_猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定与药敏试验

猪传染性胸膜肺炎的实验室诊断摘要:采用生化试验､间接血凝试验对送检的疑似猪传染性胸膜肺炎病猪的病料及血清进行诊断和药敏试验｡结果表明,从病猪肺脏中分离到1株疑似胸膜肺炎放线杆菌,其革兰氏染色为阴性球杆菌,在普通营养琼脂和麦康凯培养基上不能生长,在TSA平板上形成不透明的淡灰色､湿润､光滑､表面隆起的菌落,血凝试验为阳性,确定所分离菌为胸膜肺炎放线杆菌｡同时对该猪群随机抽检12份血样,用猪胸膜肺炎间接血凝试剂盒检测胸膜肺炎抗体,其阳性率为8.3%｡药敏试验表明,磺胺间甲氧嘧啶钠和长效痢清为敏感药物｡关键词:猪胸膜肺炎放线杆菌;细菌分离鉴定;血凝试验;药敏试验The Laboratory Diagnosis of Porcine Contagious PleuropneumoniaAbstract: The biochemistry test and indirect hemagglutination test were used to check the samples and serum of pigs suspected as porcine contagious pleuropneumonia (PCP) The results indicated that a suspected Actinobacillus pleuropneumoniae was isolated from the pig lung. It was Gram staining negative coccobacillus, and could not grow in ordinary nutrient agar and McConkey＇s agar. It could grow and form a opaque ocean grey, moist, smooth conoly with upheaval at surface in TSA plate; and the hemagglutination test was positive. It was confirmed that the isolated bacterium was Actinobacillus pleuropneumoniae. 12 blood samples were randomly selected and examined by PCP indirect hemagglutination assay kit. The results indicated that the positive ratio of PCP antibody was 8.3%. The result of susceptibility test indicated that sulfamonomethoxine sodium and long-acted Liqing were sensitive drugs.Key words: Actinobacillus pleuropneumoniae; isolation and identification of bacteria; hemagglutination test; susceptibility test猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种高度传染性的呼吸系统疾病｡该病以急性出血和慢性纤维素性胸膜肺炎为特征,具有较高的发病率和致死率[1]｡随着集约化养猪业的迅猛发展,国家及地区间引种频繁,导致该病的发病率及死亡率大大提高,耐药性问题导致的治疗失败,给世界各地的养猪业带来了极大的经济损失[2,3]｡本试验对河南省新乡市某猪场的发病猪病料进行了细菌分离鉴定､血清学检测及药敏试验,旨在为该病的诊断与治疗提供科学依据｡1材料与方法1.1材料1.1.1试剂麦康凯琼脂培养基､普通营养琼脂培养基､羊鲜血琼脂平板､巧克力琼脂平板､胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)､草酸铵结晶紫､革兰氏碘液､石碳酸复红染液由河南科技学院临床兽医学教研室提供;APP间接血凝抗原､标准阳性血清､标准阴性血清､稀释液由中国农业科学院兰州兽医研究所提供;金黄色葡萄球菌由河南科技学院预防兽医教研室提供;药敏试验所用药物均由河南科技学院兽医院提供｡1.1.2仪器HH.B11恒温培养箱(厦门建红医疗器械厂),75-2型微量振荡器(江苏金坛设备有限公司),OLYMPUS—CH显微镜(Japan),HG101-2A电热鼓风干燥箱(南京实验仪器厂)｡1.1.3病料河南新乡市某猪场送检的疑似病猪病料10份及病猪血清2份｡1.2方法1.2.1细菌的分离与培养对病死猪进行病理剖检,观察各个器官的病变｡无菌采取疑似PCP病变肺组织,在TSA培养基上接种培养,观察菌落生长情况,挑取可疑菌落涂片､革兰氏染色､镜检[4]｡1.2.2生化培养特性鉴定将分离到的可疑菌落,分别接种于加入0.01% NAD的羊鲜血琼脂平板､巧克力琼脂平板､麦康凯琼脂平板､普通营养琼脂平板,于37 ℃培养24 h,观察菌落在各个培养基的生长情况｡将可疑菌平行接种布满整个不含V 因子的普通营养琼脂培养基,再在其上垂直划线接种2条金黄色葡萄球菌,37 ℃培养24 h,观察卫星现象｡无菌状态下,用接种针取分离菌纯培养物,分别接种于加有0.01%NAD的生化反应管中,置于培养箱中37 ℃培养24 h,观察其生化特性｡1.2.3间接血凝试验12份抽检血清和被检血样的处理:将送检病猪的血样静置,析出血清,在使用前置于56 ℃水浴锅中灭能30 min,4 ℃保存待检｡APP间接血凝抗原的处理:用灭菌生理盐水10 mL稀释摇匀,1 500 r/min离心10 min,弃上清液,加等量的稀释液摇匀,置4 ℃冰箱24 h后使用｡将冻干标准阳性血清和标准阴性血清按试剂盒说明使用,混匀后作对照｡具体操作步骤参见文献[5]｡判定标准:“++++”表示100%血球凝集,红细胞全部凝集,形成一层均匀的膜,布满整个孔底;“+++”表示75%血球凝集,红细胞在孔底形成一层薄膜,但面积比前者小;“++”表示50%血球凝集,红细胞在孔底形成薄膜凝集,边缘松散或呈锯齿状;“+”表示25%血球凝集,红细胞在孔底呈稀薄散在少量凝集,孔底有小圆点;“-”表示不凝集,红细胞全部沉于孔底,边缘光滑｡以出现50%红细胞凝集的最高稀释倍数判定为该血清的凝集价(效价)[6]｡判定条件:在阳性对照血清滴度不低于1∶128,阴性对照孔血清除第一孔允许存在前滞现象(+)外,其余各孔及稀释液对照孔均为“-”的前提下,对待检血清进行判定,否则重试｡待检血清的判定标准:检测血清抗体效价≥1∶8判为阳性,效价≤1∶4为阴性｡1.2.4药敏试验将分离菌在巧克力琼脂平板上均匀划线接种,按常规纸片法将药敏纸片贴在平板上,置于恒温培养箱24 h,观察并测量抑菌圈的大小,判定不同药物的敏感程度｡判定标准:抑菌圈直径≥20 mm为高度敏感(+++),直径10~20 mm 为中度敏感(++),直径≤10 mm为低度敏感(+),无抑菌圈为不敏感(-)[7]｡2结果与分析2.1细菌的分离与培养在TSA平板上形成不透明､淡灰色､湿润､光滑､表面隆起的菌落,挑取单个可疑菌落镜检观察,有革兰氏染色呈阴性的小球杆菌｡病理剖检结果:剖检病猪可见其肺脏表面有纤维素性物质附着,并与胸壁和膈肌粘连,胸腔有黄色积液,心包外膜附着有纤维素性物质,心包积液,颌下淋巴结肿大,肝脏和肾脏未见异常｡2.2生化培养结果分离菌株在巧克力琼脂平板上37 ℃培养24 h后,形成湿润､浅灰色隆起､直径0.5~0.8 mm的圆形菌落;在麦康凯和普通营养琼脂平板上不生长;在羊鲜血琼脂平板上有溶血现象｡在靠近金黄色葡萄球菌的地方,可疑菌生长较多,远离划线处则生长较少,表明其对V因子有依赖性｡该菌能发酵葡萄糖､甘露糖､蔗糖､果糖,不能发酵甘露醇,尿素酶试验呈阳性,产生硫化氢气体,靛基质试验呈阴性｡综合以上试验结果,可确定该分离菌为胸膜肺炎放线杆菌｡2.3血清学诊断结果血清学诊断结果表明,被检病猪的血清抗体效价均大于1∶8,可确定为阳性｡抽检的12份猪血样中,血凝效价在1∶8以上的有1份,在1∶8以下的有11份,其阳性率为8.3%｡2.4药敏试验结果药敏试验结果见表1｡由表1可以看出,该菌对磺胺间甲氧嘧啶钠高敏,对长效痢清中敏,对强效头孢､头孢噻呋､青霉素钾､氨苄青霉素､氟苯尼考､阿莫西林等不敏感｡3讨论引起猪呼吸系统疾病的病原较多,有些胸膜肺炎病原还能激发或伴发其他疾病如巴氏杆菌､副猪嗜血杆菌､猪放线杆菌的感染[5]｡该病的临床症状缺乏特征性,仅靠纤维素性胸膜炎､胸肺粘连等病变不能准确诊断,PCP病例并不一定都表现为纤维素性胸膜肺炎,有的表现为肺部充血､水肿[8]｡因此对猪传染性胸膜肺炎的确诊必须依靠恰当的实验室诊断技术｡APP在生长过程中对营养及环境要求较高｡TSA培养基营养丰富,对于嗜血菌的培养率非常高,现引入到APP的分离培养中,效果很好｡