免疫组化实验步骤

免疫组化实验步骤流程1.样品制备：a.组织样品：从动物或人体获得的组织样品首先需要固定在福尔马林中，然后通过蜡包埋技术将组织固定在蜡块中。

之后，将蜡块切成薄片，然后将薄片分别放置于载玻片上。

b.细胞样品：将细胞悬浮液放置在载玻片上，并用福尔马林进行固定。

2.抗原恢复：固定的组织或细胞样品经过脱水和脱脂处理后，需要通过抗原恢复来揭示隐藏的抗原。

抗原恢复的方法可以是热处理、酶切或化学处理等。

3.形成蛋白结合位点：将载玻片上的样品用蛋白结合剂如牛血清白蛋白（BSA）、鱼胶或生物素素蛋白结合剂等进行封闭处理，以防止非特异性结合。

4.孵育抗体：a.主抗体：将特异性的首要抗体加入到样品中，与目标抗原结合形成抗原抗体复合物。

b.辅助抗体：添加荧光素或酶标记的次抗体，与主抗体结合，以扩大信号的产生。

5.洗涤：用缓冲液洗涤载玻片，以去除未结合的抗体和其他无关物质。

6.信号增强：a.酶标记的实验，为了增加信号强度，可以加入荧光素或发光底物。

b.荧光标记的实验，可以直接观察荧光。

7.显色：在酶标记的实验中，加入染色底物以产生可见的颜色，从而定位并显示目标抗原的存在。

8.盖玻片：在涂抹适当封片剂后，将载玻片盖上一片封片玻片，以保护样品并减少光的干扰。

9.显微镜观察：使用显微镜观察载玻片下的样品，并通过图像系统进行图像捕捉和分析。

10.结果评估：评估图像和数据以确定抗原的表达和分布情况。

根据实验目的，可以进行半定量或定量的数据分析。

需要注意的是，免疫组化实验中的条件、试剂和步骤会因实验目的不同而略有差异。

因此，在进行实验前需仔细阅读相关文献和制定适合的实验方案，以确保实验结果的准确性和可靠性。

免疫组化步骤1. 多聚甲醛灌流取材,多聚甲醛后固定,30%多聚糖溶液沉糖;2. 冰冻切片1d-14d 脊髓>=20μm;14d-28d>=10μm;DRGd=10μm3. 0.01MPBS 洗10min ×3次;4. 1NHCL 暴露抗原30min ；5. 去离子水洗,0.01MPBST 洗10min ×3次；6. 3%双氧水0.01MPBS 配制洗10min,灭活内源性HRP ；7. 0.01MPBST 洗10min ×3次；8. 5%-10%血清封闭30min0.01MPBST 配制；9. 一抗过夜,一抗用PBST 稀释；10.0.01MPBS 洗10min ×3次,二抗3孵育小时； 11.0.01MPBS 洗10min ×3次,HRP-亲和素3小时； 12. 0.01MPBS 洗10min ×3次,DAB 显色12-18min.免疫组化常用试剂配制1. 0.1MPB:14.5gNa 2HPO 4·12H 2O500mLH 2O1.5gNaH 2PO 4·2H 2O2. 0.1MPBS:500mL0.1MPB45gNaCl3. 0.01MPBST:100mL0.01MPBS10滴TritonX-1004.INHCL:盐酸：水=1：105.4%多聚甲醛：13.6gKH 2PO 43.6gNaOH40g 多聚甲醛1000mLH 2O注：1.需要60°C 加热溶解,过滤使用；2.多聚甲醛每次比需要多称10g,以弥补后面过滤的损失；3.现将多聚甲醛溶于1000mL 水中,然后一边加热搅拌一边缓慢加入多聚甲醛的助溶剂NaOH,待NaOH 和多聚甲醛都完全溶解后再加入KH 2PO 4,溶后过滤备用.6.DAB 液：以0..1MPB 配制,DAB 浓度0.05%,H 2O 2浓度0.03%.注：1.H 2O 2临用时再加；2.用DAB 染后用0.01MPB 洗.7.30%蔗糖：150g 蔗糖500mL4%多聚甲醛注：可同时沉糖后固定.8.封闭液：10%山羊血清做免疫荧光时另加0.1%BSA.。

最新文件---------------- 仅供参考--------------------已改成-----------word文本 --------------------- 方便更改免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。

3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0, 加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0, 加水1000ml。

