六味地黄丸的血清药物化学研究_王喜军
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第十一章天然药物的研究开发页数:27
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中药血清药物化学的研究动态及发展趋势_王喜军
综述中药血清药物化学的研究动态及发展趋势王喜军(黑龙江中医药大学药学院,黑龙江哈尔滨150040)[摘要] 中药血清药物化学作为一门新兴的应用学科,近年来在中药及复方的研究领域方兴未艾。
作者回顾了中药血清药物化学产生的历史背景、概念的提出及独立理论体系形成的整个演变过程;总结了中药血清药物化学的成功实践经验;在此基础上提出了中药血清药物化学的未来发展方向、目标及具体方案;预见,中药血清药物化学必将被更加广泛地应用到中医药研究的的各个领域,并与其他相关学科相互融合,不断地发展壮大,最终成为推动中医现代化进程的主要学科。
[关键词] 中药血清药物化学;药效物质基础;中药现代化;药物代谢[中图分类号]R 285 5 [文献标识码]A [文章编号]1001 5302(2006)10 0789 05[收稿日期] 2005 08 12[通讯作者] 王喜军,Tel:(0451)82110818,E mail:wxj @hljuc m net中药及复方研究的基本困难在于药效物质基础不明,因此对于其作用机制、生物转化和代谢过程等系列研究也就成了无的放矢;药效物质基础不明确直接造成中药不能建立与国际接轨的质量标准,缺乏可靠的药理学、毒理学研究数据,导致我国中药出口率低、市场竞争力薄弱,已成为严重制约中药发展的 瓶颈[1]。
传统的研究方法利用色谱、光谱等技术,寻找中药中的化学成分,研究其结构、性质、组成,从而揭示中药作用物质基础,在中药的现代研究中取得了很多卓越的成就。
但大多所谓 活性成分研究 ,多半只是将分离得到的化合物在测定结构之后,再进行活性筛选,收效甚微,很少有人采用活性指导下的导向分离方法,因此那些含量甚微又难于分离的活性成分在分离途中可能丢失,且丢失了也难于察觉。
中药复方是中医防病治病的主要手段,但所含成分极为复杂,活性成分的研究很少有人涉足,甚至不想涉足,或是能力有限,生物体内环境(如p H 值、肠内菌丛、酶等)对中药复方制剂成分的影响也常被忽视。
六味地黄丸质量状况的抽样实验调查的开题报告
xxx大学毕业论文（设计）开题报告毕业论文（设计）题目六味地黄丸质量状况的抽样实验调查选题类型课题来源学院专业指导教师职称姓名年级09级学号研究课题的目的：1.了解五个厂家六味地黄丸的质量状况2.测定六味地黄丸中马钱苷和丹皮酚的含量3.测定六味地黄丸中马钱苷和丹皮酚的溶出度4.测定丸剂的重量差异和溶散时限5.分析五个厂家六味地黄丸的质量状况6.分析造成五个厂家六味地黄丸质量差异的原因选题的依据和意义：六味地黄丸是补肾名方，它源于宋代医学家钱乙的《小儿药证直诀》，是滋补肾阴的基础方剂，配伍组方上具有“三补三泻”的特点。
因由六位中药材组成，其中熟地黄为君药，再加山茱萸（制）、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓五味药，故名为六味地黄丸。
六味地黄丸现在已经成为中成药中运用最频繁的药,年轻人追求补肾会选用它,中年男性人更是把它当作补肾壮阳的保健品长年服用,甚至于现在很多女性认为它有美容养颜的作用也是大量使用,，而且价格便宜，深受广大群众的欢迎，为人们所熟知而常用的中成药。
有滋阴补肾之功效，用于肾阴亏损，头晕耳鸣，腰膝酸软，骨蒸潮热，盗汗遗精，消渴[1]。
还有一些现代临床研究表明六味地黄丸对治疗汤料减少血糖有效率高[2],对小儿呼吸道感染的主要症状的减少和免疫功能的恢复有很好的作用[3] ,慢性咽炎患者服用后声音嘶哑、语声低沉不扬症状基本消失[4] ,对治疗黄褐斑（属肾阴虚者）有效率达95%[5] ,更有主治慢性肾炎、高血压、肺结核肾结核、甲状腺功能亢进、中心性视网膜炎、更年期综合症以及肾阴不足之效[6]。
拥有如此多的功效能为人们带来巨大的利益的六味地黄丸的市场一路走强，产销量一路飙升。
从大城市到小城镇及广大农村，从发达的沿海到中西部地区，各种品牌的六味地黄丸在全国攻城掠地，势不可挡，全国生产该品种的厂家有100多家[7] , 越是如此深受人们欢迎的产品我们就越是要保证它的质量，要让产家生产出更加优质的产品。
它的制法主要是按照国家药品标准来制的为了让大家能用到真实品质，服用到更加优质的六味地黄丸，为了给大家带来跟多的利益，本文通过对不同生产厂家生产的六味地黄丸进行比较来阐述六味地黄丸的差异问题，反应厂家对该药品的质量标准的控制[8]，真实的呈现药品的质量，进而探究提高它的质量的措施，更好的完善药品标准，指导企业生产出更加优质的产品。
六味地黄丸的精细指纹图谱分析及模式识别分类研究
六味地黄丸的精细指纹图谱分析及模式识别分类研究张洁1 段继诚1 梁振1 张维冰1 张丽华1 霍玉书2 张玉奎*11(中国科学院大连化学物理研究所,国家色谱研究分析中心,大连116023)2(德克萨斯大学健康科学中心,圣安东尼奥78229-3900)摘 要 采用高效液相色谱建立了六味地黄丸的指纹图谱,对两个厂家的16批产品进行了测定,并结合中药相似度软件和主成分分析法对全指纹图谱和其精细指纹图谱进行了模式识别研究。