同时,因该菌与其他杂菌混合感染的时候,细菌的分离更加困难,建议选取未经用药的病猪或濒死猪进行分离,其分离率较高,分离时应严格无菌操作,防止杂菌的污染｡本试验采用血凝试剂盒进行检测,结果病死猪的PCP抗体效价均在1∶8以上,该猪群未进行过免疫,说明该猪群感染了APP｡加上各地流行病株的血清型各有差异,没有通用疫苗进行免疫,目前多数猪场仍以药物控制作为预防和治疗的主要手段,但APP易产生耐药性,且部分敏感猪在感染后短时间内发生不可逆转的肺组织病变,因此猪场兽医应对APP的感染情况有充分的认识,必要时可定期分离病原进行体外药敏试验,以便早期进行预防[9]｡参考文献:[1] 吴家强,崔锦鹏, 张秀美, 等. 猪接触传染性胸膜肺炎研究进展[J]. 畜牧与兽医,2002,34(10):36-39.[2] 张立昌.猪传染性胸膜肺炎研究进展[J]. 养猪,2001(1):40-42.[3] 陈海平,蔡金洲,张辉,等. 猪嗜血杆菌胸膜肺炎的流行和防制[J].养猪,1995(1):34.[4] 陈小玲,杨旭夫,朱士盛.猪传染性胸膜肺炎的流行现状和防制措施[J].中国兽医杂志,2001,37(7):33-35.[5] 姚火春.兽医微生物实验指导[M].北京:中国农业出版社,2001. 30-50.[6] 刘慧芳,刘江梅,余旭平.猪传染性胸膜肺炎鉴别诊断方法[J].上海畜牧兽医通讯,2006,25(5):52-53.[7] 蔡宝祥.家畜传染病学(第三版)[M].北京:中国农业出版社,1996.144-145.[8] 陆承平.兽医微生物学(第三版)[M].北京:中国农业出版社,2001.[9] 王天有,刘保国,赵恒章.猪传染病现代诊断与防治技术[M].北京:中国农业科学技术出版社,2005.40-179.。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的血清型鉴定与药敏试验摘要:从江苏泰州地区疑似猪传染性胸膜肺炎发病猪采集病料,经细菌分离培养得到了3株分离株TZA1､TZA2和TZA3株｡经形态学检查､CAMP试验､生化试验和血清型鉴定,确定TZA1株和TZA2株为血清1型,TZA3株为血清3型｡药敏试验显示,3株分离菌株对恩诺沙星､阿齐霉素､头孢唑肟高度敏感｡关键词:猪胸膜肺炎放线杆菌;血清型鉴定;药敏试验胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是革兰氏阴性､有荚膜的多形球杆菌,有时呈线性,无鞭毛,不运动,不形成芽孢｡根据培养时是否需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD,又称V因子),可将APP分为生物Ⅰ型和生物Ⅱ型,生物Ⅰ型为NAD依赖株,包括血清型1~12 型和15 型,生物Ⅱ型的生长不依赖NAD,但需要其他特定嘌呤或嘌呤前产物以辅助生长,含有2个血清型,为血清型13和14[1]｡猪感染APP后的疾病是猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumia,PCP),急性暴发时有很高的发病率和死亡率｡一些病猪康复后常伴有慢性肺炎,导致生长停滞且长期带菌而成为其他猪的传染源,此病给养猪业造成较大的经济损失[2]｡本研究从江苏泰州地区部分规模猪场临床表现为胸膜肺炎的病料中进行病原分离和血清型鉴定,并对分离菌株进行药敏试验,以期为泰州地区猪传染性胸膜肺炎的防控､净化提供理论支撑｡1材料和方法1.1材料PPLO琼脂和NAD购于扬州市广陵区全球通实验用品销售中心;犊牛血清购于杭州四季青生物工程有限公司;常规培养基､生化试剂和药敏纸片(氟苯尼考和强力霉素为自制)购于杭州天和微生物试剂有限公司;APP 1､3､5､7､9型阳性血清购于中国农业科学院兰州兽医研究所;金黄色葡萄球菌为本实验室保存;待检病料采集于泰州市规模猪场的疑似猪传染性胸膜肺炎的病猪｡1.2试验方法1.2.1细菌的分离培养与形态观察取死亡猪的气管分泌物和肺脏作涂片,革兰氏染色,镜检;同时取病料接种于含2% NAD的PPLO琼脂平板,在5%~10% CO2条件下,37 ℃培养24 h｡然后挑取可疑菌落涂片,镜p1.2.4药敏试验检测分离菌株对氟苯尼考､强力霉素､复方新诺明､丁胺卡那霉素､恩诺沙星､氨苄西林､头孢唑肟和阿奇霉素8种抗生素的敏感性｡将保存好的菌液(浓度稀释到1.5×108个/mL) 均匀涂布在PPLO琼脂上, 然后将药敏纸片贴在平皿上,培养24 h后观察结果,并按抗菌药物药敏试验判定标准判定分离菌株对不同抗生素的敏感程度[4]｡1.2.5菌株血清型鉴定将纯化培养的分离菌株37 ℃培养24 h,用生理盐水洗下,制成生理盐水细菌悬液｡取1滴APP可疑菌株分别与APP 1､3､5､7､9单因子标准阳性血清均匀混合,按照常规方法进行平板凝集试验,观察结果｡2结果2.1细菌的形态特征病料涂片以及分离纯化菌革兰氏染色､镜检,都可见有革兰氏阴性､多形态的细菌,多为球杆菌､短杆菌､偶有成丝状的细菌,着色不均｡2.2分离菌的培养特性3株分离菌在加入2% NAD的PPLO固体培养基上培养24 h,可见1~2 mm､露珠状､半透明的菌落｡2.3CAMP试验3株分离菌在靠近金黄色葡萄球菌的地方出现明显的溶血区域,即CAMP试验阳性｡2.4生化试验3株分离菌均呈卫星现象,可水解尿素酶,发酵乳糖､果糖､葡糖糖,不发酵甘露醇､山梨醇､鼠李糖及阿拉伯糖｡靛基质､甲基红､V-P试验均为阴性｡硝酸盐还原试验阳性,生长需要NAD｡2.5血清型鉴定TZA1株､TZA2株与APP 1型阳性血清发生强烈的凝集发应,鉴定为血清1型;TZA3株与APP 3型阳性血清发生强烈的凝集发应,鉴定为血清3型｡3株菌株与生理盐水和其他血清型的阳性血清未见凝集现象,结果见表1｡2.6药敏试验TZA1和TZA2株对恩诺沙星和阿奇霉素极度敏感｡TZA3对头孢唑肟极度敏感｡3株分离菌对氟苯尼考､丁胺卡那霉素､强力霉素中度敏感,对复方新诺明和氨苄西林低敏,结果见表2｡3小结与讨论3.1APP分离胸膜肺炎放线杆菌营养要求高且受外界影响因素较多,初次比较困难｡在分离的过程中,对于病死猪最好在刚死亡或频临死亡时采集病料,否则,即使病料中有APP感染,也会因猪死亡时间长,致使病料中APP死亡[5]｡应在初次分离培养的培养基中加入NAD,否则APP在常规培养基中大多不生长或生长不良｡本次分离选择加入NAD的PPLO琼脂培养基,成功分离到了3株APP菌株｡3.2APP血清型鉴定胸膜肺炎放线杆菌在不同国家和地区流行菌株的血清型有所不同[6]｡研究表明,我国流行的猪传染性胸膜放线杆菌血清型以1型､3型､7型为主[7]｡因此,本试验选用胸膜肺炎放线杆菌标准单因子阳性血清1､3､5､7､9型为鉴定标准,结果从泰州地区规模猪场分离到的3株APP菌株,血清分型试验鉴定TZA1和TZA2为血清1型,TZA3为血清3型｡本次试验基本摸清了泰州地区APP流行菌株的优势血清型,为本地区猪场猪传染性胸膜肺炎的免疫预防奠定了基础｡3.3APP药敏试验药敏试验结果表明,3株分离菌对同种药物的敏感性有较大差异,其中TZA1和TZA2两个分离株对恩诺沙星和阿奇霉素极度敏感,而TZA3株对头孢唑肟极度敏感｡本药敏试验筛选出的恩诺沙星､阿奇霉素､头孢唑肟和氟苯尼考可作为治疗本地区PCP的首选药物｡研究表明,多种抗菌药物对该菌的治疗效果不理想[4]｡兽医临床上常选用的氟苯尼考和强力霉素等药物敏感性不高,究其原因可能是这些抗生素的大剂量､不规范使用导致临床上耐药性的产生｡建议规模化猪场在防治PCP时最好通过药敏试验选用敏感度较高的抗生素,以最少的投入获得较大的经济效益｡参考文献:[1] 唐文山,李昕.猪传染性胸膜肺炎研究进展[J]. 动物医学进展,2008,29(2):98-102.[2] 徐公义,王海丽, 葛长城, 等. 猪传染性胸膜肺炎的诊断与治疗[J].中国畜牧兽医,2008,35(5):106-107.[3] 马晓平,彭广能,曹三杰,等.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的初步分离鉴定与诊治体会[J].中国兽医杂志,2008,44(2):75-76.[4] 何启盖,王贵平,刘军发,等.猪胸膜肺炎放线杆菌分离鉴定及药敏试验[J].中国预防兽医学报,2003,25(5):360-363.[5] 雷连成,华芳,王丽哲,等.猪胸膜肺炎放线杆菌分离鉴定与毒力测定[J].中国兽医学报,2008,28(4):359-362.[6] 冼琼珍,黄耿森,叶润全,等.血清6型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离与鉴定[J].黑龙江畜牧兽医,2007(5):70-72.[7] 逯忠新,柳纪省,赵萍,等. 猪传染性胸膜肺炎血清抗体检测[J].中国兽医科技,2001,31(3):16-17.[8] 余光勇,郭万柱,徐志文,等.一株四川株猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定[J].黑龙江畜牧兽医,2008(6):62-64.。

