石蜡切片原位杂交免疫组化

石蜡切片免疫组化染色步骤石蜡切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于研究组织、细胞和分子的结构与功能。

它通过使用抗体与特定抗原相互结合，然后使用酶、免疫荧光等标记物来检测这种结合，从而实现可视化染色和定位目标分子的目的。

下面，我们将详细介绍石蜡切片免疫组化染色的步骤。

步骤一：蜡块去蜡石蜡切片通常是由固定的组织样本制备而成，这些样本在处理过程中会被包埋在石蜡中。

因此，第一步是将蜡块去蜡。

首先，将蜡块放在温水中加热，使蜡块软化。

然后，将蜡块用刮刀从玻片上刮下。

这样可以得到蜡块去蜡后的组织样本。

步骤二：样本再固定在蜡块去蜡后，为了更好地保持组织的完整性和稳定性，通常需要对样本进行再固定。

常用的再固定方法是将样本放入4%的中性缓冲福尔马林溶液中，在室温下固定4-24小时。

固定后，将样本从福尔马林中取出，用PBS（磷酸缓冲盐溶液）洗涤数次，以去除残余的福尔马林。

步骤三：切片制备在样本再固定后，需要将样本制备成切片。

首先，将组织样本放入甲醇中脱水，然后转移到乙醚中脱脂。

脱脂后，将样本放入苯骚酸乙酯中浸泡，使样本渗透均匀。

在苯骚酸乙酯中浸泡一段时间后，将样本转移到石蜡中浸泡。

石蜡具有很好的切片性能，可以更好地保持组织的结构。

最后，将样本放入石蜡包埋机中，进行加热和固化，制备成为石蜡块。

之后，使用旋转切片机将石蜡块切成4-6微米厚的切片。

切片后，将切片浸泡在热水中，使其展开并粘附在玻片上。

步骤四：抗原修复切片制备完毕后，需要对切片进行抗原修复。

抗原修复是为了使样本中的抗原能够更好地暴露出来，增加抗体的结合效率。

常用的抗原修复方法有热处理和化学处理两种。

热处理通常是将切片浸泡在含有缓冲盐的蒸馏水中，然后加热至高温（如95摄氏度）保持一定时间。

化学处理通常是将切片浸泡在含有抗原修复试剂的溶液中，如EDTA（乙二胺四乙酸二钠）溶液。

抗原修复的时间和条件需根据具体实验的要求来确定。

步骤五：非特异性结合阻断为了减少非特异性结合，需要对切片进行非特异性结合阻断。

石蜡切片免疫组化染色步骤石蜡切片免疫组化染色是一种常用的组织学染色技术，它能够通过染色反应检测组织中的蛋白质分子、细胞因子、细胞膜受体和细胞核因子等，为研究细胞和组织的功能以及疾病的发生机制提供了重要的工具。

下面将详细介绍石蜡切片免疫组化染色的步骤。

1.组织固定组织固定是石蜡切片免疫组化染色的第一步，它的目的是保持组织形态和结构，使得后续的染色步骤能够成功进行。

常用的固定方法有甲醛固定、醋酸盐固定和乙醇固定等。

其中，甲醛固定是最常用的方法，它可以固定组织细胞的形态和结构，同时减少细胞中的酶活性。

2.组织处理组织处理是将固定后的组织进行处理以便得到合适的切片和染色结果。

处理过程主要包括去水化、脱脂、透明化和浸渍等。

其中，去水化是将固定的组织从水中逐渐转移到无水乙醇中，以防止组织中的水分对后续蜡包埋产生干扰；脱脂是将组织中的脂肪酸等去除，以减少重组过程中的背景染色；透明化是将组织从乙醇中转移到透明剂中，以便光线穿过组织时不受阻碍；浸渍是将透明剂中的组织浸渍入蜡中，使其成为切片的固定基质。

3.蜡包埋蜡包埋是将处理后的组织浸入熔化的石蜡中，使其固定在蜡块中，并利用蜡的硬度和韧性将组织完整地包裹起来。

蜡包埋过程主要包括浸渍、浸透和固化等步骤。

其中，浸渍是将固定在透明剂中的组织浸渍入熔化的蜡中，以提高组织与蜡的亲和性；浸透是将融化的蜡逐渐浸透入组织内部的过程，以保持组织的完整性；固化是将蜡冷却固化，使其成为切片的固定基质。