结果表明,中药相似度软件能够对不同厂家的产品进行区分但也可能造成误判;在主成分分析法的投影图中,两个厂家的产品明显聚为两类,而且不同批次产品的差异也能够显示出来。
关键词 六味地黄丸,指纹图谱,高效液相色谱,模式识别2005-12-30收稿;2006-04-29接受本文系中国科学院知识创新工程重要方向性项目(No .KGCX2-S W-213)资助1 引 言六味地黄丸在中药中占有很重要的地位。
目前,市场有很多厂家生产的六味地黄丸质量良莠不齐。
2000版中国药典规定检测牡丹皮中的丹皮酚和山茱萸中熊果酸含量作为质量控制标准。
但是六味地黄丸的成分十分复杂,仅测定其中的两种成分很难真实客观地反映其内在质量的优劣。
中药指纹图谱作为中药产品质量控制的有效手段,已得到了广泛应用[1~3]。
孙毓庆等[4]将高效液相色谱-电喷雾质谱法用于六味地黄丸的分析,能够同时测定9种成分,比传统方法更为准确可靠。
王喜军等[5]建立了六味地黄丸的指纹图谱,并通过与单味药图谱的比较确定了各共有峰的归属。
本研究在优化条件下建立了六味地黄丸的反相高效液相色谱指纹图谱。
选取保留时间40~80m in 的谱图研究其精细结构,确定了22个特征指纹峰证明了不同厂家与工艺所生产的六味地黄丸之间的差异。
2 实验部分2.1 仪器和试剂Jasco 高效液相色谱系统(日本Jasco 公司),包括PU-2089pl u s 低压四元梯度泵、AS -2055p l u s 自动进样器、UV-2075plus 紫外检测器和Chro m pass 软件。
中药复方药效物质基础研究进展
中药血清药物化学推动了中药药动学的发展。中药药动
△江苏省中医药局 2007～2008 年度科研项目（HL07057） ＊ 硕 士 研 究 生 。 研 究 方 向 ：药 剂 学 。 E- mail：pengmiaomiao1984@ # 通讯作者：主任药师，硕士研究生导师。研究方向：临床药学。 电话：025- 83304616- 66660。E- mail：njglfy@
1995 年，Beigi F 等[5]首次采用凝胶作为载体、利用固定化 的 脂 质 体 作 为 固 定 相 ，模 拟 小 肠 上 皮 细 胞 对 药 物 的 吸 收 过 程。随后，国内的毛希琴等[6]对这一方法进行了改进，建立以 涂敷磷脂的硅胶作为模拟生物膜的固定相，用于预测药物的 小肠吸收，并且将该技术成功应用于单味中药的研究。齐炼 文等[7]将脂质体作为模拟生物膜，采用平衡透析与液相色谱联 用技术，建立了一种研究中药成分与模拟生物膜之间相互作 用的新方法。该方法可用于预测药物在体内的吸收情况，进 而研究中草药及复方的药效物质基础。毛希琴等 采 [8] 用涂敷 磷脂的硅胶为模拟生物膜色谱固定相，与传统的凝胶载体相 比固定相的机械强度及磷脂固载能力均有较大提高，且有较 好的稳定性，用 3 种缓冲条件模拟小肠吸收的缓冲环境，同时 涂敷磷脂形成的脂环境能够较好的模拟细胞膜所起的作用， 使得用色谱模型预测药物小肠吸收的准确程度有了很大提 高。 1.3 Caco- 2 细胞技术
3 结语
中药复方十分复杂，使其药效物质基础的研究比较困难， 表现在：（1）中药复方的有效成分是一个复杂的多成分组合， 即多种成分共同发挥作用；（2）中药复方有效成分可能是中药 原药材中不存在的物质，在复方煎制过程中通过多种成分相 互作用产生，也可能是药物进入体内后，经过体内代谢产生 的；（3）有些有效成分可能是间接途径发挥作用，在脱离机体 整体后单独成分可能不能表现出应有的作用；（4）有些成分的 作用可能是我们目前尚未认识的，对这些成分，在研究中可能 被忽视。因此，中药复方物质基础的研究要从传统的思路和 方法中走出，不断引入新的理论、思路、方法和技术。现在很 多相关学科的研究成果被应用到此领域中来，将中药复方多 成分、多靶点、多途径的作用特点与基因、蛋白表达关联起来 进行高通量筛选。血清药理学与血清药物化学、药动学、生物 膜色谱、指纹图谱、生物芯片、高通量筛选等技术整合到中药 复方的研究中，具有广阔的发展前景。这些方法和技术的综 合运用，可能会在中药复方效应物质基础研究方面取得重大 突破，从而对阐明与发展中医药理论，阐释复方制剂化学成分 变化规律产生深远影响；并为创制现代新型中药、提高中药质
△江苏省中医药局 2007～2008 年度科研项目（HL07057） ＊ 硕 士 研 究 生 。 研 究 方 向 ：药 剂 学 。 E- mail：pengmiaomiao1984@ # 通讯作者：主任药师，硕士研究生导师。研究方向：临床药学。 电话：025- 83304616- 66660。E- mail：njglfy@
1995 年，Beigi F 等[5]首次采用凝胶作为载体、利用固定化 的 脂 质 体 作 为 固 定 相 ，模 拟 小 肠 上 皮 细 胞 对 药 物 的 吸 收 过 程。随后，国内的毛希琴等[6]对这一方法进行了改进，建立以 涂敷磷脂的硅胶作为模拟生物膜的固定相，用于预测药物的 小肠吸收，并且将该技术成功应用于单味中药的研究。齐炼 文等[7]将脂质体作为模拟生物膜，采用平衡透析与液相色谱联 用技术，建立了一种研究中药成分与模拟生物膜之间相互作 用的新方法。该方法可用于预测药物在体内的吸收情况，进 而研究中草药及复方的药效物质基础。毛希琴等 采 [8] 用涂敷 磷脂的硅胶为模拟生物膜色谱固定相，与传统的凝胶载体相 比固定相的机械强度及磷脂固载能力均有较大提高，且有较 好的稳定性，用 3 种缓冲条件模拟小肠吸收的缓冲环境，同时 涂敷磷脂形成的脂环境能够较好的模拟细胞膜所起的作用， 使得用色谱模型预测药物小肠吸收的准确程度有了很大提 高。 1.3 Caco- 2 细胞技术