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定作者：华芳来源：《农家科技下旬刊》2018年第02期摘要：从本地疑似感染猪传染性胸膜肺炎病猪处进行材料收集，然后在巧克力琼脂平板上进行分离培养，最后得到三株细菌，将其分别命名为X-1、X-2、X-3。

对相应的细菌依次进行生化特征检测、卫星生长现象分析、尿素酶实验鉴定、CAMP试验，其均表现出猪胸膜肺炎放线杆菌的典型症状。

药敏试验结果为分离菌株对硫酸慶大霉素、四环素、氨苄西林、诺氟沙星具有高度敏感性。

关键词：猪传染性胸膜肺炎；猪胸膜肺炎放线杆菌；分离鉴定猪传染性胸膜肺炎具有一定的散发性，常发生于仔猪断奶期间，会降低仔猪免疫力，进而导致仔猪败血症等病症，极大地增加了仔猪死亡率。

对于成年种猪而言，其在感染猪胸膜肺炎放线杆菌之后会表现出关节炎、肺炎、体温上升、食欲下降等情况，甚至引发心内膜炎、肾炎等其他病症，甚至死亡。

一、材料与方法1.材料制作本文所使用的巧克力琼脂平板、麦康凯琼脂平板、鲜血琼脂平板、普通琼脂平板均为实验室自行制作；而药敏纸片、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸均来自杭州某公司。

肺脏病变组织及扁桃体样本采自某规模养猪场，此规模养猪场内病猪具有典型呼吸道疾病病症。

实验动物为18g左右的小白鼠，均采购于当地实验动物机构。

2.方法实施本次实验主要包括细菌分离培养、细菌鉴定两个环节。

其中细菌分离培养需要将肺门淋巴结、肺组织、气管等组织器官无菌取样，并依次接种在所制作的巧克力琼脂平板上，在接种完毕之后利用鸡表皮葡萄球菌进行十字化线，最后在8%二氧化碳培养箱内培养， 36.5℃，培养36小时。