5. 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。

b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

1.PBS冲洗5min×3次
2.加修复液，低温加热10min/高温2min
3.室温冷却10min
4.PBS冲洗5min×3次，用滤纸吸干PBS
5.滴加试剂A（封闭用正常山羊血清工作液），湿盒内室温孵育15min
6.一抗稀释
预实验：Anti-MGMT 1:100 1:200 1:400
Anti-XRCC1 1:100 1:200 1:400
Anti-P53 1:50 1:100 1:200
正式试验：Anti- MGMT 1:400
Anti-XRCC1 1:400
Anti- P53 1:100
7.滴加上述稀释好的一抗，4℃过夜
8.滴加二抗试剂B（生物素标记山羊抗兔IgG），室温孵育20min
9.PBS冲洗3min×3次，用滤纸吸干PBS
10.滴加试剂C（辣根酶标记链酶卵白素），室温孵育20min
11.PBS冲洗3min×3次，用滤纸吸干PBS
12.DBA显色，在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液。

13.自来水冲洗10min
14.苏木素复染
15.自来充分水冲洗，蒸馏水浸泡2min
16.酒精梯度脱水3min×7次
17.透明，二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min
18.树胶封片，80℃烤箱烤干。

HE染色
1.苏木素染色10min，自来水充分冲洗。

2.伊红染色2min，自来水充分冲洗
3.酒精梯度脱水3min×7次
4.透明，二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min
5.树胶封片，80℃烤箱烤干。

免疫组化实验步骤完整版步骤1：标本采集和固定首先，需要从待检测样本中采集组织或细胞。

可以使用手术切片、活体组织、培养的细胞等作为标本。

然后，将采集的样本固定在载玻片或切片上，以保持其结构和形态的完整性。

步骤2：抗原暴露和体细胞抗原消除接下来，需要处理标本以使抗原裸露出来，并消除非特异性的抗体结合和细胞膜结合的抗原。

这一步骤常常涉及对组织或细胞的预处理，例如用石蜡脱脂、酶解抗体和孵化等。

步骤3：抗体特异性结合选择特异性的抗体用于检测待测蛋白质。

这些抗体可以是直接标记的一抗，或间接标记的二抗。

一抗是专门与目标抗原结合的抗体，而二抗则可以与一抗结合，以提高信号的灵敏度和特异性。

这一步骤中还需要选择适当的阴性对照，即未携带待检测抗原的样本。

步骤4：探针检测根据需要，可以使用不同的探针来检测目标分子。

常用的探针有标记的一抗、荧光探针、放射性标记物等。

标记的一抗可以直接结合抗原，然后使用染色剂进行可视化；荧光探针则通过荧光显微镜进行检测；放射性标记物可以通过放射自显影等方法进行检测。

步骤5：显色和对比计数将荧光、酶标记或放射性标记的物质显色，以便于检测和计数。

在染色的过程中，需要防止非特异性的染色，例如使用阻断剂、胶原等。

步骤6：结果分析根据观察到的染色强度、分布模式等结果，分析待测蛋白质在样本中的表达情况。

这可能需要与阴性对照和阳性对照进行比较，以确定实验结果的可靠性。

步骤7：图像捕获和分析使用显微镜或其他成像设备，将荧光、染色或放射性标记的图像捕获下来。

可以使用图像分析软件来计算和比较样本中的染色强度、面积等参数。

步骤8：数据统计和结果报告根据实验结果进行数据统计和分析，并将结果记录在报告中。

报告应包括样本信息、实验方法、结果和结论等内容，并根据需要进行解释和讨论。

总结：免疫组化实验是一种广泛应用于研究、诊断和治疗的方法。

它的步骤包括标本采集和固定、抗原暴露和体细胞抗原消除、抗体特异性结合、探针检测、显色和对比计数、结果分析、图像捕获和分析、数据统计和结果报告。

免疫组化流程
免疫组化是一种生物技术，用于研究一个或多个蛋白质的交互性及它的细胞上的定位，从而探究蛋白质在复杂的细胞环境中的功能及其作用机制。

免疫组化是以抗体作为特异性
捕获识别分子的标记物，以检测某一特定的蛋白质在细胞中的形态分布，其主要分为三个
步骤：样本处理、抗体淬取和检测荧光。

1. 样本处理：由于免疫组化需要在细胞环境下完成实验，所以在处理样品前，先要
将细胞或组织悬浮，再利用活细胞分离技术将其分离出来，以制备出水平固定、正常形态
的细胞阵列。