3 结语
中药复方十分复杂，使其药效物质基础的研究比较困难， 表现在：（1）中药复方的有效成分是一个复杂的多成分组合， 即多种成分共同发挥作用；（2）中药复方有效成分可能是中药 原药材中不存在的物质，在复方煎制过程中通过多种成分相 互作用产生，也可能是药物进入体内后，经过体内代谢产生 的；（3）有些有效成分可能是间接途径发挥作用，在脱离机体 整体后单独成分可能不能表现出应有的作用；（4）有些成分的 作用可能是我们目前尚未认识的，对这些成分，在研究中可能 被忽视。因此，中药复方物质基础的研究要从传统的思路和 方法中走出，不断引入新的理论、思路、方法和技术。现在很 多相关学科的研究成果被应用到此领域中来，将中药复方多 成分、多靶点、多途径的作用特点与基因、蛋白表达关联起来 进行高通量筛选。血清药理学与血清药物化学、药动学、生物 膜色谱、指纹图谱、生物芯片、高通量筛选等技术整合到中药 复方的研究中，具有广阔的发展前景。这些方法和技术的综 合运用，可能会在中药复方效应物质基础研究方面取得重大 突破，从而对阐明与发展中医药理论，阐释复方制剂化学成分 变化规律产生深远影响；并为创制现代新型中药、提高中药质
六味地黄丸4种入血成分组合对大鼠前脂肪细胞增殖_分化影响的最佳浓度配伍研究
and Bax p r oteins are increased in neocortical but not in thala m ic apop t osis f oll owing devascularizing lesi on of the cerebral cortex in the rat:an i m munohist oche m ical study [J ]1B rain Res 1,2004,15(1):13321491[7]Yang J,L iu X,Bhalla K,et al 1Preventi on of apop t osis bybcl 22:release of cyt ochr ome C fr om m it ochondria bl ocked [J ]1Science ,1997,275(5303):1129211321[8]N i w a M ,Hara A,I w ai T 1Cas pase activati on as an apop t oticevidence in the gerbil hi ppoca mpal CA1pyram idal cells foll owing transient f orebrain ische m ia[J ]1N eurosci 1L ett 1,2001,300(2):10321061[9]Yi Chang,Cheng 2Ying H sieh,Zi 2Aa Peng,et al 1Neur op r o 2tective mechanis m s of puerarin in m iddle cerebral artery occlusi on 2induced brain infarcti on in rats[J ]1Journal of B io m edical Science ,2009,16:91[10]Lee SH,Ki m M ,Yoon B W ,et al 1Targeted HSP70disrup 2ti on increases infarcti on volu me after focal cerebral ische 2m ia in m ice[J ]1S toke ,2001,32(12):2905229131[11]Tsuchiya D,Hong S,Matsu mori Y,et al 1Overexp resi on ofRat Heat Shock Pr otein 70Reduces Neur onal I njury after Transient Focal Ische m ia,Transient Gl obal Ische m ia,or kainic acid 2induced seizures[J ]1N eurosurgery,2003,53(5):1179211881收稿日期:2009210222基金项目:湖南省科技厅资助项目(2008FJ3011);湖南省科技厅资助项目(2010FJ4091);湖南省中医药科研基金(2008099)作者简介:戴冰(19642),女,教授,博士,主要从事中药临床药理科研;Tel:0731285600467,E 2mail:db0223@1631com 。
六味地黄丸血中移行成分的含量测定
中药化学成分的多样性与复杂性是其发挥疗效的 物质基础，也是质量评价的难点与重点，缺少与国际 接轨的质量标准已经成为制约中药发展的“瓶颈”。 目前，多数中药或 < 及 > 复方仍然是以测定一个或几个 体外成分的含量为质量控制指标，所测定的成分多为 主要药物的主要成分，但并不能证明其为中药口服后 能够入血的活性成分。 中药血清药物化学是以传统药物化学方法为基 础，多种现代技术综合应用，直接从中药口服后血中 移行成分入手，通过药效相关性研究，确定中药药效 物质基础的应用学科。它已经成为中药有效成分研究 及质量标准制定的重要手段 ‘ ! a 。 六味地黄丸是中医“滋补肾阴”的经典代表名 方，由宋・钱乙在《小儿药证直诀》中首创，现广泛