细菌鉴定工作首先选择巧克力琼脂平板上的单一可疑菌落，在依次进行涂片、革兰氏染色后进行镜检观察细菌状态；其次依次将所得到的细菌接种在鲜血琼脂平板、普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板上，在36.5℃的二氧化碳培养箱内培养36小时；再次将1%血红素作为X因子、1%NAD作为Y因子，进行无菌涂片工作并将其涂布在普通培养基培养；最后依照相关规定对其进行尿素酶、卫星现象、糖发酵等生化特性检验。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定、致病性与药敏试验作者：田永祥，檀永强，刘泽文，等来源：《湖北农业科学》 2014年第21期田永祥１，檀永强２，刘泽文１，郭锐１，段正赢１，杨克礼１，周丹娜１，罗咏梅３，袁芳艳１（１．湖北省农业科学院畜牧兽医研究所／动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，武汉４３００６４；２．华中农业大学动物医学院，武汉４３００７０；３．襄阳市动物卫生监督所，湖北襄阳４４２１１０）摘要：从湖北省几个猪场具有严重呼吸道症状的疑似病例中，采集了肺脏、扁桃体、关节液及心包液等病料，进行了细菌的分离培养及菌落形态观察、染色镜检、生化试验、ＰＣＲ检验、血清型鉴定、药敏试验及致病性试验。

结果表明，分离到的８株细菌为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＡＰＰ）。

血清型分型鉴定结果为１型的６株，３型的２株。

药敏试验结果显示，分离的菌株对头孢类、先锋霉素类表现较高的敏感性，为猪场用药提供了科学参考。

关键词：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＡＰＰ）；鉴定；耐药性；致病性中图分类号：Ｓ８５８．２８文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０14）21－5204-04DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2014.21.040Isolation ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆＡｃｔｉｎｏｂｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＴＩＡＮＹｏｎｇ－ｘｉａｎｇ１，ＴＡＮＹｏｎｇ－ｑｉａｎｇ２，ＬＩＵＺｅ－ｗｅｎ１，ＧＵＯＲｕｉ１，ＤＵＡＮＺｈｅｎｇ－ｙｉｎｇ１，ＹＡＮＧＫｅ－ｌｉ１，ＺＨＯＵＤａｎ－ｎａ１，ＬＵＯＹｏｎｇ－ｍｅｉ３，ＹＵＡＮＦａｎｇ－ｙａｎ１（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ，ＨｕｂｅｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ／ＨｕｂｅｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎｉｍａｌＥｍｂｒｙｏａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｒｅｅｄｉｎｇ，Ｗｕｈａｎ４３００６４，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＨｕａｚｈｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７０，Ｃｈｉｎａ；３．ＸｉａｎｇｙａｎｇＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈＳｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎＳｔａｔｉｏｎ，Ｘｉａｎｇｙａｎｇ４４２１１０，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｏｆｌｕｎｇｓ，ｔｏｎｓｉｌｓ，ｊｏｉｎｔｆｌｕｉｄｓａｎｄｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌｆｌｕｉｄｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｓｏｍｅｓｕｓｐｅｃｔｅｄｓｗｉｎｅ with ｓｅｒｉｏｕｓｓｙｍｐｔｏｍs ｏｆｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｉｎＨｕｂｅｉ province ａｎｄｃｏｎｄｕｃｔｅｄｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ through ｃｏｌｏｎｉａｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ｓｔａｉｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＰＣＲ，ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ，ｄｒｕｇｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅ８ isolated ｓｔｒａｉｎｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓｐｏｒｃｉｎｅｃｏｎｔａｇｉｏｕｓＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．Ｔｈｅｓｅｒｏｔｙｐｅｗａｓ６ｏｆｓｅｒｏｔｙｐｅ１ａｎｄ２ｏｆｓｅｒｏｔｙｐｅ３． Rｅｓｕｌｔｓ of dｒｕｇｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅ isolated ｓｔｒａｉｎｓ had ｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｗｉｔｈｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎｓａｎｄｃｅｐｈａｌｏｔｈｉｎ. It will ｐｒｏｖｉｄｅａｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｆａｒｍｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．；ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ收稿日期：２０１４－０８－０８基金项目：国家自然科学基金项目（３１００１０７６）；公益性行业（农业）科研专项（２０１３０３０３４－９）；动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室开放课题项目（２０１４ＺＤ１５０）；湖北省农业科技创新中心资助项目（２０１１－６２０－００１－０３）作者简介：田永祥（１９６５－），男，湖北武汉人，研究员，主要从事动物生物技术研究，（电话）０２７－８７３８０１９５（电子信箱）ｔｙｘａｎｂｉｔ＠１６３．ｃｏｍ；通讯作者，袁芳艳，（电话）０２７－８７３８０１９５。

一、实验背景猪传染性胸膜肺炎（PCP）是由猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）引起的一种猪呼吸道疾病，具有高度的传染性和致死性。

该病在全世界范围内广泛流行，给养猪业造成了巨大的经济损失。

APP的主要致病因子包括荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白和溶血毒素（Apx）。

其中，溶血毒素Apx在APP的致病过程中起着重要作用。

本研究旨在提取纯化APP溶血毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ，并研究其对小鼠的致病性和免疫原性，为研制有效的疫苗提供理论依据。

二、实验材料1. 实验动物：SPF级昆明小鼠，体重18-22g。

2. 菌株：猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清10型、血清7型、血清3型。

3. 试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA连接试剂盒、限制性内切酶、DNA聚合酶、Taq酶、琼脂糖、琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNA marker、蛋白marker、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、Western blot试剂、抗体等。

4. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、超净工作台、孵育箱、培养箱、显微镜等。

三、实验方法1. APP溶血毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ的提取与纯化（1）分别将APP血清10型、血清7型、血清3型接种于LB液体培养基，37℃培养过夜。

（2）收集菌液，12,000r/min离心10min，弃上清，收集菌体。

（3）将菌体用PBS缓冲液重悬，加入溶菌酶，37℃水浴处理1h。

（4）12,000r/min离心10min，收集上清液。

（5）对上清液进行Sephadex G-50凝胶柱层析，收集ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ峰。

（6）对ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ峰进行透析，去除盐分。

（7）对透析后的ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ进行SDS-PAGE电泳，鉴定纯度。

2. APP溶血毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ对小鼠的致病性研究（1）将小鼠分为A、B、C三组，每组10只。

（2）A组：正常小鼠。

癣却定畜毀尊他養2019年（第4（）卷）第3期赭传染性胸膜肺炎放线杆菌的分富鉴定与药敏试验刘艳美（河南农业职业学院，河南郑州451450）摘要：由郑州某猪场疑似猪传染性胸膜肺炎的病料分离到一株细菌，经实验室组织涂片、培养观察、血清学鉴定为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌；进一步药敏试验表明，分离菌对恩诺沙星、阿莫西林、卡那霉素、头胞■瘗咲钠敏感。

