免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)

石蜡切片免疫组化染色步骤石蜡切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于研究组织、细胞和分子的结构与功能。

它通过使用抗体与特定抗原相互结合，然后使用酶、免疫荧光等标记物来检测这种结合，从而实现可视化染色和定位目标分子的目的。

下面，我们将详细介绍石蜡切片免疫组化染色的步骤。

步骤一：蜡块去蜡石蜡切片通常是由固定的组织样本制备而成，这些样本在处理过程中会被包埋在石蜡中。

因此，第一步是将蜡块去蜡。

首先，将蜡块放在温水中加热，使蜡块软化。

然后，将蜡块用刮刀从玻片上刮下。

这样可以得到蜡块去蜡后的组织样本。

步骤二：样本再固定在蜡块去蜡后，为了更好地保持组织的完整性和稳定性，通常需要对样本进行再固定。

常用的再固定方法是将样本放入4%的中性缓冲福尔马林溶液中，在室温下固定4-24小时。

固定后，将样本从福尔马林中取出，用PBS（磷酸缓冲盐溶液）洗涤数次，以去除残余的福尔马林。

步骤三：切片制备在样本再固定后，需要将样本制备成切片。

首先，将组织样本放入甲醇中脱水，然后转移到乙醚中脱脂。

脱脂后，将样本放入苯骚酸乙酯中浸泡，使样本渗透均匀。

在苯骚酸乙酯中浸泡一段时间后，将样本转移到石蜡中浸泡。

石蜡具有很好的切片性能，可以更好地保持组织的结构。

最后，将样本放入石蜡包埋机中，进行加热和固化，制备成为石蜡块。

之后，使用旋转切片机将石蜡块切成4-6微米厚的切片。

切片后，将切片浸泡在热水中，使其展开并粘附在玻片上。

步骤四：抗原修复切片制备完毕后，需要对切片进行抗原修复。

抗原修复是为了使样本中的抗原能够更好地暴露出来，增加抗体的结合效率。

常用的抗原修复方法有热处理和化学处理两种。

热处理通常是将切片浸泡在含有缓冲盐的蒸馏水中，然后加热至高温（如95摄氏度）保持一定时间。

化学处理通常是将切片浸泡在含有抗原修复试剂的溶液中，如EDTA（乙二胺四乙酸二钠）溶液。

抗原修复的时间和条件需根据具体实验的要求来确定。

步骤五：非特异性结合阻断为了减少非特异性结合，需要对切片进行非特异性结合阻断。

石蜡切片免疫组化染色实验操作流程_ 1．石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应置60℃1小时）。

①二甲苯I、II，各30分钟。

②梯度酒精：100%I、II，各10分钟;95%，5分钟;80%，5分钟;70%5分钟。

③蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。

2抗原修复：根据待检测的抗原，选择适当的方法。

附：抗原修复液（10mMpH6.0枸橼酸钠缓冲液）的配制：①储备液的配制：A液：枸橼酸三钠-2H2O29.41g+蒸馏水1000ml；B液：枸橼酸21g +蒸馏水1000ml；②工作液的配制：A液82ml+ B液18ml+蒸馏水900ml抗原修复的方法：高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH6.0），淹没切片，盖上锅盖，高压锅内煮沸，上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。

晾至室温抗原修复的注意事项：①组织不能干。

②选择抗原修复方法要因抗体而异。

③该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。

④抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。

3．PBS：5分钟，2次（置于摇床）4．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温20分钟（避光）。

5．PBS水洗：5分钟，2次。

6．正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态,）滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15分钟。