4.制备切片制备切片是将包埋在蜡中的组织切成适当的厚度，以便后续的染色和观察。

制备切片的步骤主要包括切片机调节、切片和玻片浮法三个步骤。

其中，切片机调节是将切片机调整到适合的刀片和切片速度，以保证切片的质量和均匀性；切片是将包埋的组织从蜡块中切下，并将其转移到切片水槽中；玻片浮法是将切片从切片水槽中捞起，并将其平铺在预处理的玻片上。

5.脱蜡和重组脱蜡和重组是将切片上的蜡去除，并将组织重组成适合的形式，以便后续的染色步骤。

石蜡切片免疫组化步骤1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。

2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(10min)→95%乙醇(10min)→90乙醇(10min)→80%(10min)4.抗原修复：柠檬酸钠缓冲液95度，10分钟. (枸橼酸三钠3g枸橼酸0.4g然后加水到950毫升左右，然后用NaOH或HCI调pH值6.0，最后定容在1000ml)5. PBS浸洗2次各5min6.加3%H2O2孵育5min(室温或37度，避光)。

肝组织过氧化物酶含量高。

需增加浓度或增长时间。

蒸馏水洗2minx3次8.pbs-曲拉通通透（pv法不需要）9.与二抗种属一致的血清封闭非特异位点。

（pv法不需要）9.滴加一抗4℃过夜10.PBS浸洗3次各5min11.滴加二抗室温或37℃孵育30min12.PBS洗3次各5min15.DAB显色5~20min，自来水充分涮洗16.苏木素复染2~3min，自来水充分涮洗17.氨水反蓝，过蓝可用盐酸酒精分化2s，自来水充分涮洗.用稀氨水返蓝，自来水里加几滴稀氨水，就行了，返蓝时间5分钟左右，就很好看了;淡氨水有人用50ml自来水＋三四滴的氢氧化铵；18.脱水、透明80%(5min)→90%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→ 100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min)19.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干二、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤2h以上，然后按以下流程进行：二甲苯Ⅰ（1h）、二甲苯Ⅱ（30min）、100%酒精（30min）、95%酒精（15min）、70%酒精（15min）、50%酒精（15min）、蒸馏水（15min）2、3%H2O2，室温封闭5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。

3、甩去H2O2，蒸馏水洗2min×3次。

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法1、组织的采集、固定和保存：采取组织后，方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4?C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年tesis）PBS缓冲液洗三次，每次5min，4?C保存于70%乙醇中。

2、组织的包埋、切片、展片及保存：：固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54?C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10?m，贴于处理过的干净载玻片上，37?C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。

石蜡包埋：保存于4?C 70%乙醇中的组织样品?80%乙醇15 min?95%乙醇15 min?100%乙醇15min ? 2?1/2乙醇1/2二甲苯15 min?二甲苯透明5-10 min?1/2二甲苯1/2石蜡30 min?石蜡（1） 1.5hr?石蜡（2） 1.5-2.5hr?石蜡（3）包埋?RT保存3、石蜡组织切片的免疫组化方法：密封保存于RT的组织切片?二甲苯(1) 20 min?二甲苯(2) 20 min?100%乙醇20min?95%乙醇10 min?80%乙醇10 min?通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈?切片在PBS中浸泡 5 min*2?0.4%Tritonx RT 10 min?切片在PBS中浸泡 5 min*33%H2O2 RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*30.25%胰酶RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*3Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min倾去blocking buffer，勿洗一抗4?C overnight in blocking buffer取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h切片在PBS中浸泡 5 min*3DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）如果是增强型DAB只要1min即可。

石蜡切片步骤取材：将目标组织样按要求修剪至一定大小。

固定：用10%的福尔马林溶液固定组织样4-6h。

脱水：梯度酒精50% 2h70% 2h80% 2h95% 2h95% 2h100% 40min100% 40min透明：二甲苯Ⅰ 8min二甲苯Ⅱ 5min （观察组织，透明度较好为宜）浸蜡：（蜡温保持在60℃）软蜡Ⅰ 50min软蜡Ⅱ 50min硬蜡Ⅰ 50min硬蜡Ⅱ 50min硬蜡包埋切片：组织化学切片 4μm常规切片 5μm烘片：65℃脱蜡至水：二甲苯Ⅱ 5min二甲苯Ⅰ 5min梯度酒精至水100% 3min100% 3min95% 3min95% 3min80% 3min70% 3min50% 3min染色：1.常规HE染色苏木素 10min自来水洗 5min盐酸酒精分化 10s自来水洗返蓝 10min伊红 1min自来水洗 5mins蒸馏水 1mins2.免疫组织化学染色1.抗原的修复：柠檬酸缓冲液95℃。