关键词：猪传染性胸膜肺炎；鉴定；药敏试验中图分类号:S858.28文献标识码：B 胸膜肺炎放线杆菌可引起猪传染性胸膜肺炎,是猪的•种重要的接触性呼吸道传染病，临床上以出现肺炎或胸膜肺炎为主要特征，在多数养猪国家和地区有不同程度的流行，给集约化养猪业发展造成很大的经济损失。

胸膜肺炎放线杆菌（APP）是革兰氏阴性有荚膜的多形球杆菌.有时呈线性，无鞭毛，不运动,不形成芽抱。

目前我国已报道的APP有1、2、3、5、7和10等血清型,其中以1、3、7型为主m。

该菌对外界抵抗力不强,60咒经5~20min 即可杀死,常用消毒剂均可使其灭活叫1材料与方法1.1材料麦康凯培养基.普通营养琼脂培养基,胰蛋白豚大豆培养基（TSA）,生化试剂等购自杭州天和生物,PPLO琼脂和烟酰胺腺P票吟二核昔酸（NAD）,APP1、3、5、7、9型阳性血清,金黄色葡萄球菌，由国家兽用药品工程技术中心诊断室提供,羊鲜血培养基（含1%NAD）,药敏纸片自制。

待检病料:无菌采集具有典型病变的组织（心、肺），采集郑州市某猪场的疑似病猪。

1.2方法1.2.1涂片镜检将病变组织做涂片，革兰氏染色，镜检观察。

1.2.2培养特性观察将病料接种于含2%NAD的PPLO琼脂平板,37t培养24h,挑取可疑菌落涂片，镜检。

同时将可疑菌落接种于TSA培养基、麦康凯培养基、普通营养琼脂培养基观察培养。

1.2.3CAMP试验用金黄色葡萄球菌在兔血琼脂平板（含1%NAD）上划文章编号：1004-5090（2019）03-0005-02一直线，再用分离菌划线与该线垂直但不相接触的两条直线,37T培养24~36h,观察试验结果。

72猪业科学  SWINE INDUSTRY SCIENCE 2015年32卷第10期猪场兽医VETERINARY猪传染性胸膜肺炎的病例分析夏新萌1，刘承军2，李 海1（1.聊城市动物疫病与控制中心，山东 聊城 252000；2.聊城市动物医院，山东 聊城 252000）2014年10月山东某养猪场3月龄猪发病十几头。

临床症状为体温升高，呼吸急促困难，精神沉郁，食欲废绝，并且迅速死亡，死亡时鼻孔有泡沫状血性黏液流出。

剖检可见病猪肺呈紫红色肝变，肺炎区表面有纤维素性附着物，胸膜增厚。

呈现非常典型的猪传染性胸膜肺炎的症状。

1 胸膜肺炎放线杆菌特点胸膜肺炎放线杆菌属于巴氏杆菌科放线杆菌属，革兰氏阴性小球杆菌，具多行性。

新鲜的病料呈现两极染色，有荚膜和鞭毛，具有运动性[1]。

置于10% CO 2中可长出黏液性菌落。

最适宜生长温度为37 ℃。

兼性厌氧型。

在普通营养基上不生长，需要添加V 因子，常用巧克力培养基培养。

在绵羊血平板上，可产生稳定的•溶血，金黄色葡萄球菌可增强其溶血圈(CAMP 实验阳性) [2]。

2 胸膜肺炎放线杆菌致病性猪是本菌高度专一性的宿主，寄生在扁桃体和上呼吸道。

慢性感染猪或康复猪为带菌者。

3～6月龄的猪最易感，经飞沫或气雾在短距离传播，猪与猪的直接接触也可传染。

应激会促使发病。

在规模化猪场的猪群往往呈急性暴发，死亡率高。

表现为典型的胸膜肺炎症状，鼻孔流出血性分泌物带菌，因受黏液蛋白的保护，病原可在环境中存活数天[3]。

3 传染性胸膜肺炎流行病学特点摘 要：猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起猪的一种高度传染性呼吸道疾病，又称为猪接触性传染性胸膜肺炎。

分离自山东某养殖场的疑似病例，并对典型的疑似猪传染性胸膜肺炎病例进行放线杆菌的分离鉴定。

分离到5株细菌为多形态、革兰氏阴性杆菌；生化试验鉴定结果表明所分离的上述5株菌株为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。

文内介绍了猪传染性胸膜肺炎的发病情况以及药敏实验结果，为生产优质猪肉提供有效的理论支持。

锦州地区猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离与鉴定隋慧【摘要】[Objective] The research aimed to investigate the prevalence of porcine infectious pleuropneumonia in Jinzhou area. [ Method ] Five shares of diseased materials were colleted from some pig farms of Jinzhou area. The pathogens were isolated and identified by the culture test, biochemical test,satellite phenomenon examination,hematolysis test,CAMP test,drug sensitivity test and animal inoculation test. [ Result] The pathogens were Gram - negative short bacillus,with polymorphism and no spore. Five strains of porcine infectious actinobacillus pleuropneumonia were isolated and they all had satellite phenomenon and hematolysis phenomenon. CAMP test results showed that its hemolytic circle was strengthened by Staphylococcus aureus. Five isolated strains showed high sensitivity to cefradine, cephalosporin V and norfloxacin, but they were resistant to amoxycillin,streptomycin,penicillin and aureomycin. The animal inoculation test showed that the pathogen had high pathogenicity to rabbit. [Conclusion] The research could provide basis for the clinical treatment of porcine infectious pleuropneumonia.%[目的]调查锦州猪传染胸膜肺炎的流行情况.[方法]从锦州部分发病猪场采集病料5份,通过细菌的分离培养、生化试验、卫星现象观察,溶血试验、CAMP试验、药敏试验和动物接种试验对致病菌进行分离与鉴定.[结果]该病原菌为革兰氏阴性短小杆菌,无芽孢,具有多形性.分离到5株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌,均有卫星现象和溶血现象.CAMP试验结果表明,金黄色葡萄球菌可增强其溶血圈.5株分离菌对头孢拉定、先锋V、氟哌酸高度敏感,而对阿莫西林、链霉素、青霉素、金霉素有耐药性.动物接种试验表明该致病菌对家兔具有较高的致病力.[结论]该研究可为猪传染性胸膜肺炎的临床治疗提供依据.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(000)006【总页数】2页(P3366-3367)【关键词】猪传染性胸膜肺炎;放线杆菌;分离;鉴定【作者】隋慧【作者单位】辽宁医学院畜牧兽医学院,辽宁锦州121001【正文语种】中文【中图分类】S852.61+92011年锦州多个大型规模化猪场的猪出现体温升高、皮肤发绀、被毛粗乱、呼吸困难、咳嗽、食欲减退或废绝、常站立或呈犬坐姿势、张口伸舌等症状。