2.抗体淬取：抗体淬取是查找蛋白质在细胞中的分布的主要步骤，将具有指示特定蛋
白质的特定抗体喷射在分离的细胞上是大多数实验的基本过程，抗体可以通过多种不同的
方法混合到细胞上，例如管接收、块接收和碰撞接收。

3.检测荧光：检测荧光是一种利用荧光探针标记抗体和膜蛋白，在荧光显微镜上观察
膜蛋白的分布情况，字膜上的膜蛋白和脱离细胞膜的膜蛋白也可以由不同颜色的荧光探针
标记，从而确定膜蛋白的分布情况。

以上三个步骤合在一起，就能完成免疫组化实验，从而检测蛋白质在细胞中的空间分布，免疫组化还可以用来分析蛋白质如何在细胞周围的其他分子之间相互作用。

这个实验
技术具有高灵敏度、可重复性强和节省时间等优点，可以大大提高细胞内目标蛋白质的分
析能力，同时为细胞医学研究和更深入地研究细胞功能提供重要的实验证据。

免疫组化（IHC）实验具体步骤及说明一、试剂和溶液乙醇: 无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇抗原修复液: 0.01M 的柠檬酸钠缓冲液：58.82g 柠檬酸三钠及7.56g 柠檬酸溶于200ml 纯水，调pH 至6.0，纯水1:100 稀释为工作液3%过氧化氢-甲醇: 30%的过氧化氢与无水甲醇1:9 稀释10X PBS: 80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L 纯水，调pH 至7.4 洗涤液: 1×PBS：纯水稀释10× PBS；1× PBST：含0.05% Tween-20 的1×PBS（1×PBST）super block，生物素标记的UltraTek Anti-Polyvalent 二抗，酶标亲和素UltraTek HRP，DAB 显色试剂盒：Cat. KT1002a 抗体稀释液：3%BSA-PBS 0.5%盐酸-乙醇：0.5～1%盐酸，95.0-95.5%乙醇苏木素：苏木精2g 溶于250ml 无水乙醇，十六水合硫酸铝17.6g 溶与750ml 纯水，以上溶液充分混合，加入碘酸钠0.2g 和冰醋酸20ml二、实验步骤1.组织固定：烘箱温度65-75℃ 30min 或者65℃过夜；2.脱蜡：二甲苯浸泡三次，每次10 分钟；3.水化：依次经过无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇浸泡，每次5min；4.洗涤：自来水冲洗1 次，PBS 浸泡3min；5.抗原修复：放入稀释100 倍的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0) 中，高压锅煮沸10min，常温冷却30min；6.洗涤：纯水浸泡2 次，PBS 浸泡1 次，每次3min；7.灭活酶：室温下3%过氧化氢-甲醇暗处处理切片15min；8.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；9.封闭：加入适当体积的super block（KT1002a Reagent A），37℃温箱孵育5min；10.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；11.一抗：加入反应体积为0.15ml，适合浓度的一抗, 37℃ 湿盒孵育60min。

一步法免疫组化实验步骤详解：
1.脱蜡：脱蜡要达到将原组织玻片上的石蜡充分脱掉的目的，加热只是为了加速石蜡的溶解；
二甲苯Ⅰ（15min 60度）-- 二甲苯Ⅱ（15min 60度)-- 100%乙醇（10min)--90%乙醇（5min）--80%乙醇（5min)--70%乙醇（5min）--蒸馏水（5min）
2.抗原修复（微波修复法）：目的是让蛋白抗原充分暴露
1）柠檬酸盐溶液：(PH：6.0) 500ml 不同的蛋白应采用不同的抗原修复条件，比如说膜蛋白PDGFRA 的煮沸时间不能过长；核蛋白KI67及包浆蛋白应充分煮沸；
2）EDTA修复液（PH：9.0）稀释后体积是500ml cox2及PDGFRA蛋白的抗原修复的效果较好；
3.清洗：PBS 5min*3次；
4.去除组织H2O2 酶：3%H2O2 37度10min；
5.清洗：PBS 5min*3次；
6.一抗孵育：4度过夜；
过夜--过夜--过夜--过夜--过夜
7.取出玻片盒，放置于室温复温30min（一般不做此步骤）；
8.一抗回收：将一抗回收标记清楚以备进行其他实验；
9.清洗：PBS 5min*3次；
10.孵育二抗：37度30min；二抗的添加主要是根据一抗的来源，抗鼠、抗兔或者其他；
11.清洗：PBS 5min*3次
12.DAB显色：DAB的显色时间主要取决于棕色颗粒的数目和浓度；一般在3min-10min之间；
13.复染：用苏木精染色，根据显微镜下核的深度来判断；
14.蓝化：将染过的核放在水中10min左右；
15.透明、封片：蓝化后的玻璃切片滴加中性树脂透明后封片；
16.放置于65度烤箱，烘干，观察实验结果。