time2.消除内源性过氧化物酶：3%的H2O2的甲醇溶液孵育3min。

PBS（10mM磷酸钠，150mM 的氯化钠，pH7.4）洗涤3*3min3.封闭：5%BSA封闭30min。

洗涤3*3min4.加生物素标记的凝集素：用生物素标记的凝集素溶在大约2-20μg/ml（梯度稀释的以找到最合适的浓度）的PBS中，加在切片上然后在室温下孵育30min。

TPBS 洗涤3*3min。

1h混合ABC5.ABC试剂孵育30min。

（现配）TPBS洗涤3*3min。

6.加辣根过氧化物酶标的亲和素：加在切片上后在室温下孵育30min。

TPBS洗涤3*3min。

7.显色DAB：含3%的H2O2的DAB显色10min。

TPBS洗涤3*3min。

结合镜下观终止反应，蒸馏水冲洗。

苏木精衬染 10min蒸馏水洗涤5min盐酸酒精分化10s（视颜色而定）自来水返蓝4min梯度酒精脱二甲苯水透明封片光镜下染色计数，清洁，封片。

石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案石蜡标本固定、脱水、包埋方法大鼠自心脏灌注4%多聚甲醛内固定1-2h后取材：取脑出血血肿处脑组织（厚度约3mm），置于塑料盒中并浸泡在4%多聚甲醛中固定，室温中固定时间12-48h，固定好的组织脱水前应流水冲洗30min-1h左右除去固定液，取固定好的脑组织标本脱水、包埋。

具体步骤按以下方法进行：此方法参考《组织病理学技术》周庚寅北京大学出版社 2006年⏹70%： 1h-2h⏹80%： 1h-2h⏹90%： 1h-2h⏹95%： 1h-2h⏹95%： 1h-2h⏹无水Ⅰ：30min-60min⏹无水Ⅱ：30min-60min⏹二甲苯及水水酒精 1：1混合液 30min⏹二甲苯Ⅰ：30min⏹二甲苯Ⅱ：30min⏹石蜡Ⅰ： 1h⏹石蜡Ⅱ： 1h⏹石蜡Ⅲ： 1h包埋：在病理科包埋方法基础上灵活改进：在包埋铁模具上进行，融蜡-放置组织于中央-扣包埋盒4℃冷却10min-撬蜡。

注意事项：1、固定液的种类：10%中性甲醛，4%的多聚甲醛最合适，在37°或室温中固定12-48h能很好保存抗原和抗体的反应能力，实验室用的更多的是在4℃冰箱中固定24h-3d。

有人建议中性甲醛40摄氏度固定2~3小时，流水冲洗20min-30min，这样可以缩短制片的时间。

2、熔蜡温度65 ℃左右；3、严格按照预定实验步骤进行，保证脱水及透明完全，透明后见云雾状说明脱水不完全，需退回无水酒精中返工。

4、经一级二甲苯透明后检查组织是否透明，二级二甲苯透明时间以具体时间而定。

5、注意及时更换梯度酒精及二甲苯（1月）。

组织石蜡切片摘自《免疫组织化学实验技术及应用》 P12 化学工业出版社20061.载玻片的处理：采用现成的APES处理过的硅化载玻片。

2.石蜡切片注意事项：1、用于免疫组化的蜡温应为56~58℃，切片水温为40℃左右，应先置于冷水中（冷水中可参入酒精有利快速展片-见相关方法），然后再移入热水中，这样可以使切片顺利展平；2、烤片时要注意：一般在62℃烤片30-60min，抗原较强的组织可在60摄氏度烤3~8h，抗原较弱的组织可于37℃的恒温箱内过夜；3、切片如需长期保存，可置于4℃或室温下，千万不可脱蜡后4℃保存，因脱蜡后失去了对抗原决定族的保护。

石蜡切片免疫组化染色步骤-回复石蜡切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于检测组织中特定蛋白质的表达和定位。