・质量分析研究・
六味地黄丸血中移行成分的含量测定
张 宁，王喜军 < 黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨 !’%%#%） 对六味地黄丸的 $ 种原型血中移行成分进行含量测定。方法 采用 CD & EDFG 法建立了六味地黄丸体
摘要：目的
外指纹图谱及大鼠血清色谱指纹图谱，在此基础上通过标准品对照法确认六味地黄丸的原型血中移行成分并对其进 行含量测定。结果 供了科学依据。 关键词：六味地黄丸；指纹图谱；血中移行成分；马钱素；丹皮酚 中图分类号：C$:#6 ! 文献标识码： J 文章编号：!%%; & (":; < $%%# > %; & %!"# & %; 确认丹皮酚和马钱素为六味地黄丸原型血中移行成分，测定丹皮酚含量为 %6 (; H %6 %! *1 I 1， 该方法以六味地黄丸入血成分的含量为指标，为更好地控制其内在质量提 马钱素含量为 %6 ;" H %6 %! *1 I 1。结论
年版中国药典中明确规定六味地黄丸只以丹皮酚和熊果酸的含量作为质量控制指标虽然此方法简单易行但缺乏客观性能否有效地控制其内在质量尚有待商榷本文应用中药血清药物化学的方法来阐明六味地黄丸的入血成分试图以入血成分的含量为指标来控制六味地黄丸的质量
中药药效物质基础研究的系统方法学_中医方证代谢组学_王喜军
刘昌孝等一批学者在此方面也进行了相2431在此方面王喜军于20世纪90年代初开展了从口服方剂后的含药血清中分析鉴定方剂体内直接作用物质的系统研究工作完成了茵陈蒿汤六味地黄丸等11个方剂的体内成分的系统研究3243proteomics47hepatology48analchem49jproteomeres50jproteomics51plosone52analyst53等sci源杂相关的研究工作形成了在有效性志发表相关论文80的前提下通过一体化研究利用中药血清药物化学方法确定方剂的体内直接作用物质并将体内的外源性药物成分与从而在血清化学组分和代谢内源性证候或病标记物相关联标记物量变的相关性上发现中药的体内药效物质基础的研究方法和技术参考文献1nickavarbabolhasanilbioactivityguidedseparationofanj
doi： 10． 4268 / cjcmm20150103
［收稿日期］ 2014-12-02 ［基金项目］ 国家自然科学基金重点项目（ 81470093） ［通信作者］ 王喜军，教授，Tel： （ 0451） 82110818，E-mail： xijunw@ sina． com
13
2015 年 1 月 第 40 卷第 1 期
其次，就具体方 法 而 言，经 典 的 植 物 化 学 分 步 提 取 药 效 追踪分离的方法，从中药中成功获得了一批活性成分，诸如 抗疟新药青蒿素［12］、治疗老年痴呆病的石杉碱甲［13］、治疗心 脑血管病的川芎嗪［14］ 等。然而，受收率及活性测试方法的 限制，许多成分停留在结构鉴定水平。此后的生物活性导向 分离（ bioactivity guided isolation） 方法，加速了活性成分的发 现［15-16］，但是此方法是一条以发现新化合物和活性成分为主 要目的的研究模式，在中药药效物质基础的最低层面（ 活性 成分） 上进行研究，一味地去研究中药中到底含有什么成分， 什么成分能在体外药理实验中显示活性，往往使研究走入唯 单一成分论的误区。此方法不仅费时费力，而且不能反映成 分的体内生物转化（ 机体对药物的作用） ，更不能反映方剂中 药物之间在吸收、分布等方面的相互作用。伴随着研究的深 入及技术的进步，众多学者已认识到如此所确定的活性成分 不能称其为中药的药效物质基础，达成了nuary，2015
doi： 10． 4268 / cjcmm20150103
［收稿日期］ 2014-12-02 ［基金项目］ 国家自然科学基金重点项目（ 81470093） ［通信作者］ 王喜军，教授，Tel： （ 0451） 82110818，E-mail： xijunw@ sina． com
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2015 年 1 月 第 40 卷第 1 期
其次，就具体方 法 而 言，经 典 的 植 物 化 学 分 步 提 取 药 效 追踪分离的方法，从中药中成功获得了一批活性成分，诸如 抗疟新药青蒿素［12］、治疗老年痴呆病的石杉碱甲［13］、治疗心 脑血管病的川芎嗪［14］ 等。然而，受收率及活性测试方法的 限制，许多成分停留在结构鉴定水平。此后的生物活性导向 分离（ bioactivity guided isolation） 方法，加速了活性成分的发 现［15-16］，但是此方法是一条以发现新化合物和活性成分为主 要目的的研究模式，在中药药效物质基础的最低层面（ 活性 成分） 上进行研究，一味地去研究中药中到底含有什么成分， 什么成分能在体外药理实验中显示活性，往往使研究走入唯 单一成分论的误区。此方法不仅费时费力，而且不能反映成 分的体内生物转化（ 机体对药物的作用） ，更不能反映方剂中 药物之间在吸收、分布等方面的相互作用。伴随着研究的深 入及技术的进步，众多学者已认识到如此所确定的活性成分 不能称其为中药的药效物质基础，达成了nuary，2015
六味地黄丸血中移行成分的分离及结构鉴定