免疫组化实验步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的存在和定位。

其步骤包括样本制备、抗原去原、阻断试验、一次抗体处理、二次抗体处理、显色和镜检。

下面将详细介绍每个步骤：1.样本制备：收集需要检测的样本，可以是细胞、组织或体液。

样本收集后，需要进行固定和切片处理，以保持细胞和组织结构的完整性。

2.抗原去原：蛋白质在组织中可能会被结构和其他因素影响，使其在免疫组化实验中难以被检测到。

因此，需要进行抗原去原处理。

常用的方法有热处理、酸碱处理、酶解处理等。

3.阻断试验：细胞和组织常常会存在非特异性结合位点，会使得后续的免疫反应变得模糊不清。

为了减少这种非特异性结合，需要进行阻断试验。

常用的阻断试验方法有牛血清白蛋白（BSA）、动物血清等。

4.一次抗体处理：在一次抗体处理步骤中，需要准备与目标蛋白质特异性结合的一次抗体。

将制备好的一次抗体加入样本中，使其与目标蛋白质发生反应，并形成抗原抗体复合物。

5.二次抗体处理：一次抗体只能与抗原结合，无法提供光学信号。

因此需要加入与一次抗体结合的二次抗体，该二次抗体与荧光物质或酶偶联，可以提供可视化信号。

常见的二次抗体有HRP（辣根过氧化物酶）、荧光染料等。

6.显色：通过加入合适的显色底物，可以使得与二次抗体结合的酶产生可见的颜色反应。

常用的显色底物有DAB（3,3'-二氨基联苯），其在酶的作用下会产生棕色的显色产物。

7.镜检：最后一步是使用光学显微镜对样本进行观察和分析。

通过镜检可以确定抗原存在的位置和分布情况，并对结果进行定量分析。

总结：免疫组化是一种确定蛋白质存在和分布的重要实验技术。

通过以上步骤的顺序操作，可以获得可靠的结果。

实验人员需要熟悉每个步骤的操作方法，并根据实验样本的要求进行调整和优化，以获得准确和可重复的结果。

细胞免疫组化实验步骤细胞免疫组化实验步骤：1）脱蜡与水化：将石蜡切片放置于60°烤箱烤片30-60min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢固地贴在玻片上。

而后依次将其放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各2min，水洗5min（不要直接对着切片冲洗）。

PBS洗3次，3 min/次。

2）细胞通透与封闭：用预热的封闭通透液（40ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸润切片30min（RT 避光），降低内源性过氧化物酶的活性。

PBS洗3次，3 min/次。

3）抗原修复：由于制作石蜡切片时，甲醛固定使得蛋白之间交联及醛基的封闭作用从而失去抗原性，这一步就是让胞内的抗原决定簇重新“满血复活”。

这里常用微波修复，pH 6.0的0.01M柠檬酸钠缓冲液浸泡切片，在微波炉里高火4min至沸腾后，取出自然冷却至室温，重复2次，每次补足液体以免干片。

（当然有的朋友用酶修复法也是可以的）。

PBS洗3次，3 min/次。

4）血清封闭：用与二抗同一来源的血清封闭一些非特异性结合位点。

此时可用“祖传”的油性笔围绕组织画圈，并对圈内的组织滴加稀释好的血清，37℃温箱中30min,用滤纸吸去多余的血清。

5）孵育一抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的一抗20ul，4℃过夜或者37℃1-2h。

PBS洗3次，3 min/次。

（一般4℃过夜后，需要将切片放置37℃复温45min，防止脱片以及可使抗原抗体结合的更稳定）6）孵育二抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的二抗20ul，37℃1-2h，PBS洗3次，3 min/次。