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定和药敏试验廖晓糠ꎬ汤德元∗ꎬ石远菊ꎬ廖少山ꎬ刘巧玲ꎬ郭倩妤(贵州大学动物科学学院ꎬ贵州贵阳５５００２５)摘要:为确诊福泉市某猪场疑似猪传染性胸膜肺炎病例ꎬ无菌采集病死猪的肺脏病料ꎬ用含ＮＡＤ和胎牛血清的ＬＢ琼脂培养基进行细菌分离培养和纯化ꎬ经形态学观察㊁生化实验㊁１６ＳｒＲＮＡ基因鉴定为胸膜肺炎放线杆菌ꎮ药敏试验结果显示ꎬ分离菌株对磺胺甲基异噁唑高度敏感ꎬ对头孢曲松中度敏感ꎬ可作为治疗首选药物ꎮ关键词:猪ꎻ胸膜肺炎放线杆菌ꎻ分离鉴定ꎻ药敏试验中图分类号:Ｓ８５８.２８:Ｑ７㊀㊀㊀文献标识码:Ａ㊀㊀㊀文章编号:１００７－１４７４(２０１８)０３－００１４－０４ＩｓｏｌａｔｉｏｎꎬＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＤｒｕｇＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＴｅｓｔｏｆＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＬｉａｏＸｉａｏｋａｎｇꎬＴａｎｇＤｅｙｕａｎꎬＳｈｉＹｕａｎｊｕꎬＬｉａｏＳｈａｏｓｈａｎꎬＬｉｕＱｉａｏｌｉｎｇꎬＧｕｏＱｉａｎｙｕ(ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅꎬＧｕｉｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＧｕｉｙａｎｇＧｕｉｚｈｏｕ５５００２５ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｃｏｎｆｉｒｍｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｓｕｓｐｅｃｔｅｄｐｏｒｃｉｎｅｃｏｎｔａｇｉｏｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｉｎａｐｉｇｆａｒｍｉｎＦｕｑｕａｎｃｉｔｙꎬｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｄｌｕｎｇｓｏｆｔｈｅｄｅａｄｐｉｇｓｗｅｒｅａｓｅｐｔｉｃａｌｌｙｃｏｌｌｅｃｔｅｄａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙＬＢａｇａｒｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＮＡＤａｎｄｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ.ꎬｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓꎬ１６ＳｒＲＮＡｇｅｎｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ.Ｄｒｕｇｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅｈｉｇｈｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｅꎬｍｏｄｅｒａｔｅｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅꎬａｎｄｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄａｓｔｈｅｄｒｕｇｏｆｃｈｏｉｃｅｆｏｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＰｏｒｃｉｎｅꎻＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅꎻＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻＤｒｕｇＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＴｅｓｔ㊀㊀猪传染性胸膜肺炎(Ｐｏｒｃｉｎｅｃｏｎｔａｇｉｏｕｓｐｌｅｕｒｏ￣ｐｎｅｕｍｉａꎬＰＣＰ)是由胸膜肺炎放线杆菌(Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌ￣ｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅꎬＡｐｐ)引起以出血性纤维素性胸膜肺炎为病理特征的１种高度接触传染性呼吸道传染病ꎬ能引起猪急性纤维素性胸膜肺炎或慢性局灶性坏死性肺炎ꎬ急性发作时死亡率较高ꎬ慢性发作时死亡率较低ꎬ猪生长缓慢ꎬ饲料转化率降低ꎬ给养猪业造成巨大的经济损失[１~３]ꎮ２０１７年１０月２６日ꎬ贵州省福泉市某猪场从湖北引进后备母猪５００余头ꎬ部分猪出现咳嗽㊁喘气㊁体温升高㊁耳部皮肤发绀等临床症状ꎬ且免疫猪瘟疫收稿日期:２０１８－０２－２８基金项目:贵州省２０１７年农业攻关项目(黔科合ＮＹ字[２０１７]３０５１号)ꎻ贵州省教育厅创新群体重大研究项目(黔教合ＫＹ字[２０１７]０２７)作者简介:廖晓糠(１９９６ )ꎬ男ꎬ本科ꎬ研究方向:动物传染病病原分子生物学ꎮＥ－ｍａｉｌ:１５９３１２９７３１＠ｑｑ.ｃｏｍ∗通讯作者:汤德元(１９６４ )ꎬ男ꎬ教授ꎬ博士ꎬ硕士生导师ꎬ研究方向:动物传染病病原分子生物学和中西兽医结合诊疗ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｔｄｙｕａｎ＠１６３.ｃｏｍ苗后病症加重ꎮ至１１月６日ꎬ共发病猪２５头ꎬ死亡６头ꎮ剖解病死猪ꎬ发现肺脏出血㊁淤血㊁坏死且有纤维素性渗出物ꎬ肝脏肿大㊁淤血ꎬ胃底部有浅表性弥漫性出血ꎬ疑似猪传染性胸膜肺炎ꎮ对送检病料进行细菌分离培养和纯化ꎬ经形态学观察㊁生化实验㊁１６ＳｒＲＮＡ基因鉴定为胸膜肺炎放线杆菌ꎬ并对该菌株进行药敏试验ꎬ为猪传染性胸膜肺炎的诊断及防治提供参考ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料㊀(１)该猪场疑似猪传染性胸膜肺炎病死猪ꎬ取肺脏㊁肝脏病料ꎻ(２)细菌微量生化鉴定管ꎬ购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司ꎻ(３)药敏纸片ꎬ购自杭州天和微生物试剂有限公司ꎻ(４)ＮＡＤ㊁胎牛血清㊁革兰氏染色液㊁ＤＮＡＭａｒｋｅｒ㊁ＬＡＴａｑＤＮＡ聚合酶等ꎬ均购自宝生物工程(大连)有限公司ꎮ１.