六味地黄丸血中移行成分的分离及结构鉴定王喜军;孙文军;张宁;孙晖;耿放;朴成玉【期刊名称】《中国天然药物》【年(卷),期】2007(005)004【摘要】目的:在前期六味地黄丸血清药物化学初步研究的基础上分离并鉴定六味地黄丸血中移行成分.方法:以血清色谱指纹图为指导,采用大孔吸附树脂柱色谱、硅胶柱色谱及RP-C18柱制备色谱进行分离纯化,根据波谱数据进行结构鉴定.结果:对11种六味地黄丸血中移行成分进行分离和结构鉴定,共分离得到了8个化合物,分别鉴定为5-羟甲基-2-糠酸(A)、莫诺苷(B)、獐牙菜苷(C)、马钱子苷(D)、2-羟基-苯乙酮-4-葡萄糖醛酸苷(E)、4-甲氧基-5-磺酸基苯乙酮-2-葡萄糖醛酸苷(F)、2,4-二羟基-苯乙酮(G)、(H)2,5-二羟基-4-甲氧基苯乙酮.其中5-羟甲基-2-糠酸(A)为熟地、山茱萸和泽泻中的成分代谢形成;莫诺苷(B)、獐牙菜苷(C)、马钱子苷(D)为山茱萸所含成分直接入血而形成;2-羟基-苯乙酮-4-葡萄糖醛酸苷(E)、4-甲氧基-5-磺酸基苯乙酮-2-葡萄糖醛酸苷(F)、2,4-二羟基-苯乙酮(G)、(H)2,5-二羟基-4-甲氧基苯乙酮为丹皮酚的代谢产物.结论: 将血清药物化学方法引入到化合物的分离制备领域中,成功地分离鉴定了六味地黄丸的体内直接作用物质.【总页数】4页(P277-280)【作者】王喜军;孙文军;张宁;孙晖;耿放;朴成玉【作者单位】黑龙江中医药大学药学院,哈尔滨,150040;黑龙江中医药大学药学院,哈尔滨,150040;黑龙江中医药大学药学院,哈尔滨,150040;黑龙江中医药大学药学院,哈尔滨,150040;黑龙江中医药大学药学院,哈尔滨,150040;黑龙江中医药大学药学院,哈尔滨,150040【正文语种】中文【中图分类】R917;R284.1【相关文献】1.六味地黄丸血中移行成分对氢化可的松致大鼠肾虚动物模型的保护作用 [J], 王喜军;张宁;孙晖;李丽静;吕海涛2.苦碟子化学成分的研究——Ⅰ、扩冠有效成分的分离和结构鉴定 [J], 孟宪贞;倪素芳;索鸿勋3.六味地黄丸血中移行成分的含量测定 [J], 张宁;王喜军4.六味地黄丸及其类方血中移行成分的比较研究 [J], 王喜军;张宁;孙晖5.六味地黄丸主要血中移行成分对培养大鼠成骨细胞促增殖作用的研究 [J], 孙晖;张宁;李丽静;王喜军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基于整合药理学平台的六味地黄丸治疗糖尿病的分子机制研究
第15卷第1期复杂系统与复杂性科学V〇1.15N$l2018 年3月C O M P LE XS Y S TE M S A N D C O M P LE XITY S C IE N C E Mar. 2018文章编号：1672 - 3813(2018)01 - 0024 - 07 ;!O I: 10. 13306&. 1672-3813. 2018. 01. 004基于整合药理学平台的六味地黄丸治疗糖尿病的分子机制研究张佳琪、唐仕欢2，李德凤2，张毅2，苏瑾2,刘杨、张艾嘉、王萍1!，王喜军1(1.黑龙江中医药大学国家中医方证代谢组学研究中心，哈尔滨150040$.中国中医科学院中药研究所，北京100700)摘要：为探究六味地黄丸治疗糖尿病的潜在活性成分和作用机制，借助整合药理学平台对其药物靶标、基因功能和通路富集分析，运用整合药理学思维对六味地黄丸治疗糖尿病的分子机制进行研究。
研究发现，多种代谢通路及成分靶点如PRKCB、G A A、G C K等与糖尿病相关联。
推测六味地黄丸可通过调节氨基酸代谢、能量代谢及糖脂代谢等多种代谢紊乱来达到对糖尿病的治疗作用。
关键词：六味地黄丸；糖尿病；整合药理学；分子机制中图分类号：R96 文献标识码：AOn the Molecular Mechanism of Liuweidihuang Pillsin theTreatment of Diabetes Based on Integrated PharmacologyZHANG Jiaqi1,TANG Shihuan2,LI Defeng2,ZHANG Yi2,SU Jin2,LIU Yang1,ZHANG Aijia1,WANG Ping1" ,WANG Xijun1(1. Chinmedomics Research Center of State Administration of TCM, Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040 , China；2. Institute of Chinese MateriaMedica , China Academy of Chinese Medical Sciences , Beijing 100700 , China) Abstract：To Explore the potential active ingredients and mechanism of action of LiuweidihuangPills in the t reatment of diabetesmellitus,with the help of integrated pharmacology platform forthe analysis of drug targets,gene function and pathway enrichment.Then,the molecular