附：正常血清配制(或按试剂盒规定的浓度配制)：按1:10比例，用PBS配制，每张切片需要量按50μ+5μl (10%抛洒量)计算。

7．滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体50μ，（也可置于4℃冰箱过夜）。

第二天片子晾至室温8．PBS：5分钟，2次。

9.滴加聚合物增强剂（试剂A），37℃孵育30分钟，0.01 M PBS洗涤三次，5分钟/次，振洗。

10.滴加标抗鼠/兔聚合物（试剂B），37℃孵育30分钟，0.01 M PBS洗涤三次，5分钟/次，振洗。

免疫组化染色
1.石蜡切片60℃烤片2h
2.二甲苯脱蜡15min X 2次
3.梯度乙醇水化：100%乙醇X 2次，95%乙醇X 1次，85%乙醇X 1次，75%乙醇X 1次，
纯水X 2次，各5min。

4.抗原修复:
方法一（微波修复）：将玻片浸没在EDTA或枸橼酸钠抗原修复液中，微波炉高火5min，解冻2min，中低火20min，自然冷却到室温。

方法二（高压修复）：将玻片浸没在枸橼酸钠抗原修复液中，121℃，高压5min，自然冷却到室温。

1L抗原修复液：3g柠檬酸钠+0.4g柠檬酸。

5.灭火内源性过氧化物酶：将玻片浸入3% H2O2，室温15min，避光。

6.双蒸水浸泡3min，去除H2O2。

7.PBS洗3次，每次5min
8.甩干，将玻片摆放在湿盒上，免疫组化笔花圈，加入0.3% TritonX-100穿透细胞15min。

如果检测细胞质蛋白，此步骤科省略。

9.甩干，加入10% BSA 封闭1h。

10.加入2% BSA稀释好的一抗，4℃孵育过夜。

11.第二天，把湿盒从4℃拿出恢复至室温，PBS洗3次，每次5min
12.甩干，加入对应的二抗，室温孵育1h
13.PBS洗3次，每次5min
14.甩干，加入新鲜配置的DAB，显色时间需要摸索，最长不超过10min
15.清水终止显色，自来水冲洗20min以上。

16.苏木素染色30s，自来水冲洗返蓝
17.梯度乙醇脱水：75%乙醇X 1次30s，85%乙醇X 1次30s，95%乙醇X 1次30s，100%
乙醇X 1次30s，二甲苯6min
18.中性树胶封片。

石蜡切片免疫组化染色步骤石蜡切片免疫组化染色是一种常用的组织学染色技术，它能够通过染色反应检测组织中的蛋白质分子、细胞因子、细胞膜受体和细胞核因子等，为研究细胞和组织的功能以及疾病的发生机制提供了重要的工具。

下面将详细介绍石蜡切片免疫组化染色的步骤。

1.组织固定组织固定是石蜡切片免疫组化染色的第一步，它的目的是保持组织形态和结构，使得后续的染色步骤能够成功进行。

常用的固定方法有甲醛固定、醋酸盐固定和乙醇固定等。

其中，甲醛固定是最常用的方法，它可以固定组织细胞的形态和结构，同时减少细胞中的酶活性。

2.组织处理组织处理是将固定后的组织进行处理以便得到合适的切片和染色结果。

处理过程主要包括去水化、脱脂、透明化和浸渍等。

其中，去水化是将固定的组织从水中逐渐转移到无水乙醇中，以防止组织中的水分对后续蜡包埋产生干扰；脱脂是将组织中的脂肪酸等去除，以减少重组过程中的背景染色；透明化是将组织从乙醇中转移到透明剂中，以便光线穿过组织时不受阻碍；浸渍是将透明剂中的组织浸渍入蜡中，使其成为切片的固定基质。

3.蜡包埋蜡包埋是将处理后的组织浸入熔化的石蜡中，使其固定在蜡块中，并利用蜡的硬度和韧性将组织完整地包裹起来。

蜡包埋过程主要包括浸渍、浸透和固化等步骤。

其中，浸渍是将固定在透明剂中的组织浸渍入熔化的蜡中，以提高组织与蜡的亲和性；浸透是将融化的蜡逐渐浸透入组织内部的过程，以保持组织的完整性；固化是将蜡冷却固化，使其成为切片的固定基质。