通过特定抗体的结合，可以在组织切片上形成可见的染色反应，从而了解细胞分布、形态和功能。

本文将一步一步介绍石蜡切片免疫组化染色的详细步骤。

第一步：取材固定首先，需要取得要进行免疫组化染色的组织样本。

可以是新鲜组织，也可以是经过福尔马林或其他适当的固定剂固定后的组织。

固定的目的是固定细胞内蛋白质的结构，以保持其形态和抗原性。

固定过程中要避免产生过度固定，否则可能会破坏细胞结构和抗原的特异性。

第二步：组织脱水和浸渍将固定好的组织样本进行脱水和浸渍。

脱水的目的是去除组织中的水分，使其能够与石蜡充分相溶。

浸渍的目的是使组织均匀地吸收石蜡，以便切片时组织能够坚固并保持形态。

一般的脱水和浸渍步骤包括用不同浓度的酒精进行脱水，然后使用清洁剂和石蜡浸渍组织。

第三步：包埋和切片经过浸渍的组织样本需要进行包埋，以保持其形态和结构。

将组织样本放置在浸渍好的石蜡中，使其充分浸透，然后将其放置在冰上使石蜡固化。

固化后的组织样本可以用切片机切成非常薄的切片，通常是4-6μm。

切片质量对于后续的免疫组化染色非常重要，所以要确保切片的平整和完整。

第四步：切片除蜡和重现组织抗原切片除蜡是为了去除包埋后留在组织切片上的石蜡，以便进行后续的染色。

一般使用酮或甲醇进行除蜡，然后通过多次水洗将组织切片充分清洗。

重现组织抗原则是为了使切片上的抗原能够被抗体检测到。

根据抗原的性质和检测的目的，可以选择适当的方法进行重现组织抗原，如酶解、蛋白酶解或热诱导抗原修复等。

第五步：抗体孵育将免疫组化染色所需的一抗加在切片上，与切片中的特定抗原发生特异性结合。

孵育时间和温度根据抗体的性质和抗原的稳定性来确定，一般在室温下孵育数小时或过夜。

抗体孵育结束后，使用缓冲液或PBS洗涤切片，以去除未结合的抗体。

第六步：二抗孵育和信号检测在一抗的基础上，可以使用与一抗来源不同物种的二抗来进行信号放大。

分子量为389，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波 长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，是目前应用最广泛 的荧光素。 2.四甲基异硫氰酸罗达明 （tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC）
分子量为444，最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为 620nm，呈现橙红色荧光。
②选用含有放大作用的酶的免疫组化染色方法： 如碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）对底物（substrate）
的作用随时间的增加而增加，可选用含碱性磷酸酶的EnVision两 步法或APAAP法。
③增加抗体的孵育时间：一般采取4℃过夜的方式。
四）非特异性染色的来源及消除
1.标本固定不适当或不充分 丙酮固定的标本，尤其是它的冰冻切片标本，有极强的非特异性 染色。应选用适当的固定剂及充分固定。
四）胶体金（colloidal gold）
又称金溶胶（gold solution），是指分 散相粒子直径在l—150nm之间的金溶胶， 能稳定又迅速地吸附蛋白质，可以作为 标记物标记抗体、抗原、激素、核酸等， 在药物检测、生物医学等许多领域有广
三、组织标本的制备
一）组织标本的取材
取材原则:尽可能快的切取所需组织浸入固定液或快速冰冻,保持 组织的新鲜以最大限度地防止抗原破坏和降解。
2.间接法（indirect method）： 荧光素不是标记在与标本中相应
抗原结合的特异性抗体上，而是 标记在抗特异性抗体的第二抗体 上。
优点：敏感性高 缺点：特异性低
二）免疫酶法 1.直接法或一步法(direct method or one-step staining method)
用标记了酶的特异性抗体直接与标本中相应的抗原结合，以酶底 物的反应显示抗原的分布。 2.间接法(indirect method)：

石蜡切片免疫组化步骤
一、石蜡切片的制备
1、准备石蜡
用烧杯中加入12mL的苯溶剂和8mL的石蜡，加热至融化，将融化的石蜡移植到一块热板上继续加热，以便从热板上取出细薄的膜层，用磨刀涂抹，然后将用涂抹磨刀涂抹的膜层置于蜡块上，将有载体细胞囊毛细管夹在由石蜡制成的膜层和热板之间，着色后再将膜层回置回蜡块上。