mechanism of LiuweiDihuang Pill for the treatment of diabetes mellitus was studied by using integratedpharmacology thinking.The results showed that many metabolic pathways and components ofthe targets such as PRKCB,GAA,GCK were associated with diabetes mellitus.It has been speculated that Liuweidihuang Pills could regulate amino acid metabolism,energy metabolism andglucose metabolism and other m etabolic disorders to achieve the therapeutic effect of diabetesmellitus.Key words：Liuweidihuang Pills；diabetes mellitus；Integrated Pharmacology；molecular mechanism 六味地黄方最早出自宋代钱乙所著的《小儿药证直诀》一书，由熟地黄、山茱萸、山药、牡丹皮、茯苓、泽泻〇味药组成[1]"肾的中医 方。
地黄化学成分血清药物化学的初步研究
洗脱 ， Ｌ Ｔ Ｃ检测 ， 行分 段 收集 。分别 把 含有 梓 进 醇、 地黄 苷 Ｄ 的 洗 脱 液 合 并 。分 别 回 收溶 剂 ， 压 减 浓 缩至 干 ， 经 葡聚 糖凝 胶柱 纯化 ， 再 即得 梓 醇及 地 黄
苷 Ｄ提 取物 ， Ｈ Ｌ 经 Ｐ Ｃ归 一化 法测 得纯 度达 ８ ％ 。 ５
肝 细 胞 变 性 坏 死 ， 而 引起 纤 维 增 生 。 肝 细 胞 受 到 破 从
参考文献 ：
［ ］ ａ ｉｅｕＴ Ｄ ｓ ｕｉｒ Ａ，ＢｏｌｃＳｇ ， ｔ １ １ Ｌ ｍｎ ａ ， ｅｍｏｌ ｅ ￣ ｉ ａ．ａｅＰ ｅ ａ ｕ ．Ｍｅｈ ｃ— ａｉ ｓｏ ｈｐ ｔ ｉｒｇｎｓ ［ ］ Ａ ｃ ｅｉｒ ０ ２ ９ ｎ ｍ ｆ ｅａｃ ｆ ｏｅｅｉ Ｊ ． ｒｈ Ｐｄａ ，２０ ， ｓ ｉ ｂ ｓ ｔ
２２ ． 对 照 品 溶 液 的 制 备
¨ 一
图 ２ 梓 醇给药血清 Ｈ Ｌ ＰＣ
ＡＵ
精 密称 取梓 醇对 照 品适 量 ， １ 置 ０ｍＬ容量 瓶 中 ， 加 入 流 动 相 制 成 浓 度 为 ０ １０ ｍ ／ ． ９ ｇ ｍＬ的 溶 液 ， 用 ０ ４ ｍ 微 孔 滤 膜 滤 过 ， 得 梓 醇 的 对 照 品 溶 液 。 ．５ 即
品检定所 提供 ， 批号 ０ ０ ９ ０ ； 黄苷 Ｄ对 照 品 ， ８ ８— ８ ３ 地
为鲜 地黄 、 生地 黄 、 熟地 黄 。鲜地 黄性寒 ， 清热 生津 ， 凉血 止血 ； 生地 黄性寒 ， 清热 凉血 ， 养阴生 津 ； 熟地 黄 性温 ， 阴补血 ， 滋 益精 填 髓 。地 黄作 为 著名 的“ 四大 怀药 ” 一 ， 活 性 作 用 十 分 广 泛 ， 增 强 免 疫 功 之 其 有 能…、 止血作 用 ］ 降 血 糖 作 用 等 。中 药 含 有 的 、 化 学 成 分 ， 有 进 入 血 液 方 有 可 能 成 为 有 效 成 只 分 。本 实验 采用 了血 清 药物 化 学 的方 法 ， 步 确 初
苷 Ｄ提 取物 ， Ｈ Ｌ 经 Ｐ Ｃ归 一化 法测 得纯 度达 ８ ％ 。 ５
肝 细 胞 变 性 坏 死 ， 而 引起 纤 维 增 生 。 肝 细 胞 受 到 破 从
参考文献 ：
［ ］ ａ ｉｅｕＴ Ｄ ｓ ｕｉｒ Ａ，ＢｏｌｃＳｇ ， ｔ １ １ Ｌ ｍｎ ａ ， ｅｍｏｌ ｅ ￣ ｉ ａ．ａｅＰ ｅ ａ ｕ ．Ｍｅｈ ｃ— ａｉ ｓｏ ｈｐ ｔ ｉｒｇｎｓ ［ ］ Ａ ｃ ｅｉｒ ０ ２ ９ ｎ ｍ ｆ ｅａｃ ｆ ｏｅｅｉ Ｊ ． ｒｈ Ｐｄａ ，２０ ， ｓ ｉ ｂ ｓ ｔ
２２ ． 对 照 品 溶 液 的 制 备
¨ 一
图 ２ 梓 醇给药血清 Ｈ Ｌ ＰＣ
ＡＵ
精 密称 取梓 醇对 照 品适 量 ， １ 置 ０ｍＬ容量 瓶 中 ， 加 入 流 动 相 制 成 浓 度 为 ０ １０ ｍ ／ ． ９ ｇ ｍＬ的 溶 液 ， 用 ０ ４ ｍ 微 孔 滤 膜 滤 过 ， 得 梓 醇 的 对 照 品 溶 液 。 ．５ 即
品检定所 提供 ， 批号 ０ ０ ９ ０ ； 黄苷 Ｄ对 照 品 ， ８ ８— ８ ３ 地
为鲜 地黄 、 生地 黄 、 熟地 黄 。鲜地 黄性寒 ， 清热 生津 ， 凉血 止血 ； 生地 黄性寒 ， 清热 凉血 ， 养阴生 津 ； 熟地 黄 性温 ， 阴补血 ， 滋 益精 填 髓 。地 黄作 为 著名 的“ 四大 怀药 ” 一 ， 活 性 作 用 十 分 广 泛 ， 增 强 免 疫 功 之 其 有 能…、 止血作 用 ］ 降 血 糖 作 用 等 。中 药 含 有 的 、 化 学 成 分 ， 有 进 入 血 液 方 有 可 能 成 为 有 效 成 只 分 。本 实验 采用 了血 清 药物 化 学 的方 法 ， 步 确 初
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收稿日期 2004 04 08基金项目 国家留学归国人员科研基金 获奖项目 2002年国家科技进步二等奖*通讯作者 王喜军:教授,博士生导师,黑龙江中医药大学副校长。