7）切片显色：用DAB-H2O2显色10min，显色液最好是现用现配，此时要通过显微镜观察染色是否明显，10min内即可用蒸馏水终止显色。

8）复染及封片：为了形成细胞轮廓，更好的定位目标蛋白，可用Mayer苏木素染色30s，水洗，盐酸酒精分化2s，流水浸入15min。

免疫组化法实验操作步骤步骤一：取材固定1.将需要处理的组织或细胞样本，如切片或离心沉淀等，放置在含有适当浓度的固定试剂（如4%的中性缓冲甲醛）中，使其固定。

2.这一步的目的是保持蛋白质的结构和形态，使其对后续步骤的抗体反应更加稳定。

步骤二：脱水和包埋1.将样本从固定试剂中洗涤，并逐渐转移到乙醇溶液中，以脱水。

2.将样本转移到适当浓度的透明剂（如甲基丙烯酸甲酯）中，使其透明化。

3.最后，将样本包埋在合适的固化剂（如尼龙、蜡、树脂等）中，以便后续的切片操作。

步骤三：切片和烘干1.使用组织切片机将样本以适当的厚度切成切片。

2.将切片放置在加热平台上，烘干以去除切片中的水分。

步骤四：抗体处理1.使用适当的抗体稀释液将抗体与切片接触。

抗体可为一抗或二抗，具体选择取决于实验需求。

2.将切片放置在含有抗体的湿润孵育盒中，使其与抗体反应。

孵育温度和时间取决于抗体的要求，一般在4℃下孵育过夜。

步骤五：洗涤1.将切片取出，并置于洗涤缓冲液中，用于去除未结合的抗体。

2.反复洗涤3-4次，每次至少5分钟，确保切片完全清洗。

步骤六：标记1.添加适当浓度的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与已经结合的一抗反应。

2.孵育切片与二抗共反应，孵育温度和时间根据试剂的要求进行。

步骤七：显色和染色1.使用合适的显色剂将切片进行显色。

常见的显色剂有DAB（二氨基联苯氧化物）和VIP（有机磷染料）等。

2.彩色染色可根据实验需求进行，可以使用核染料如伊红、快速伊红等对细胞核进行染色。

步骤八：石蜡去除和封片1.将切片浸入去石蜡溶液中，去除石蜡。

2.使用适当稀释的巴豆胶溶液将切片封闭，确保切片在显微镜下观察时保持湿润。

步骤九：显微镜观察1.将封片放置在显微镜载物台上，使用适当放大倍率的显微镜观察切片。

2.观察切片的染色情况、抗体标记的结果等，记录并进行分析。

这些是一般的免疫组化法实验操作步骤，根据具体实验需求和试剂要求，可能会有一些细微的差异和额外的步骤。

免疫组化试验步骤
免疫组化试验是一种常用的实验方法，以下是一般的免疫组化试验步骤：
1. 组织制备：将要分析的组织样本切片，通常使用冷冻切片或石蜡包埋切片。

2. 抗原解表：将切片进行脱变性处理，通常使用甲醛或乙醇溶液进行固定。

3. 抗体制备：选择合适的抗体，通常包括主抗体和辅助抗体。

主抗体可以是单克隆或多克隆抗体，用于特异性识别目标抗原。

辅助抗体主要是用于信号增强，如荧光标记或酶标记。

4. 抗体处理：将抗体溶液加到脱变性的切片上，使其与靶抗原结合。

可以进行孵育，增加结合效率。

5. 洗涤：使用缓冲液或洗液对切片进行多次洗涤，去除未结合的抗体。

6. 信号显现：根据实验目的，可以使用荧光信号或酶信号进行检测。

如果使用荧光信号，可以用荧光显微镜观察；如果使用酶信号，可以使用底物显色法，如DAB法或ABC法。

7. 洗涤：再次对切片进行洗涤，去除信号显现过程中的底物或荧光引物。

8. 盖片封装：将切片用透明胶片或硬化剂封装在玻片上，以保护样本。

9. 观察和分析：将封装好的切片放在显微镜下观察，并使用图像分析软件对结果进行定量分析。

以上是一般免疫组化试验的步骤，实际操作可能会根据实验目的与条件有所调整。

步法免疫组化实验步骤详解: 1•脱蜡：脱蜡要达到将原组织玻片上的石蜡充分脱掉的目的，加热只是为了加速石蜡的溶解；
二甲苯1（15min 60 度）--二甲苯15min 60 度）--100% 乙醇
（10min）--90% 乙醇（5min） --80%乙醇（5min）--70% 乙醇（5min）--
蒸馏水（5min）
2•抗原修复（微波修复法）：目的是让蛋白抗原充分暴露