2、去除细胞浆
将制备好的石蜡切片放入10％氯化苯甲酸至50％酒精溶液中，让细胞进行脱脂，去除细胞浆，然后将液体放入烧杯中，煮沸5分钟，再放入70％酒精溶液中，洗去残留的脱脂液，最后放入稀盐酸洗涤，洗去残留的蛋白质。

3、着色
将石蜡切片放入适当浓度的着色液中（如酚酞-HA，库仑染料，组织染料等），煮沸着色3-5分钟，放入稀盐酸洗涤，进行染腐去色，将残留的着色液除去，把腐蚀后的石蜡切片放入稀乙醇中，使其着色深度稳定，待用。

二、石蜡切片免疫组化实验
1、抗体的准备
首先根据实验要求，准备抗体。

石蜡切片免疫组化实验方法预处理：1.收集组织样品：选择实验需要的组织样品，如病变组织或动物组织，固定在4%的中性缓冲福尔马林溶液中，通常时间为24小时。

2.脱水：将固定的组织样品进行脱水处理，使用升级的乙醇浓度，如70%乙醇、85%乙醇和95%乙醇各浸泡5-10分钟，然后在无水乙醇中浸泡2-3次，每次浸泡时间为10分钟。

3.渗透剂处理：将组织样品置于染料渗透剂（如苯酚甲醛、苯酚）中进行渗透处理。

渗透剂的选择根据实验需要的类型来确定。

4.包埋：将已经渗透处理的组织样品放入合适大小的模具中，加入石蜡进行包埋，通常使用两次石蜡浸渍15-20分钟，然后定位标本，放入包埋模具中。

切片：1.切片机调节：根据具体的切片机和刀片的不同，调节适当的角度和切片速度。

2. 切片：将包埋好的组织块放入切片机的切片盘中，以适当的角度切出厚度约为4-6um的石蜡切片，切片时需要保持刀片的清洁，避免刮伤组织。

3.切片回收：使用刀片回收装置将切下的切片轻轻回收至水中，再将切片转移到预处理盒中。

染色：1. 去蜡：将石蜡切片放入脱蜡溶液（如xylene）中进行脱蜡处理，每个浸泡站点持续3-5分钟。

2.脱水：将石蜡切片从脱蜡溶液中取出，放入浓度递减的乙醇溶液中，分别浸泡5分钟，如95%乙醇、70%乙醇和纯水。

3.抗原修复：为恢复组织切片的抗原表位，可以选择酶消化、高压加热或微波处理等方法来进行抗原修复，常用的抗原修复方法包括热处理和酶切法。

4.屏障消除：为了阻止非特异性结合，需要进行屏障消除，使用5%非脂干奶粉或血清进行预阻断，通常需要在37°C孵育1小时。

5.一抗处理：将相应的一抗加入切片上，覆盖玻璃片，通常需要在4°C下孵育过夜。

6.洗涤：用洗涤缓冲液对切片进行洗涤，通常重复3次，每次5分钟。

7.二抗处理：将荧光标记的二抗加入切片上，覆盖玻璃片，通常需要在室温下孵育1小时。

8.洗涤：用洗涤缓冲液对切片进行洗涤，通常重复3次，每次5分钟。

石蜡切片免疫组化染色步骤 1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极 易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的 ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM 或 ZLI-9005 Poly-L-Lysine 等几种试剂，对 已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES： 现用现配。 将洗净的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀释的 APES 中，停留 20~30 秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮 去未结合的 APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意 组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀释的 Histogrip 液中， 停留 1~2 分钟， 然后用双蒸水快速清洗三次， 室温干燥或 60oC 烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以 1:10 比例去离子水稀 释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡 5 分钟，60oC 烤箱烘烤一小时或室温 过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶： 一般使用浓度为 0.05%~0.1%， 消化时间为 37℃、 10~40 分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为 0.4%，消化时间为 37℃、30~180 分 钟， 主要用于细胞间质抗原的显示， 如： Laminin （层粘蛋白） ， Collagen IV（IV 型胶原）等。
加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游 离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分 离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测 F/P 比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用 20%磺基水杨酸测定 蛋白（发生沉淀反应） ，继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来， 至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。 若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类， 可先在过 柱前透析一夜， 否则， NH4+太浓， 在蛋白未完全洗脱时即出现 NH4+， 因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集， 之后出现 SO4++ （用 1%BaCl2 检查发生白色沉淀） 。 最后是 NH4+， （用 纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀） ，待洗脱液无 SO4++及 NH4+后可再用。 如仅用小量荧光抗体， 可用 1×20cm 的柱层析柱， 取 2g Sephadex G-50 装柱，即可过滤 2～3.5ml 荧光抗体。 （四）DEAE 纤维素柱层析法 标记过多或过少荧光素的抗体分子可用 DEAE-纤维素柱层析法除 去。方法如下： DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯 IgG 方法相同。 装柱所需 DEAE-纤维素量以干重每克交换 20～50mg 标记蛋白量为宜。 常用梯度洗脱法如下： （1）层析柱用 0.01mol/L、pH7.2PB 平衡，标记物上柱后，先用 0.01mol/L、pH7.2PB 洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据 床体积大小每梯度乘 3） ，然后依下列各种离子强度洗脱液，分别洗

