免疫细胞。
免疫细胞的分离:采用红细胞裂解法,是根据细胞对渗透压变化的敏感度。
红细胞由于细胞结构较为简单,仅有细胞膜结构,对于膨胀的耐受能力较差,因此绝大部分就会涨破,受到破坏。
是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。
2实验材料:1)健康小鼠2)手术器械(剪刀、镊子)、解剖板3)70汇醇4)PBS缓冲液、红细胞裂解液(ACK5)0.2%台盼蓝6)细胞计数板、计数器7)离心机8)显微镜3实验方法:3.1取小鼠脾脏将小鼠颈椎脱位处死,用酒精消毒。
用剪刀剪开背部皮肤,再找到脾脏,用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。
3.2制备单个核细胞悬液将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中,然后再置于尼龙指套中,用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。
吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管(15ml)中,以1500rpm离心10min, 弃去上清液,加入ASK至2-3ml,轻轻吹打混匀并放置2min,以破坏红细胞。
然后加入PBS缓冲液至10ml,以1500rpm离心10min。
弃去上清液,用PBS缓冲液定容至2ml,吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
3.3 计算细胞浓度稀释十倍,随机选取一个大方格计数细胞计数为324个,计算细胞浓度为324X 104X 10=3.24 X 107/ml3.4 计算细胞活力在总计为324个细胞中计数,死亡细胞有16 个,计算细胞活力为:324- 16/324 X 100%=95.1%在理论范围之内4 实验结果4.1 研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内,置于少量PBS液中缓慢研磨,获得细胞悬液。
动物脾脏单个核细胞分离液试剂盒使用说明规格:3×200mL/kit保存:动物脾脏单个核细胞分离液试剂盒对光敏感,应该室温避光储存,保质期2年。
无菌开封后,保存于室温。
组成:各种动物脾脏单个核细胞分离液200mL全血及组织稀释液200mL细胞洗涤液200mL单个核细胞分离方法1.制备脾脏的单细胞悬液。
2.取一支适当的离心管,加入与脾脏单细胞悬液等量的分离液(分离液最少不得少于3mL,总体积不能超过离心管的三分之二,否则会影响分离效果)。
3.小心吸取单细胞悬液加于分离液液面上,注意保持两液面界面清晰。
(可以使用巴氏德吸管吸取单细胞悬液,然后小心的平铺于分离液上,因为两者的密度差异,将形成明显的分层界面。
)4.室温,500~900g,离心20~30min。
(根据脾脏单细胞悬液的量确定离心条件,单细胞悬液量越大,离心力越大,离心时间越长,具体离心条件可以自行摸索,以达到最佳分离效果)。
5.离心后,此时离心管中由上至下细胞分四层。
第一层为稀释液层;第二层为环状乳白色单个核细胞层;第三层为透明分离液层;第四层为红细胞层。
6.用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层至另一洁净的15mL离心管中,向离心管中加入10ml细胞洗涤液洗涤白膜层细胞,250g,离心10min。
7.弃上清,5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞,250g,离心10min。
8.重复步骤79.弃上清,细胞重悬备用。
分层示意图脾脏单细胞悬液的制备方法脾脏研磨的方法:1.无菌条件下摘取脾脏,撕去脾脏被膜,用眼科剪将脾脏剪成小块。
2.将尼龙筛网或者是细胞过滤筛放置于平皿上,加入少量全血及组织稀释液(保证脾脏及获得的细胞处于液体环境中)。