1）柠檬酸盐溶液：（PH: 6.0） 500ml不同的蛋白应采用不同的抗原修复条件，比如说膜蛋白PDGFRA的煮沸时间不能过长；核蛋白KI67 及包浆蛋白应充分煮沸；
2）E DTA修复液（PH: 9.0）稀释后体积是 500ml cox2 及 PDGFRA!
白的抗原修复的效果较好；
3.清洗：PBS 5min*3 次；
4.去除组织 H2O2 酶：3%H2O2 37 度 10min ；
5.清洗：PBS 5min*3 次；
6•—抗孵育：4度过夜；
过夜--过夜--过夜--过夜--过夜
7•取出玻片盒，放置于室温复温 30min （—般不做此步骤）；
8•—抗回收：将一抗回收标记清楚以备进行其他实验；
9.清洗：PBS 5min*3 次；
10•孵育二抗：37度30min ；二抗的添加主要是根据一抗的来源，抗
鼠、抗兔或者其他；
11.清洗： PBS 5min*3 次
12.DAB显色：DAB的显色时间主要取决于棕色颗粒的数目和浓度; 一般在3min-10min之间；
13•复染：用苏木精染色，根据显微镜下核的深度来判断；
14.蓝化：将染过的核放在水中10min左右；
15透明、封片：蓝化后的玻璃切片滴加中性树脂透明后封片；16•放置于65度烤箱，烘干，观察实验结果。

免疫组化实验步骤1.溶解和固定样本：首先，将需要检测的细胞或组织样本固定在载玻片上。

最常用的固定剂包括甲醛和乙醇，固定时间可根据样本类型和大小来决定。

2. 渗透化处理：固定后的样本往往会产生较大的凝胶，渗透化处理是为了增加抗体的进入和细胞膜蛋白的释放。

渗透化处理一般使用皂类化合物如Tween-20、Triton X-100或SDS。

3.阻断非特异性结合：为了减少非特异性结合，需要进行阻断。

使用一种含有蛋白质（如牛血清白蛋白、胶原蛋白等）的缓冲液，将玻片上的固定样本浸泡数十分钟至数小时。

4.抗原恢复：一些蛋白质长时间固定后可能会导致其变性或掩盖其一些结构域，这种情况下需要进行抗原恢复。

抗原恢复有两种常见方法，热水浴和酶消化。

前者将玻片放在含有缓冲剂的热水中，后者则经过酶消化处理，例如使用胰酶。

5.抗体孵育：将特异性一抗加入到含有抗体绑定缓冲液中，然后将其滴加到玻片上，孵育在温和的条件下一段时间（通常为1小时至过夜）。

抗体结合到样本中的特定抗原上。

6.洗涤：洗涤步骤是为了去除非特异性结合的一抗和其他蛋白质。

使用含有适当洗涤缓冲剂（如磷酸盐缓冲液或PBS）的盛满容器，将玻片在其中轻轻漂洗数次。

8.再次洗涤：同样地，使用含有适当洗涤缓冲液的容器，将玻片在其中轻轻漂洗数次，去除非特异性结合的二抗。

9.信号放大：添加一种可视化或发光的底物使得免疫反应可见。

通常使用的方法有酶标记二抗、荧光染料标记的二抗或放射性标记的二抗。

10.显微镜观察：在光学显微镜下观察和记录实验结果。

使用显微镜观察样本，根据信号强度和位置对阳性和阴性结果进行评估。

这些步骤是一般免疫组化实验的基本步骤，但每个实验都有特定的条件和需求，可能需要对步骤进行修改和优化。

免疫组化法实验操作步骤免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)是一种利用抗体与组织中的抗原特异性结合的技术。

它是一种重要的研究方法，可以用于检测和定位组织中的特定蛋白质和其他生化分子。

以下是免疫组织化学实验的一般操作步骤：1.样本处理：a.固定：将待检测的组织样本进行固定处理，以保持其形态结构并保留组织内的抗原。

b.切片：将固定的组织样本切成非常薄的切片（通常为3-5微米厚），并将其放置在载玻片上。

2.抗原解蓝（抗原恢复）：a.对于不同类型的组织样本，选择适当的抗原解蓝方法。

b.抗原解蓝可以通过加热、酶解或其他方法来恢复组织样本中的抗原。

3.阻断非特异性结合：a. 使用一种非特异性的蛋白质来阻断载玻片上未特异性结合的位点，例如牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)或小鼠免疫球蛋白(Mouse IgG)。