免疫组化实验步骤集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]石蜡切片免疫组化实验步骤石蜡切片步骤按照晓峰整理的步骤进行（From徐晓峰、朱老师的“石蜡切片”方案）：1）材料的准备在本实验室条件下推荐使用FAA（50%ethanol,5%aceticacid,3.7%甲醛）固定材料。

FAA固定液（100ml），室温保存：无水乙醇50ml冰醋酸5ml37%甲醛10ml水35ml第一天：组织固定用FAA固定，详见“石蜡切片”protocol。

第二天：脱水以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4℃冰箱等待，并不时轻摇。

*组织可在70%ethanol4℃可存放几个月第三天：进一步脱水和浸蜡以下所有步骤在4℃进行并不时轻摇以下所有步骤在室温进行并不时轻摇准备工作：60℃预热plus蜡片（ParaplastPlus）石蜡可反复融凝而去气泡第四天：浸蜡2将材料置于42℃直至蜡块完全熔化。

再加1/4体积的蜡块至完全熔化后移至60℃。

几个小时后换上新鲜熔好的蜡液，过夜。

第五天：浸蜡3换蜡两次（ParaplastPlus）第六天：浸蜡4换蜡两次（ParaplastPlus）第七天：浸蜡5换蜡两次（ParaplastPlus）准备工作：60℃预热Regular蜡片（ParaplastRegular）第八天：包埋（包埋块可长久保存）第九天及之后：开始切片，切片应包括自己的片子及正负对照等。

事先打开烘片机至37度，在涂有多聚赖氨酸的玻片上加1~2ml的蒸馏水。

切好的片子轻至于加水的玻片上。

待所有片子准备完之后盖上盖子，烘片过夜。

用自来水及双蒸水清洗免疫组化专用塑料，放在烘箱烘干待用。

第二天：开始脱蜡（From徐晓峰、朱老师整理的“石蜡切片”protocol）（用新买来的免疫组化塑料小盒，每一步只需加入试剂220~250毫升）抗原修复：在切片还浸入酒精时，可以事先将煮锅清洗干净，用蒸馏水洗1~2遍，最后加入0.01M柠檬酸钠缓冲液(PH=6.0)，煮沸(保持在95度左右)，将过完PBS的片子让入煮沸的锅中，煮片10~15min。

六、抗体的购置及注意事项 1.抗体的购置目前商品化抗体已有上千种，一种抗体可以有数家公司生产，其质量的好坏也存在很大差异，首先应选择一家好的生产公司，根据文献提供的信息，选择所需试剂的型号。

2.购置抗体的注意事项 (1)种属：单克隆抗体，多克隆抗体 (2)能否用于石蜡切片 (3)稀释度 (4)特异性，交叉反应 (5)用何种组织前处理形式 (6)包装单位，价格3.抗体的大致分类 (1)癌基因与抗癌基因标记物；(2)细胞凋亡标记物； (3)各种信号传导标记物 (4)各种正负调控基因标记物 (5)细胞增殖及调控标记物；(6)凝集素类标记物 (7)激素受体标记物 (8)病毒性标记物 (9)各类肿瘤标记物 (10)耐药基因标记物七、抗体最佳稀释度的测定和保存1.直接测定法3.抗体稀释液抗体稀释液是从事IHC工作实验室必备，其制备方法如下：1克明胶(红、绿)溶在300ml 0.2M pH7.6 TBS中，加温，搅拌使其溶解，待其冷却后，加入1克牛血清白蛋白和100mg NaN3，4℃保存。