3.将脾脏放置于筛网上,使用注射器活塞或者是无菌镊子来研磨脾脏(尽量控制研磨力度,保持筛网悬空,避免在皿底上直接研磨而造成大批细胞死亡)4.研磨完全后使用全血及组织稀释液冲洗筛网,收集细胞悬液,再经滤网过滤。
脾脏单个核细胞的制备: 将5 只小鼠断颈椎处死, 无菌取出脾脏, 分别剪碎, 置200 目无菌尼龙网上, 分次滴入4~ 5 ml RP MI1640 培养液, 轻轻研磨脾脏, 直到脾脏变白; 收集细胞悬液( 由于红细胞所占比例很低且对实验影响不大, 故无需作红细胞裂解处理) , 1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5 min, 弃上清; 加入2 ml pH7. 4 的PBS, 混匀后1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5min, 弃上清; 加入4 ml RPMI1640 培养液, 混匀, 用RPMI1640 培养液稀释200 倍后滴加在细胞计数板上进行细胞计数, 根据计数结果用RPMI1640 将细胞悬液调成2 × 106 / 300 µl 的浓度。
《流式细胞术检测小鼠脾细胞内细胞因子刺激方案的筛选》
单细胞悬液的制备:将大鼠颈椎脱位处死后, 置70%乙醇中浸泡5 m in, 无菌取出脾脏和胸腺置于平皿中, 除掉结缔组织, 用生理盐水清洗3次。
加入2 mL RPM I- 1640完全培养液, 用剪刀分别将脾和胸腺剪成1 mm 1 mm 1 mm 碎块后, 用毛玻片轻柔研磨组织碎片, 经8层纱布过滤制成单细胞悬液, 经H anks液离心洗涤后, 将细胞悬浮于含10% 小牛血清的RPM I- 1640 培养液。
台盼蓝染色, 计数活细胞在95%以上, 调整细胞数至5×1010 cells /L。
《粗江蓠多糖对大鼠淋巴细胞周期的影响》
制备脾细胞悬液脾淋巴细胞的获取:
手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳等手术器械,300 目尼龙网等须经消毒处理; 以颈椎脱臼法处死小鼠, 用7 5 % 乙醇浸泡小鼠10-15min 。
沿腹腔中线剪开小鼠胸腔, 取出脾脏置于培养皿中, 剪去脂肪和筋膜组织, 用R PMI-1640培养液漂洗。
粗剪成小块, 用注射器芯轻轻挤压, 加人基础培养液, 混悬, 用300目尼龙网过滤到玻璃离心管中, 再加人基础培养液冲洗网上剩余组织细胞。
收集滤过的细胞悬液, 加人0.83 % 的氯化铵到滤过的细胞中, 静置5 min , 以除去血红细胞。
用RPM-ll640 培养液离心( 2500 r/min,10min) 洗涤细胞3 次, 以除去剩余的氯化铵将上述收集到的脾脏细胞置于玻璃培养瓶中, 在37 ℃、5 % C O: 培养箱中静置培养2 h , 以除去贴壁细胞, 收集未贴壁的细胞悬液即获得脾淋巴细胞。
计数接种培养。
台盼蓝染色计数, 活细胞数大于95 % 。
《从Ca2+通路研究紫草多糖促进小鼠淋巴细胞增殖的机制》
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14日龄健康鸡,无菌取脾脏,Hanks'液洗3 次,卡介苗注射器芯研磨,200 目筛网过滤,制成单细胞悬液,离心( 1000r/min) ,弃上清,Tris-NH4Cl 破解红细胞,冰水浴放置10min,离心( 1000 r /min) ,弃上清,Hanks'液洗3 次。
加入无酚红1640 培养液重悬细胞,计数,调整细胞浓度为1 × 106 cell /mL。
于96 孔细胞培养板培养。
《马尾藻多糖对鸡脾脏淋巴细胞增殖及氧化应激影响的实验观察》
1. 3 鼠脾淋巴细胞的制备小鼠脱颈处死, 于75% 酒精中浸泡5 min, 在超净工作台中无菌打开腹腔, 取出脾脏, 用含有高浓度青链霉素( 青霉素300 IU/ ml+ 链霉素300μg/ ml) 的PBS液洗涤2-3 次, 剥去脾脏周围结缔组织。