b.加入适当浓度的阻断剂，并孵育片玻片上的切片，以阻断非特异性结合位点。

4.主抗体孵育：a.加入含有特定抗原的主抗体溶液，其可以与组织样本中特定的抗原结合。

b.孵育片玻片上的切片，使主抗体与待检测的抗原结合。

5.洗涤：a.用缓冲液或PBS等洗涤溶液洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的主抗体。

6.二抗孵育：b.孵育片玻片上的切片，使辅助抗体与主抗体结合。

7.洗涤：a.再次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的辅助抗体。

8.信号放大：a.可根据需要，使用染色剂或底物来增强或显色识别待检测抗原的结合位置。

b.例如，使用荧光染料或酶底物，通过显微镜观察或光镜观察，可使抗原可视化。

9.洗涤：a.最后一次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的染色剂或底物。

10.封片：a.加入适当的封片剂，如富含丙酮的溶液，将载玻片上的切片封装起来，以保护切片和保存染色结果。

免疫组织化学是一种复杂的实验技术，需要仔细的操作和精确的控制条件才能得到准确的结果。

(一)免疫组化：
1、脱蜡和水化：
石蜡切片置于二甲苯中浸泡5min×2，再在无水乙醇、95%乙醇、75%乙醇和PBS中分别浸泡3分钟。

2、抗原修复：
微波炉加热：在容器内加入柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）后将组织芯片放入，中高火，加热5min，盖盖冷却15分钟，再加热3分钟，再开盖冷却20分钟。

3、染色
（1）PBS浸泡10分钟，3次。

（2）3%H2O2室温孵育30分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，
（3）PBS冲洗，10分钟，3次，血清封闭，室温孵育60分钟。