4.抗体的保存商品化一抗或自制一抗均需加入防腐剂，在4℃中保存一年其质量不会有太多的改变，如一次购置量大，可10μl/支分装，标上号，-40℃保存备用。

用抗体稀释液稀释一抗可在4℃中保存一年。

1.HRP常用的发色基因： (1)3、3’-二氨基联苯胺盐酸盐(3、3’-diaminbezidine;DAB);(2)3-氨基-9-乙基卡吧唑(3-amino-9-ethlylcarbazde;AEC);(3)四甲基联苯胺；(4)盐酸对苯二胺；(5)4-氯-1-萘酚；(6)高香草酸(7) α–萘酚派若宁2.AKP常用的发色基团：(1)BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸)＋NBT(硝基四氮唑蓝)； (2) α–萘酚AS-BI 磷酸盐＋快红或快蓝。

3.配制方法 (1)DAB:50mg DAB溶在0.01M pH7.6 100ml Tris-Hcl中，加入0.03% H2O2，显色8～12min，终产物为不溶性棕褐色颗粒状。

免疫组化（IHC）经验超全总结做过病理实验的人都知道，实验看似容易，但真想把它做好，还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验。

我从事病理实验已有6年多了，在这段时间里，我做过许许多多病理相关实验，刚开始啥也不懂，一味按照网上操作流程来做，但做的结果往往并不是十分理想，最终结果未能达到预期的效果。

经过一段时间的浏览和学习，在论坛内学习、请教，并结合实践操作，我经历了初级——查找资料和摸索方法；中级——问题求助和不断总结；高级——难题解答和经验分享这三个阶段，也学到了不少知识，积累了很多宝贵经验，与大家一起分享。

一、石蜡切片和冰冻切片的比较？1.要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。

因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。

2.冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。

缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。

当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。

3.石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80oC的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。

由于石蜡切片可以切到4μm左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。

1.单克隆和多克隆抗体的选择。

由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。

单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。

另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。

在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。

病理检验技术江汉大学医学与生命科学学院病理学与病理生理学教研室2004年4月内容提要本书介绍组织病理学常用的多种技术。

包括常见的技术，即福尔马林固定、石蜡包埋、HE染色技术，同时也介绍了常用的特殊染色技术，免疫组织化学技术，并简明地介绍了分子生物学技术的基本理论以及在组织病理学中的应用。

全书理论与实践并重，经典与改良结合，内容丰富，通俗易懂，实用性强，为实验室工作的必备参考书。

适合从事病理学、组织学、生物学、法医学等的科研教学和临床工作的技术人员、教师、医师和研究生使用。

同时也适合临床医学检验专业中专、专科生使用以及临床医学专业专升本学生和临床医学专业本科生选用。

第一篇石蜡切片技术第一章组织标本的处理第一节取材 (5)第二节组织的固定 (6)第三节大体标本的处理和固定 (14)第四节陈列标本的固定 (15)第五节脱钙 (16)第六节组织的冲洗 (18)第二章石蜡包埋技术第一节脱水 (19)第二节透明 (21)第三节浸蜡 (22)第四节包埋 (22)第三章切片技术第一节切片刀 (25)第二节切片机 (27)第三节石蜡切片的制作 (27)第四节特殊组织石蜡切片的制作 (29)第五节石蜡切片的异常及处理 (29)第四章染色与染色剂第一节染色的基本原理 (31)第二节染色剂染色的化学基础 (33)第三节染色剂的分类 (34)第四节常用染色剂及配制 (35)第五节苏木素—伊红染色法 (39)第六节封固剂 (41)第五章特殊染色技术第一节结缔组织染色法 (43)第二节脂类染色法 (47)第三节糖原及粘液染色法 (48)第四节色素染色法 (50)第五节神经组织染色法 (52)第六节核酸及核蛋白染色法 (52)第七节肌肉组织染色法 (53)第八节病原微生物染色法 (54)第九节特殊染色技术的应用 (57)第二篇免疫组织化学和亲和免疫组织化学技术第一章免疫组织化学技术第一节基本原理 (62)第二节染色步骤 (67)第三节常用试剂的配制 (72)第二章亲和免疫组织化学技术第一节基本原理 (77)第二节染色步骤 (80)第三篇分子生物学技术第一章核酸原位杂交技术第一节核酸原位杂交的基本原理 (83)第二节核酸原位杂交的主要过程 (84)第三节核酸原位杂交的基本操作步骤 (86)第四节常用试剂的配制 (87)第五节核酸原位杂交的应用 (89)第二章原位PCR技术第一节基本原理 (91)第二节基本类型 (91)第三节基本步骤 (92)第四节原位PCR技术的应用 (93)第一篇石蜡切片技术切片技术的应用到现在已有一百年多的历史了。