２㊀病料镜检㊀取肝脏涂片ꎬ经革兰氏染色后于油镜下镜检ꎮ１.３㊀细菌分离与纯化㊀无菌采取肺脏病变部位ꎬ接种于含ＮＡＤ和胎牛血清的ＬＢ琼脂平板ꎬ置于３７ħ培养箱中培养１２~２４ｈꎬ无菌挑取单个菌落进行划线纯培养ꎬ直到平板上长出的菌落完全一致为止ꎮ１.４㊀细菌革兰氏染色㊀在干净的载玻片上滴加三蒸水１０μＬꎬ用接种环挑取已纯化培养的单个菌落ꎬ与载玻片上的三蒸水充分混匀ꎬ用酒精灯进行火焰固定ꎮ在已经固定好的涂片上滴加结晶紫１００μＬꎬ约１ｍｉｎ后用三蒸水洗涤ꎬ再滴加卢革氏碘液１００μＬ媒染ꎬ约１ｍｉｎ后用三蒸水洗涤ꎬ再滴加９５％乙醇进行脱色ꎬ约３０ｓ后三蒸水洗涤ꎬ最后滴加番红染液复染ꎬ约１ｍｉｎ后用三蒸水洗涤ꎮ待染色区域风干后ꎬ于油镜下观察细菌的染色情况和形态ꎮ１.５㊀细菌生化试验㊀按照细菌生化鉴定管的说明书ꎬ挑取纯化培养的菌落接种于含１％ＮＡＤ的细菌微量生化鉴定管:葡萄糖㊁麦芽糖㊁蔗糖㊁木糖㊁甘露醇㊁尿素酶㊁硫化氢㊁Ｍ.Ｒ㊁Ｖ－Ｐ㊁吲哚㊁山梨醇㊁ＫＣＮ进行鉴定ꎮ１.６㊀分离菌株１６ＳｒＲＮＡ基因扩增㊀以分离菌株的基因组ＤＮＡ为模板ꎬ用细菌１６ＳｒＲＮＡ基因的通用引物(Ｆ:５ －ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３ ꎬＲ:５ －ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３ )进行ＰＣＲ扩增ꎬ预扩增片段为１４９２ｂｐꎮＰＣＲ反应体系:ＬＡＴａｐＤＮＡ聚合酶１μＬꎬｄＮＴＰＳＭｉｘ１μＬꎬ１０ˑＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２μＬꎬ上㊁下游引物各１μＬꎬ基因组ＤＮＡ２μＬꎬ用ｄｄＨ２Ｏ补足２０μＬꎮＰＣＲ反应程序:９４ħ预变性５ｍｉｎꎻ９４ħ变性３０ｓꎬ５５ħ退火４５ｓꎬ７２ħ延伸１ｍｉｎꎬ共３５个循环ꎻ７２ħ终延伸１０ｍｉｎꎮＰＣＲ反应结束后取ＰＣＲ产物５μＬꎬ用１.０％琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ目的片段胶回收后送北京六合华大基因科技股份有限公司测序ꎬ对测序结果进行核苷酸的同源性比较及构建系统进化树ꎮ１.７㊀分离菌株的药敏试验㊀挑取ＬＢ琼脂培养基上的单个菌落于ＬＢ液体培养基中增菌培养ꎬ约１２ｈ后取菌液０.５ｍＬ均匀涂布于ＬＢ琼脂培养基表面ꎬ待菌液吸收后贴上链霉素㊁磺胺甲基异噁唑㊁卡那霉素㊁环丙沙星㊁多西环素㊁阿莫西林㊁青霉素㊁庆大霉素㊁头孢曲松９种药敏纸片ꎬ置３７ħ培养箱中培养１２~２４ｈꎬ用直尺测量抑菌圈直径ꎬ参考药敏试验抑菌圈直径判定标准(ＷＳ－Ｔ１２５－１９９９)判定药敏试验结果ꎬ确定待检分离菌株对药物的敏感性ꎮ２㊀结果２.１㊀剖检病变㊀剖检疑似猪传染性胸膜肺炎病死猪ꎬ发现肺脏淤血㊁出血㊁坏死ꎬ有纤维素性渗出物(见图１)ꎻ肝脏肿大㊁淤血(见图２)ꎻ胃底部弥漫性出血(见图３)ꎮ图１㊀肺脏淤血㊁出血㊁坏死ꎬ有纤维素性渗出物图２㊀肝脏淤血㊁肿大㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀图３㊀胃底部弥漫性出血２.２㊀分离菌株的菌落形态特征㊀分离菌株在含ＮＡＤ和胎牛血清的ＬＢ琼脂培养基上培养约１２ｈ后形成表面光滑㊁圆形㊁凸起㊁湿润㊁灰白色带金黄色荧光且不透明的菌落ꎬ直径为２~３ｍｍ(见图４Ａ)ꎮ培养２４ｈ后形成的菌落具有明显的金黄色荧光ꎬ结构细致ꎬ在菌落上面似有１层白色云雾(见图４Ｂ)ꎮ无菌取病变肝脏直接涂片ꎬ经革兰氏染色于油镜下观察ꎬ有少量长丝状的红色(革兰氏阴性)杆菌(见图４Ｃ)ꎮ取含ＮＡＤ和胎牛血清的ＬＢ琼脂平板上培养１２ｈ后的单个菌落ꎬ经革兰氏染色于油镜下观察ꎬ可见革兰氏阴性球杆菌ꎬ菌体细小ꎬ也可见杆状㊁丝状散在菌体(见图４Ｄ)ꎮ挑取单个菌落于ＬＢ液体培养基中培养约１２ｈꎬ菌液经革兰氏染色后呈长杆状㊁丝状的红色菌体(见图４Ｅ)ꎮ培养基上的菌落形态及革兰氏染色镜检结果与胸膜肺炎放线杆菌的基本特性相符ꎮＡ:分离菌株在含ＮＡＤ和血清琼脂培养基中菌落形态(１２ｈ)ꎻＢ:分离菌株在含ＮＡＤ和血清琼脂培养基中菌落形态(２４ｈ)ꎻＣ:肝脏涂片革兰氏染色镜检(１０ˑ１００)ꎻＤ:菌落革兰氏染色镜检(１０ˑ１００)ꎻＥ:菌液革兰氏染色镜检(１０ˑ１００)图４㊀分离菌株的形态学观察２.３㊀分离菌株的生化鉴定结果㊀分离菌株能发酵葡萄糖㊁麦芽糖㊁蔗糖㊁木糖㊁甘露醇ꎻ尿素酶㊁硫化氢试验阳性ꎻ吲哚㊁Ｍ.Ｒ㊁Ｖ－Ｐ㊁山梨醇㊁ＫＣＮ试验阴性ꎮ生化结果参考«伯杰氏细菌鉴定手册»判断标准ꎬ与胸膜肺炎放线杆菌的生化特性基本相符ꎮ２.４㊀分离菌株的１６ＳｒＲＮＡ基因鉴定结果㊀用细菌１６ＳｒＲＮＡ通用引物扩增目的序列ꎬ扩增的片段与预期目的片段１４９２ｂｐ接近(见图５)ꎮ测序结果分析表明:分离菌株(命名为ＦＡ)与ＮＣＢＩ上的胸膜肺炎放线杆菌菌株有９９.４％~９９.７％的同源性(见图６)ꎬ且与胸膜肺炎放线杆菌菌株ＱＡＳ１０６(登录号:ＡＢ６３５３８０.１)Ｍ:ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１:阳性对照ꎻ２:分离菌株图５㊀分离菌株１６ＳｒＲＮＡ基因ＰＣＲ扩增结果处于同一遗传进化分支ꎬ与大肠杆菌菌株８４(登录号:ＭＦ３９９２８５.１)亲缘关系较远(见图７)ꎮ图６㊀分离菌株１６ｓｒＲＮＡ基因核苷酸同源性分析图７㊀分离菌株１６ｓｒＲＮＡ基因遗传进化树分析２.５㊀药敏试验结果㊀药敏试验结果显示(见图８):分离菌株对磺胺甲基异噁唑的抑菌圈直径为１７ｍｍ为高敏ꎻ对头孢曲松的抑菌圈直径为１１ｍｍ为中敏ꎻ对链霉素㊁卡那霉素㊁环丙沙星㊁多西环素㊁阿莫西林㊁青霉素㊁庆大霉素的抑菌圈直径在１０ｍｍ以下ꎬ敏感性低或不敏感ꎮ㊀㊀㊀图８㊀药敏试验结果３㊀小结３.１㊀通过细菌分离培养㊁形态学观察㊁生化实验㊁１６ＳｒＲＮＡ基因鉴定ꎬ结合临床症状㊁病理变化ꎬ确诊该猪场病例为胸膜肺炎放线杆菌引起的猪传染性胸膜肺炎ꎮ３.２㊀猪传染性胸膜肺炎是猪呼吸系统的主要传染病之一ꎬ几乎遍及全世界所有养猪国家ꎬ给养猪业造成巨大的经济损失ꎮ随着临床生产中抗菌药物的大量使用ꎬ其耐药性也越来越严重ꎮ从药敏试验结果来看ꎬ分离菌株仅对磺胺甲基异噁唑㊁头孢曲松敏感ꎮ参考文献:[１]㊀许明芳.一起猪传染性胸膜肺炎的诊治[Ｊ].福建畜牧兽医ꎬ２０１３(３):７２.[２]㊀徐引弟ꎬ王治方ꎬ朱文豪ꎬ等.规模化猪场传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定[Ｊ].畜牧与兽医ꎬ２０１０ꎬ４２(７):１０６.[３]㊀梁金华.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离和鉴定[Ｊ].中国兽医杂志ꎬ２００６ꎬ４２(８):６０－６１.。