4.制备切片制备切片是将包埋在蜡中的组织切成适当的厚度，以便后续的染色和观察。

制备切片的步骤主要包括切片机调节、切片和玻片浮法三个步骤。

其中，切片机调节是将切片机调整到适合的刀片和切片速度，以保证切片的质量和均匀性；切片是将包埋的组织从蜡块中切下，并将其转移到切片水槽中；玻片浮法是将切片从切片水槽中捞起，并将其平铺在预处理的玻片上。

5.脱蜡和重组脱蜡和重组是将切片上的蜡去除，并将组织重组成适合的形式，以便后续的染色步骤。

石蜡切片免疫荧光染色方法HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】对于石蜡切片：1、烤片：60℃ 60分钟2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟→蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。

3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入l柠檬酸钠，(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。

修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。

2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H2O22(2ml H2O22加入18ml蒸馏水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。

（也可不用去除内源性酶）。

3. 封闭(Blocking)加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。

如果背景较高，可以4℃封闭过夜。

不用洗，用滤纸吸干周边水分。

从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。

4. 一抗孵育(Primary antibody incubation)参考一抗的说明书，按照适当比例用（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。

立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。

PBS洗3次，每次5分钟。

5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)按照适当比例用稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。

PBS洗涤3次。

每次5分钟。

如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

6. 蛋白检测(Detection of proteins)7. 复染用DAPI对细胞核进行染色，室温10分钟，PBS冲洗5分钟×3次，封片（封片剂或分析纯的甘油与碳酸缓冲液1：1混合）显微镜观察，染色后为蓝色荧光。

石蜡切片免疫组织化学操作流程一、组织获取（本实验室多做脑组织，所以以脑组织为例）1.动物麻醉：所用麻醉药物（水合氯醛水溶剂）剂量为350mg/kg动物体重，常用麻醉药物浓度为5%、6%、7%、10%（麻醉浓度越大，动物进入麻醉时间越短，但麻醉致死率相应较高，本人使用7%浓度，若注射位置正确，约3min进入麻醉状态）；动物麻醉后，将其固定于灌流操作平台，仰卧位；2.动物灌流手术：以胸骨剑突为起点，沿左右两侧肋下缘剪开老鼠皮肤至腋下，再次以剑突为起点，剪开皮下肌肉层，沿同样方向剪开肌肉至腋下，避免伤到内部脏器，剪破膈膜，沿左右两侧剪断胸骨，用止血钳夹住剑突向上翻转，充分暴露心脏；用弯镊分离心脏表面黏膜；左手持止血钳轻夹起心脏，倾斜一定角度，使心尖方向与升主动脉尽量位于同一直线上，右手持灌流针，沿直线所在所在角度由左心室进针，将灌流针直接插入升主动脉（可挑动灌流针于升主动脉内观察是否正确插入，此方法操作不熟练易插错血管或是直接刺穿心脏——或者直接将灌流针插入左心室，但前方法灌流效率较高）；固定器械（器械松动或是位置变化会严重影响灌流质量，有时会因为器械位置的变动直接将心脏牵扯下来导致灌流失败，应给与充分注意）3.动物灌流：C57小鼠25-30g左右，灌流开始，可见右心耳充盈，用剪刀剪开，便于血液流出：吊瓶灌流——以生理盐水50-100ml快速冲洗血液，持续最好不要超过5min（时间过长会导致脑组织降解），待无明显血迹流出后换用4%多聚甲醛进行灌流，约100-150ml，灌流速度不宜过快，约10min，固定液较充分的固定组织；注射器灌流——生理盐水50ml快速推注，后换用4%多聚甲醛50ml缓慢推注。