Tel:86 451 82110818,E mail:xijunw @sina com 六味地黄丸的血清药物化学研究王喜军1*,张 宁,孙 晖,孙文军黑龙江中医药大学药学院,哈尔滨150040摘 要 目的:对六味地黄丸的血清药物化学进行研究。
方法:建立六味地黄丸及口服六味地黄丸后大鼠血清的HPLC 指纹色谱分析方法;分析比较六味地黄丸、缺味处方、单味生药以及各组分给药后所得血清样品,鉴定口服六味地黄丸后大鼠血中移行成分、来源生药及其代谢产物。
结果:口服六味地黄丸后从血中发现了11个入血成分,其中4个为新产生的代谢产物;7个成分为六味地黄丸所含成分的原型,其中有一成分虽为地黄中所含成分的原型,但其它两种药材也能代谢产生,对其体内的量变有共同的贡献。
结论:血中移行成分及代谢产物将成为六味地黄丸的体内直接作用物质,其来源生药为六味地黄丸的主要药物,对其进行深入的研究,将有助于阐明六味地黄丸的有效成分及作用机理。
关键词 六味地黄丸;血清药物化学;代谢产物;指纹图谱中图分类号 R931.71,R917 文献标识码 A 文章编号 1672 3651(2004)04 0219 04中药血清药物化学是以传统药物化学方法为基础,综合应用多种现代技术,分析鉴定口服中药后血清中移行成分,研究其药效相关性,确定中药药效物质基础的应用学科[1]。
应用本方法已经成功地完成了茵陈蒿汤的生物药学研究,首次阐明了该复方的作用机理[2,3];进行了地黄血清药物化学的初步研究[4]。
本实验进行了六味地黄丸的血清药物化学研究。
六味地黄丸出自宋朝钱乙 小儿药证直诀 ,是 滋阴补肾 之首方,现临床上广泛用于多种疾病的治疗。
目前,对六味地黄丸的成分及药效研究较多,但有关的成分研究大多只限于成分的定性、定量的分析,针对药效物质基础的研究很少;有关药效的研究也多只集中在免疫调节作用方面。
六味地黄丸在体内以何种成分、何种形式发挥作用以及作用机理如何,至今少有明确的研究报道。
因此,有必要对六味地黄丸的血中移行成分进行详细的分析,阐明其血中移行成分、代谢产物及方剂的配伍意义,从而有的放矢地改善其生产工艺,提高制备水平,提高临床疗效。
1 实验材料1 1 仪 器Waters 高效液相色谱仪(Waters 600Controller,Waters 600Pump,Waters 996Photodiode Array Detec tor);Water Symmetry Shield C 18色谱柱(3 9mm 150mm,5 m);Nova Pak C 18Guard Pak 保护柱;80 2型离心机;H66MC 型超声震荡仪;sk 1型快速混匀器。
1 2 药品和试剂丹皮酚(Paeonol)对照品(中国生物制品药品检定所提供);马钱素(Loganin)对照品(南京中医药大学提供);熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻(均购于哈尔滨市人民药店,经鉴定为正品);乙腈,色谱级(美国迪马(Dikma)试剂公司);其余试剂为分析纯。
1 3 动 物健康Wistar 大鼠,体重为200 20g,6周龄,雌雄不限,黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
2 实验方法2 1 六味地黄丸供试品溶液的制备按药典六味地黄丸处方称取药材,采用2000年版药典方法分别制成六味地黄丸、缺味六味地黄丸及单味丸,各称取1g,用10ml 甲醇超声提取15min(2次),滤过,合并滤液,滤液干燥后加入甲醇定容为10ml,溶液过0 45 m微孔滤膜即得;另精密称取丹皮酚及马钱素对照品1mg,分别置于10ml容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度摇匀得丹皮酚及马钱素对照品溶液;上述各样品液供HPLC分析使用。
2 2 空白血清及含药血清样品的制备取Wistar大鼠,禁食12h(自由饮水),按照1 5ml/100g体重,分别灌胃给予蒸馏水、六味地黄丸、缺味六味地黄丸及单味丸的甲醇提取物的混悬液,给药60min后用1%戊巴妥钠麻醉,经肝门静脉取血5ml,血液在3000r/min条件下离心10min,取上清液1ml,加入0 2ml70%高氯酸,快速摇匀,3000r/min条件下离心10min,取上清液过0 45 m微孔滤膜,备HPLC分析。
2 3 HPLC分析色谱条件Water Symmetry Shield RP18色谱柱(3 9mm 150mm,5 m);Nova Pak C18Guard Pak保护柱;柱温30 ;流速为1ml/min;检测波长200~400nm 扫描;流动相乙腈 0 15%磷酸梯度洗脱:0/100 0~60min12/8860~130mi n30/70。
2 4 六味地黄丸及其血清中成分的分析取10批六味地黄丸供试品溶液,以及5批六味地黄丸血清样品在相同的色谱条件下进行HPLC分析,建立HPLC色谱图,并比较分析确定进入血液的成分。
并通过缺味六味地黄丸及单味丸及其血清样品的分析测定,对相应的色谱图进行比较分析,确定入血成分的来源药物。
3 结果与讨论3 1 六味地黄丸给药后血中出现了11个移行成分(图1),与体外样品比较,其中七个为体外成分直接吸收入血,即1、2、4、5、7、10、11号峰为六味地黄丸中所含的原型成分,且1号峰转运入血后的相对含量有较大的提高,而11号峰却明显下降;3、6、8及9号峰为新产生的代谢产物。