将处理好的脾脏移入一无菌青霉素瓶中, 加入适量的RPMI1640 完全培养液( RPMI1640+ 10%胎牛血清+ 青霉素100 IU/ ml+ 链霉素100 μg /ml) , 眼科剪剪碎, 400 目网筛过滤, 收集滤液并叠加于等体积的小鼠淋巴细胞分离液上, 2000 rpm 离心15 min。
用无菌吸管取灰白层, 加入适量RPMI1640 完全培养液后, 1 000 rpm 离心5 min、去上清液, 用适量RPMI 1640 完全培养液重悬细胞, 取微量重悬细胞液, 加等体积0.4%台盼蓝染色液, 染色2 min, 计数活细胞后, 用RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为2 ×106 /ml( 细胞活率95%以上) , 备用。
《苯对母鼠和子鼠脾淋巴细胞的增殖与凋亡影响》
2. 3. 2脾淋巴细胞增殖功能检测。
处死小鼠后,各取脾脏8 个, 轻轻研磨成匀浆, 200 目筛网过滤, 制备脾细胞悬液, 离心, 1500 rm10m in, 弃上清, 加入适量红细胞裂解液( 1m l悬液中加3m l), 螺旋震荡3m in, PBS洗2次, 含10%胎牛血清的RPMI- 1640 培养液重悬, 调整细胞密度为2×106 /ml 加入96 孔U型培养板中, 每孔100μl。
分别加入ConA ( 10μg /m l) 100μl 使其终浓度为5μg /ml 每个标本3个复孔, 5% CO2培养箱中培养64h, 培养结束前4h加入MTT( 5mg /ml) 20μl培养结束后离心1500 rm10m in, 小心吸去上清, 加入DMSO150μl 振荡10m in, 酶标仪550nm 检测各孔吸光度(OD值)。
《复方阿胶浆对移植性肺癌小鼠脾、胸腺重量指数与脾淋巴细胞增殖影响》
1. 2. 2 淋巴细胞悬液制备分离小鼠的派氏结( Peyer S patches, PPs) , 肠系膜淋巴结( mesenteric
lymph nodes, MLNs) , 脾脏( Spleen, SP) , 分别置于3 个盛有预冷PBS的无菌培养皿中, 用研磨棒加适度力度轻轻研磨, 于200 目筛网过滤, 收集细胞, 制备单细胞悬液, 以冷PBS 洗涤细胞两次( 1 200 r/ min, 5 分钟) , 脾细胞以低渗法裂解红细胞, 细胞计数, 将细胞稀释到1×107cells/ ml。
《茯苓多糖对免疫抑制小鼠粘膜淋巴组织及脾脏中CD3+ 和CD19+ 细胞变化的影响》
1.4.3 小鼠脾淋巴细胞增殖的测定小鼠颈椎脱臼处死,无菌取出脾脏,置盛有适量无菌Hank′s 液的小平皿中,用眼科剪轻轻将脾脏剪碎,经200 目筛网碾碎过滤,制成单细胞悬液,用Hank's 液洗3 次,每次离心10 min(1 000 r/min),去上清后加入预冷的0.83%Tris-NH4Cl 裂解红细胞1 min,再用1640 培养液洗涤2-3 次,然后将细胞悬浮于2 mL 完全培养液中,用台盼蓝染色计数活细胞数,调整细胞浓度为1.0×106 个/mL。
将细胞悬液分别加入96 孔培养板中,每孔100 μL,每组重复3 孔(见表2),各补加完全培养基至200 μL。
置5%CO2培养箱37 ℃培养72 h,培养结束前4 h,弃去上清液,加入100 μL 不含胎牛血清的RPMI1640 培养液,同时加入MTT(5 mg/mL)10 μL/孔,继续培养4 h。
培养结束后,弃上清,每孔加入100 μL DMSO,吹打混匀,使结晶完全溶解。
然后用酶联免疫检测仪,以570 nm 波长检测、630 nm 波长参考,测定光密度值用OD 表示。
1.5 数据分析采用SPSS13. 0 统计软件进行分析,结果以平均数。
《不同组分、不同纯度中药复方多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖影响》。