灌流成功的标志——灌流开始，可见肝脏颜色迅速变浅，随着灌流进行，肝脏颜色逐渐变为乳黄色或是白色；换用4%多甲固定液后小鼠全身痉挛抽搐，组织僵硬。

4.开颅取脑：根据实验取材位置的不同，分为不同的取脑方式：应注意需要的组织区域，避免取脑过程中损坏，多从小脑后方依次向前剥离颅骨，获取脑组织（在颅骨剥开后，应注意脑膜的存在，因为会发生脑膜将皮层割裂损伤的情况）5.脑组织修块：将多余脑组织去除，便于固定充分均匀，应留出试刀或找平的部分多余组织（本人实验中因需要海马组织，故修块时沿大脑皮层后边缘切除多余小脑，人字缝前约2.5-3mm切除前脑部分）6.固定过夜：将修块完成的脑组织，浸泡于4%多聚甲醛中，固定过夜，通常不要超过18小时（固定时间越长，组织抗原损失越严重，呈数量级损失），一般控制在12小时以内为宜二、组织石蜡包埋7.组织梯度脱水透明：将过夜固定的脑组织取出置于包埋窗内，并用铅笔做好相应标记，自来水流水冲洗约10min，去除残留的杂质成分，进行梯度酒精脱水（注意：不同的组织类型，同组织类型不同组织块大小所需的每阶段脱水时间不同，需根据自身需要进行简单摸索；若盲目脱水透明，脱水透明过头，会使组织脆性增加，切片时全为粉末状，无法成形；脱水透明不够，会使组织与蜡块分离，无法获取平整组织切片）本实验中，组织样本为脑组织，组织修块后所进行的脱水流程如下：自来水冲洗完成→50%乙醇 25min→70%乙醇 25min→80%乙醇 25min→90%乙醇 25min →95%乙醇I 10min→95%乙醇II 15min→无水乙醇I 10min→无水乙醇II 15min→二甲苯I 15min→二甲苯II 15min8.组织浸蜡：在进行二甲苯透明开始的时候，将石蜡用沸水融化，置于60度烘箱内备用（此过程中应注意将盛放石蜡的烧杯上口封闭，避免水分溅入；根据组织块的数目准备合适体积的石蜡液体，以组织块完全浸没其中为宜）；将透明完成的组织块，尽量沥干多余二甲苯，迅速转入1号烧杯的石蜡液体内（避免包埋窗内产生气泡，气泡若围绕组织块会影响浸蜡过程），依次将所有组织块迅速转入其中，要求组织块要全部浸没在石蜡中，流程如下：1号石蜡2h→2号石蜡2h→3号石蜡2h在每个阶段的浸蜡过程中，可根据时间安排适量的延长浸蜡时间，但尽量不要减少时间9.组织块包埋：包埋前，准备沸水备用；清理干净包埋槽备用；包埋开始时，将装有组织块的烧杯浸入沸水中，防止在包埋过程中，烧杯中的石蜡凝固，具体操作如下：1）用镊子夹取包埋槽在酒精灯预温，控制包埋槽的温度不要过高；2）将烧杯内的石蜡倒入包埋槽内，液面高度刚好没过包埋槽两侧平台3）取出浸泡的组织块，用小镊子过火后夹取组织块放置在包埋槽的凹陷处中心部位，根据切片要求摆放位置，注意在放置过程中避免组织块下面接触包埋槽底部的位置产生气泡，通常在放置前，可将组织块浸没在凹槽内的石蜡中翻滚，使其各面均匀接触石蜡液体，然后放置在正确的位置（此时假如包埋槽预温过高，则会导致组织块在接触槽底面后异常干燥，在整个蜡块凝固后会在干燥处出现凹洞，不利于石蜡块的长期保存）；4）将包埋窗轻轻放置在包埋槽的平台上面，尽量保证两侧高度相同，此时槽内之前的石蜡会浸没部分包埋窗的格栏，静置1-2min（避免倒入热的液体石蜡后，石蜡从包埋窗的边缘流出）；5）静置后，石蜡表面会出现凝固表层，此时再用烧杯中的石蜡填充包埋窗的凹陷处以及靠近边缘的条状凹洞，液面稍高于包埋窗边缘（靠近边缘的条状凹洞一定注意填充石蜡，关乎整个蜡块凝固后与包埋窗结合的紧密程度；石蜡凝固后体积会缩小，避免因液面过低导致的后期包埋窗内部支撑不够）6）静置至少30min，可将包埋后的蜡块从包埋槽内分离（注意分离时，应先清理包埋槽四周的多余石蜡，露出包埋窗与包埋槽接触的边缘，然后从一个角将蜡块撬离包埋槽）三、石蜡切片10.准备工作：蜡块的修整——将组织周边的石蜡在保留操作位置的情况下尽量去除（1-减少石蜡块切面与刀片的接触面积，便于受力均匀，易切出完整切片；2-石蜡切面与刀片接触面积小，会减少刀片接触到蜡块中坚硬杂质的几率，增加刀片的使用寿命；3-接触长度减少，可增加刀片使用次数，通常情况下至少多使用1次）准备器材：40度恒温水浴（温度控制在40-42之间的恒温状态，此温度可使蜡片较长时间保持切片形态，温度较低切片不易展开，温度较高，切片会在短时间内融化，易造成组织变形）切片刀片、包被载玻片、弯镊、毛刷、铅笔、切片盒冰盒（通常情况不需要，在组织脱水透明严重，切片呈粉末状态时，可用冰块冰敷石蜡切面，在短时间内可改善切片表面状态，能够帮助切出3-5片完整切片，只有在前期处理出问题时才使用进行一定程度挽救）切片大致流程：1）安装刀片；将蜡块固定于切片机上，调整蜡块表面与刀片距离，矫正蜡块表面与刀片切线平行；2）调整切片模式为trim-10um进行表面找平，并观察切片状态，调整蜡块角度，使切片左右对称，同时注意观察目标区域出现位置；3）切片调平，并出现合适目标区域，调整切片模式为sect-5um进行切片，获取所需组织切片样本；4）将完整合适的切片，夹取至水浴锅内摊平，左手持载玻片，右手持弯镊辅助，将切片贴于载玻片中，放置在水浴锅边缘进行干燥并做好相应标记；5）将干燥完成切片，按照样本分类放置在一起收于切片盒中备用6）切片完成，清理清片机；剩余组织蜡块，需要在切面表面均匀涂抹融化的石蜡，避免组织块直接与空气接触（不进行封闭，会使组织块在长期的暴露过程中，含水量发生变化，易于与支撑蜡块分离，造成后续再次切片困难）7）切片盒中切片，干燥后可在室温下长期放置，推荐切片完成后及时进行后期组织染色或组织免疫化学孵育。