Fig1 Comparis on of the H PLC profile of Lui Wei Di Huang Wan and the serum of rats after oral administration of the drug (A) Detected at238nm;(B) Detected at276nma c ontrol serum;b s erum containing drug;c Lui Wei Di Huang Wan经与六味地黄丸、空白血清及单味生药比较分析确定入血成分的来源为:1号峰的归属较为复杂,来源于三种生药。
首先,熟地中含有此成分,此成分在六味地黄丸和熟地中含量均很低,但是吸收入血后此成分的相对含量大大提高,表明复方配伍后其有较强的血中转移能力(图2);其次,在除去熟地的样品给药后,血清中仍然出现1号峰,表明其他药材在体内对1号峰的产生也有贡献;山茱萸和泽泻中虽不含有此成分,但给药后血中也能产生该峰(图略),经光谱分析表明与六味地黄丸血清中的1号峰为同一成分,所以推测山茱萸和泽泻中所含的物质被代谢后共同产生该成分。
可见,复方中三种生药对血中同一成分1号峰有共同贡献,表明熟地配伍山茱萸和泽泻的必要性及复方配伍的科学性。
2、4、5、10号峰为山茱萸所含成分直接入血而形成,经与标准物质对照表明5号峰为来源于山茱萸的马钱素;7和11号峰为牡丹皮中所含成分直接入血而形成(图3),经与标准物质对照表明11号峰为来源于牡丹皮中的丹皮酚;3、6、8、9号峰为丹皮酚的代谢产物(图4,图5)。
所以,血清样品中丹皮酚峰较体外样品中明显下降。
丹皮酚被吸收入血后,其代谢产物量较大,具有产生药效的可能性,或许具有更强的生理活性。
从3、6、8、9号峰的保留时间和UV光谱推测可能为丹皮酚的脱甲氧基代谢物、葡萄糖醛酸或胆汁酸的结合体。
Fig2 Comparis on of the H PLC profile of the seru m of rats after oral administration of the Lui Wei Di Huang Wan,radix rehmannia glutinos a and Lui Wei Di Huang Wan without radix rehmannia glutinosa(Detected at238nm)a c ontrol s erum;b serum after admini stration of the Lui Wei DiHuang Wan;c serum after admini stration of the LuiWei DiHuang Wan without radix rehman nia glutinosa;d serum after admi nistrati on of radi x rehmannia gl utinosaFig3 Comparis on of the HPLC profile of the serum of rats after oral administration of the Lu i Wei Di Hu ang Wan,cortex mou tan and Lui Wei Di H uang Wan without cortex moutan(Detected at238nm)a c ontrol serum;b serum after admi nistration of the Lui Wei Di Huang Wan;c serum after admini stration of the Lui Wei Di Huang Wan w i thout cortex moutan;d serum after adminis trati on of cortex moutanFig4 Comparis on of the HPLC profile of the serum of rats after oral administration of the Lu i Wei Di Hu ang Wan,cortex mou tan and Lui Wei Di H uang Wan without cortex moutan(Detected at276nm)a c ontrol serum;b serum after admi nistration of the Lui Wei Di Huang Wan;c serum after admini stration of the Lui Wei Di Huang Wan w i thout cortex moutan;d serum after adminis trati on of cortex moutanFig5 Comparis on of the H PLC profile of Paeonol and the serum of rats after oral administration of Paeonol a c ontrol serum;b s erum af ter adminis tration of Paeonol;c paeonol3 2 本研究初步阐明了六味地黄丸的体内部分化学成分,其结果已能在某种程度上阐明该方配伍机制及药效物质基础。