石蜡切片免疫组化实验方法
石蜡切片免疫组化实验是一种常用的病理组织学方法，用于确定特定的抗原在组织中的位置和表达水平。

以下是石蜡切片免疫组化实验的具体步骤：
1.组织处理。

将取得的组织标本固定在10%的中性缓冲福尔马林中，并进行脱水、浸透及包埋处理，以确保组织样本可以与石蜡相容。

2.石蜡切片制备。

将包埋好的组织样本切成4-5um厚的薄片，并贴附到玻片上，以备后续免疫组化处理。

3.抗原复性。

将石蜡切片置于解离液中，均匀受热数分钟，使样本中的链状分子断裂，恢复抗原的免疫活性。

4.抗体处理。

将待检测的抗体加入到样本中，充分混合并孵育一段时间，以实现抗原与抗体的免疫反应。

这里要注意，不同的抗体使用的孵育时间和检测温度也不同。

5.二次抗体处理。

在完成抗体处理后，将与一级抗体相结合的二级抗体（比如HRP等）加入样本中，进一步实现免疫反应并标记待测抗原。

6.染色处理。

将待检测的免疫活性抗原染色，可以用一些特定的染料，比如DAB染料等。

7.显微镜观察。

最后，将石蜡切片置于光学显微镜下，观察抗原的表达情况，并根据染色结果分析样本中目标抗原的表达、分布和数量。

石蜡切片免疫组化步骤（整理）石蜡切片免疫组化步骤1.脱蜡复水二甲苯1（10min）二甲苯II （10min）二甲苯III （10min）无水乙醇I （10 min）无水乙醇II （5min）95％乙醇（5min）70％乙醇（3min）50％乙醇（3min）30％乙醇（3min）1X PBS浸泡（5min）。

2.抗原修复a.将抗原修复液（250ml）加入开口容器中，放入微波炉中高火（9档）6min左右沸腾，然后将玻片放入后，使用低火（3档）4min，微波炉中冷却5min，重复三次。

（注意液面是否下降，如是需补充等温的缓冲液，或可放置一杯蒸馏水在微波炉中同时加热。

）从微波炉中取出，室温等待缓冲液彻底冷却后（大约30-45 min），取出玻片。

TIP：修复液（柠檬酸：0.1g，柠檬酸钠：0.75g，溶于250mL去离子水）。

b. 用PBS洗（浸泡或冲洗）三次，每次5min。

（期间用组画笔（疏水性油性蜡笔）圈出阻止范围，以节省抗体）。

Tip：抗原决定簇在4％PFA固定过程中遭到破坏，因此需要复性过程以使抗原决定簇重新暴露出来，利于抗体结合。

3. 封闭封闭液为5% 的二抗同源血清，配方为：[940 μl 1xPBS + 50 μl serum + 10 μl 10% BSA]室温封闭1h，在湿盒中进行。

结束后将载玻片竖立于吸水纸上，去除封闭液。

不需要洗！Tip:从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景Tip：如不使用二抗同源血清，也可使用3％~5％BSA进行封闭。

Tip：封闭作用：空间占位。

BSA能非特异性的与表面抗原决定簇结合，这样特异性的抗体就不会与非特异性的抗原结合，以降低背景。

Tip：The secondary antibody may cross react with endogenous immunoglobulins in the tissue. Minimize this by pre-treating the tissue with normal serum from the species in which the secondary was raised.Tip：The use of normal serum before the application of the primary also eliminates Fc receptor binding of both the primary and secondary antibody. BSA is included to reduce non-specific binding caused by hydrophobic interactions.4.孵育一抗一抗稀释液：dilution in 0.1% serum, 0.1% BSA in 1xPBS [989 μl 1xPBS + 1 μl serum + 10 μl 10% BSA]。