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
一、石蜡切片免疫组化技术
石蜡切片免疫组化方法是一种流行的染色技术，它利用抗原特异性抗
体结合抗原将一种特定蛋白质标记出来，然后对组织交叉剥离切片进行染色，得到对特定抗原的特异性染色，进而可以测定组织中其中一蛋白质的
分布情况及其表达水平。

石蜡切片免疫组化方法主要分为热稳定抗原抗体
保护法、热稳定化学法和抗原保护法三种。

1.热稳定抗原抗体保护法
热稳定抗原抗体保护法又称抗原连接法，它是最常用的一种免疫组化
技术，依赖高温对抗原的特殊保护作用。

其原理是经过化学固定的组织切片，在石蜡上产生隆起；然后用高温阳性抗体（双抗体）将抗原完全覆盖，并产生痕迹，这样便可清楚地观察抗原的分布情况；此外，在有抗原保护
的条件下，抗原保护的组织切片可以用客体抗体染色。

2.热稳定化学法
热稳定化学法是一种特殊的抗原保护法，也是最常用的石蜡免疫染色
技术。

石蜡切片(paraffin sections)免疫组化染色步骤1、载玻片的处理：抗原修复过程中,由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。

这里选用ZLI-9001 APES、ZLI- 9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。

具体方法如下：（1）APES：现用现配。

将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES 中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。