（4）滴加已稀释的一抗工作液，封口，4℃过夜。

（5）PBS冲洗，20分钟，3次。

（6）滴加生物素标记二抗100ul/片，室温孵育60分钟。

（7）PBS冲洗，10分钟，3次。

（8）滴加辣根酶标记链霉卵白素，室温孵育1h后PBS洗3 min×3。

（9）DAB显色剂显色100ul/片，3-10min，镜下观察，有棕黄色沉淀后自来水充分冲洗。

（10）苏木精复染，5-30分钟。

4、脱水封片
（1）50%乙醇、75%乙醇、90%乙醇中各浸泡1分钟。

（2）无水乙醇中浸泡2分钟，两次。

（3）无水乙醇和二甲苯1：1混合液浸泡2分钟。

（4）二甲苯浸泡2分钟，两次。

中性树脂封片。

免疫组化实验步骤1.血样制备：-采集血液样本，离心分离血浆或血清。

-用PBS洗涤血浆或血清，去除杂质。

2.组织固定：-采集待检组织样本，用缓冲福迪液进行固定。

常用的福迪液包括4%的甲醛和10%的中性缓冲福迪液。

-将组织固定在玻片上，通常通过石蜡包埋来保护组织样本。

3.切片：-使用旋转式或电动切片机将固定的组织切割成5-10μm厚的切片。

-将切片放置在带有去福迪剂密封的玻片上，然后进行脱脂和重水处理。

4.抗原恢复：-将切片浸泡在适当的抗原恢复缓冲液中，以恢复切片中的抗原结构。

-常用的抗原恢复方法包括热敏感抗原恢复、酶消化抗原恢复和酸碱抗原恢复等。

5.阻断非特异性结合位点：-使用适当浓度的蛋白抑制剂（如牛血清蛋白）在切片上进行阻断，防止非特异性结合。

-将切片在室温下孵育一段时间，以使蛋白抑制剂有效阻断非特异性结合。

6.抗体染色：-添加特定的初级抗体到切片上，与待检测的特定抗原结合。

-孵育切片，使初级抗体与抗原结合。

-将切片用PBS或缓冲盐水洗涤去除未结合的抗体。

7.信号放大：-添加合适的二级抗体到切片上，与初级抗体结合。

二级抗体可标记有荧光染料、酶或金粒等。

-孵育切片，使二级抗体与初级抗体结合。

-将切片用PBS或缓冲盐水洗涤去除未结合的二级抗体。

8.检测与成像：-根据二级抗体标记的方式，使用合适的检测方法进行信号放大。

-如果使用荧光标记的二级抗体，可以利用荧光显微镜观察和拍摄图像。

-如果使用酶标记的二级抗体，可以使用底物和显色试剂进行检测和成像。

9.结果分析：-观察并分析免疫组化染色结果，评估抗原的定位和表达情况。

-可以使用计算机图像分析系统进行定量分析和比较。

10.结论和报告：-根据实验结果，得出结论并撰写实验报告。

-将实验结果与已知文献资料进行对比和解释，讨论可能的研究价值和应用前景。

注意事项：-实验过程中需严格遵守无菌操作规范，以避免交叉污染和误差。

-选用合适的正对照和阴性对照，以确保实验结果的准确性和可靠性。

免疫组化实验步骤
1 前期准备
免疫组化实验试验主要是利用细胞中含有特定标志物的抗体，来观察细胞中某些特定蛋白质的位置和分布情况，其前期准备工作有以下几点需要考虑：
1、要做免疫组化实验必须首先准备一些*抗体,即抗特定标志物的抗体；
2、准备标本培养环境，保证细胞存活活跃；
3、清点实验要用到的必要物质，检查是否所有实验材料都已准备就绪；
4、准备实验记录，如实验方案、实验步骤、实验结果等，以保证实验数据的准确性和可比性。

2 具体实验步骤
免疫组化实验是实验员非常关注的一个实验，下面罗列出其具体实验步骤：
1、将标本培养到细胞形成一定规模的培养皿；
2、冷冻切割：将细胞悬停的溶液，用-20度的硫酸乙酸或三氯甲烷冷冻，然后将其分割为明显的薄片；
3、将冷冻标本培养到特定的沉淀液中，然后以石蜡改变其物理性质，使蛋白质定置固定；
4、将固定的载体实验片上滴涂稀释的抗体，经一定的反应时间，使其与抗原结合；
5、以使抗体以及它所结合的标志物发挥发色效果，得以定位特定的蛋白质。

免疫组化实验往往被用来观察某个蛋白质在不同细胞水平和组织水平分布情况，从而形成具有一定科学依据性的认识，为临床医学研究和药物方案提供可靠的指导和依据。

免疫组化实验步骤及配方免疫组化实验是一种用于检测和定位特定蛋白质在细胞、组织或器官中表达的技术。

免疫组化实验包括一系列步骤，如抗原修复、非特异性结合抑制、免疫原和次级抗体处理、显色/荧光染色等。

下面将详细介绍免疫组化实验的步骤及配方。

1.抗原修复：抗原修复是为了恢复因组织固定而引起的抗原性损失。

一般使用高温或酶解方法进行抗原修复。

-高温方法：将组织切片置于高温缓冲液中加热，一般在95°C下加热15-20分钟。

-酶解方法：如胰酶消化、蛋白酶消化等。

例如，可以使用0.1%胰酶在37°C下进行酶解。

2.非特异性结合抑制：非特异性结合抑制是为了防止免疫试剂（如次级抗体）与非特异性蛋白结合，从而降低假阳性结果。

一般使用正常动物血清或胶体等进行非特异性结合抑制。

-正常动物血清：根据动物源种类（如小鼠、兔子等）选择相应的正常动物血清。

-胶体：如牛血清蛋白、牛血清白蛋白等。

可以在最终稀释液中加入1-2%的胶体。

3.免疫原处理：免疫原处理是为了增强目标抗原与抗体的结合效率，一般通过与次级抗体或酵素结合。

根据具体实验需求，可以选择荧光标记、酶标记或金标记等不同的方式进行免疫原处理。

-荧光标记：如荧光素等。

-酶标记：如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。

-金标记：如胶体金、纳米金等。

4.次级抗体处理：次级抗体处理是为了增强免疫原与目标抗原之间的结合效应。

一般使用来自其他物种的抗体作为次级抗体。

根据不同实验需求，可以选择与荧光标记、酶标记或金标记结合的次级抗体。

-荧光标记：如青蒿素标记的抗兔荧光标记抗体等。

-酶标记：如HRP标记抗体、AP标记抗体等。

-金标记：如碳标记抗体、金标记抗体等。

5.显色/荧光染色：显色/荧光染色是为了可视化目标抗原的分布和定位。

根据不同的免疫标记试剂，可以选择适当的染色方法。

-显色：如DAB（3,3'-二氨基联苯）染色。

-荧光染色：根据使用的荧光标记试剂选择相应的染色方法，如DAPI 染色、FITC染色等。