文章编号：1673-887X(2023)05-0144-03猪胸膜肺炎放线菌分离鉴定与耐药性检测吕凤禄，赵欢（1.北镇市动物疫病预防控制中心（动物卫生监督中心），辽宁北镇121300；2.北镇市农业综合行政执法队，辽宁北镇121300）摘要为了分析某地区规模化养殖场及散养户中猪胸膜肺炎放线菌流行情况与对临床中常用抗菌药物耐药性情况，文章对2021年—2023年采集某地区规模化养殖场及散养户中疑似患猪胸膜肺炎放线菌病不同日龄猪的咽拭子、鼻拭子及死亡猪的肺脏组织170份，采用细菌分离培养、形态学观察、生化鉴定及PCR 方法对猪胸膜肺炎放线菌进行鉴定，采用K-B 药敏纸片法检测分离菌株的耐药性。

结果显示：从170份病料样品中分离到65株猪胸膜肺炎放线菌；分离的65株猪胸膜肺炎放线菌对新霉素、磺胺间甲氧嘧啶、庆大霉素等10种药物耐药率在50.8%以上，对头孢噻肟、头孢噻呋、环丙沙星等8种药物耐药率在6.2%~33.8%，为该地区仔猪源沙门菌病防控和合理用药提供参考。

关键词仔猪；沙门菌；分离鉴定；耐药性分析中图分类号S858.28文献标志码Adoi:10.3969/j.issn.1673-887X.2023.05.054Isolation Identification and Drug Resistance Detection of Porcine Pleuropneumonia ActinomycetesLyu Fenglu,Zhao Huan(1.Beizhen Animal Disease Prevention and Control Center (Animal Health Supervision Center),Beizhen 121300,Liaoning,China;2.Beizhen Agricultural Comprehensive Administrative Enforcement Team,Beizhen 121300,Liaoning,China)Abstract ：In order to analyze the prevalence of porcine pleuropneumonia actinomycetes in large-scale farms and free-range house ‐holds in a certain area and their resistance to commonly used antibiotics in clinical practice,the paper collected 170throat swabs,nose swabs and lung tissues of dead pigs of different ages suspected to be infected with porcine pleuropneumonia actinomycetes in large-scale farms and free-range households in a certain area from 2021to 2023.The actinomycetes porcine pleuropneumoniae were identified by isolation and culture,morphological observation,biochemical identification and PCR.The drug resistance of the iso ‐lates was detected by K-B drug sensitive disk method.The results showed that 65strains of actinomyces pleuropneumoniae were iso ‐lated from 170samples.The resistance rates of 65strains of actinomyces pleuropneumoniae isolated to 10drugs such as neomycin,sulfamethoxil and gentamicin were above 50.8%,and the resistance rates of 8drugs such as cefotaxime,ceftiofur and ciprofloxacin were 6.2%~33.8%,providing reference for the prevention and control of salmonellosis of piglets in this area and rational drug use.Key words ：piglet,salmonella,isolation and identification,drug resistance analysis在猪养殖过程中，不同日龄猪的呼吸道疾病成为临床中的常见疾病，对不同阶段猪的感染率和死亡率均较高，尤其是对仔猪的危害较大。

猪传染性胸膜肺炎实验室诊断和预防概述：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌病如何诊断?在通风不畅的养猪场，肺炎咳嗽是常见的疾病，那么，这类疾病如何预防呢?猪传染性胸膜肺炎实验室诊断和预防猪传染性胸膜肺炎放线杆菌病如何诊断?在通风不畅的养猪场，肺炎咳嗽是常见的疾病，那么，这类疾病如何预防呢?实验室诊断方法1、细菌分离取未使用药物治疗发病猪的肺脏或者肺洗液做细菌分离2、药敏试验确定敏感药物及耐受性药物南昌金牧实验室药敏试验结果：敏感药物：头孢噻肟氧氟沙星恩若沙星氟苯尼考不敏感药物：青霉素林可霉素复方新诺明3、PCR共有6套检测APP特异性引物4、测序确定APP是否变异，进行进化树分析5、血清学诊断补体结合试验：用于猪传染性胸膜肺炎的诊断和病原分型,特异性高,可将APP与副猪嗜血杆菌区分开,但敏感性不强,有假阳性结果，操作复杂,费时且检测样品不易规模化间接血凝试验：敏感、特异、操作方便，而且可早期诊断检测,可用于猪传染性胸膜肺炎的流行病学调查和定性。

ELISA进行APP的血清学诊断,可以分为型特异性ELISA和种特异性ELISA，前者是只能对一种血清型的APP做出检测,后者是对所有血清型的APP都可做出检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌病的防治1隔离驯化在引种时作好严格检疫，以防引入带菌猪，引进种猪时要从无病猪场购买,对购入的种猪进行隔离饲养。

2生产体系要采用全进全出式饲养,使每批猪在生产时间上拉开5~7d的间隔以进行隔离消毒,可有效切断传播途径。

3饲养管理改善饲养管理,作好猪场防暑降温和防寒保温工作,每天作好通风换气保持舍内空气清新4定期消毒坚持消毒制度对猪舍、猪栏、猪圈、用具、通道及环境定期消毒。

5药物预防作好药物预防。

在本病的高发期可在饲料中按要求添加敏感抗生素进行预防,且预防药物应有计划地定期轮换使用，以防产生耐药性。

6免疫抑制疾病防控做好对猪瘟、伪狂犬、高致病蓝耳等对引发猪呼吸道综合征的免疫抑制性疫病的防控,以减轻病原体对肺脏的侵害和免疫器官的破坏。