用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。

（2）HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogr ip液中，停留1~2分钟,然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC 烤箱烘烤一小时，装盒备用。

（3）Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60℃烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。

装盒备用。

试验中使用的器具均为非玻璃制品。

2、常用酶消化：（1）胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~4 0分钟，主要用于细胞内抗原的显示。

（2）胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。

（3）皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10 g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。

3、抗原热修复：可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。

抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。

枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其 pH值在6.0±0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。

石蜡切片免疫组化操作步骤1.组织固定：首先，将需要观察的组织或细胞固定在福尔马林或4%的乙醛溶液中。

固定时间取决于样品的大小和类型，常见的固定时间为12-24小时。

2.组织处理：将固定的组织或细胞进行脱水和清洁处理，以使其能够被石蜡包埋。

常见的脱水方法是使用乙醇系列浓度逐渐提高，如70%乙醇、95%乙醇和绝对乙醇。

然后，将样品浸泡在透明剂（如苯并并酮或二甲苯）中，使其透明。

3.石蜡包埋：将透明的组织或细胞浸入熔化的石蜡中，使其完全包裹。

常见的石蜡温度为55-60摄氏度。

可以使用芯片或模具来定制大小合适的石蜡块。

4.组织切片：使用医学切片机或超微切片机，将石蜡块切割成薄片。

通常，切割厚度为4-6微米，但也可以根据需要进行调整。

5.切片脱蜡：将切好的石蜡切片放置在热盖玻片上，用热蜡表面接触面向下。

然后，将玻璃片放入组织脱蜡盒中，加热至60-70摄氏度，使石蜡脱离切片，另外，该步骤还可以利用草酸进行加速。

6.抗原解封：使用溶液（如柠檬酸缓冲溶液或EDTA缓冲溶液），将切片置于高温下进行抗原解封。

温度和时间因需求而异，通常在95-100摄氏度下进行10-30分钟。

解封后，冷却切片，并在磷酸盐缓冲液（PBS）中进行冲洗。

7.抗体处理：在切片上添加特异性的一抗体，与目标分子结合。

一抗体可与多种分子结合，如细胞表面蛋白、核蛋白等。

放置于4摄氏度下冷藏过夜，或者进行适当的孵育时间。

9.检测和显色：在切片上使用适当的检测或显色方法，观察特定分子的存在和分布。

常见的方法有荧光显微镜、透射电镜、酶标法等。

不同的检测方法需要不同的荧光染料、显色剂或底物。

10.封片和保存：将切片用适当的介质（如甘油/PBS缓冲液）覆盖，以保持切片的湿度和保存状态。

然后，用封片胶或透明胶带将切片封闭，并在干燥避光条件下保存。

总结起来，石蜡切片免疫组化的操作步骤包括组织固定、组织处理、石蜡包埋、组织切片、切片脱蜡、抗原解封、抗体处理、二抗处理、检测和显色，以及封片和保存。

石蜡切片免疫组化染色步骤-回复石蜡切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于检测组织中特定蛋白质的表达和定位。

通过特定抗体的结合，可以在组织切片上形成可见的染色反应，从而了解细胞分布、形态和功能。

本文将一步一步介绍石蜡切片免疫组化染色的详细步骤。

第一步：取材固定首先，需要取得要进行免疫组化染色的组织样本。

可以是新鲜组织，也可以是经过福尔马林或其他适当的固定剂固定后的组织。

固定的目的是固定细胞内蛋白质的结构，以保持其形态和抗原性。

固定过程中要避免产生过度固定，否则可能会破坏细胞结构和抗原的特异性。

第二步：组织脱水和浸渍将固定好的组织样本进行脱水和浸渍。

脱水的目的是去除组织中的水分，使其能够与石蜡充分相溶。

浸渍的目的是使组织均匀地吸收石蜡，以便切片时组织能够坚固并保持形态。

一般的脱水和浸渍步骤包括用不同浓度的酒精进行脱水，然后使用清洁剂和石蜡浸渍组织。

第三步：包埋和切片经过浸渍的组织样本需要进行包埋，以保持其形态和结构。

将组织样本放置在浸渍好的石蜡中，使其充分浸透，然后将其放置在冰上使石蜡固化。

固化后的组织样本可以用切片机切成非常薄的切片，通常是4-6μm。

切片质量对于后续的免疫组化染色非常重要，所以要确保切片的平整和完整。

第四步：切片除蜡和重现组织抗原切片除蜡是为了去除包埋后留在组织切片上的石蜡，以便进行后续的染色。

一般使用酮或甲醇进行除蜡，然后通过多次水洗将组织切片充分清洗。

重现组织抗原则是为了使切片上的抗原能够被抗体检测到。

根据抗原的性质和检测的目的，可以选择适当的方法进行重现组织抗原，如酶解、蛋白酶解或热诱导抗原修复等。

第五步：抗体孵育将免疫组化染色所需的一抗加在切片上，与切片中的特定抗原发生特异性结合。

孵育时间和温度根据抗体的性质和抗原的稳定性来确定，一般在室温下孵育数小时或过夜。

抗体孵育结束后，使用缓冲液或PBS洗涤切片，以去除未结合的抗体。

第六步：二抗孵育和信号检测在一抗的基础上，可以使用与一抗来源不同物种的二抗来进行信号放大。

石蜡切片免疫组化步骤
一、石蜡切片的制备
1、准备石蜡
用烧杯中加入12mL的苯溶剂和8mL的石蜡，加热至融化，将融化的石蜡移植到一块热板上继续加热，以便从热板上取出细薄的膜层，用磨刀涂抹，然后将用涂抹磨刀涂抹的膜层置于蜡块上，将有载体细胞囊毛细管夹在由石蜡制成的膜层和热板之间，着色后再将膜层回置回蜡块上。

2、去除细胞浆
将制备好的石蜡切片放入10％氯化苯甲酸至50％酒精溶液中，让细胞进行脱脂，去除细胞浆，然后将液体放入烧杯中，煮沸5分钟，再放入70％酒精溶液中，洗去残留的脱脂液，最后放入稀盐酸洗涤，洗去残留的蛋白质。

3、着色
将石蜡切片放入适当浓度的着色液中（如酚酞-HA，库仑染料，组织染料等），煮沸着色3-5分钟，放入稀盐酸洗涤，进行染腐去色，将残留的着色液除去，把腐蚀后的石蜡切片放入稀乙醇中，使其着色深度稳定，待用。

二、石蜡切片免疫组化实验
1、抗体的准备
首先根据实验要求，准备抗体。

免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法（精髓版）免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。

二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。

（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。

（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。

（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。

Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。

当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。

（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。

注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。

所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。

微波法最为常用。

（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。

（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。

（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。

（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。

（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。

（10）次日取出切片，室温下复温30min。

（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。

（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。

（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。

石蜡切片免疫组化实验方法预处理：1.收集组织样品：选择实验需要的组织样品，如病变组织或动物组织，固定在4%的中性缓冲福尔马林溶液中，通常时间为24小时。

2.脱水：将固定的组织样品进行脱水处理，使用升级的乙醇浓度，如70%乙醇、85%乙醇和95%乙醇各浸泡5-10分钟，然后在无水乙醇中浸泡2-3次，每次浸泡时间为10分钟。

3.渗透剂处理：将组织样品置于染料渗透剂（如苯酚甲醛、苯酚）中进行渗透处理。

渗透剂的选择根据实验需要的类型来确定。

4.包埋：将已经渗透处理的组织样品放入合适大小的模具中，加入石蜡进行包埋，通常使用两次石蜡浸渍15-20分钟，然后定位标本，放入包埋模具中。

切片：1.切片机调节：根据具体的切片机和刀片的不同，调节适当的角度和切片速度。

2. 切片：将包埋好的组织块放入切片机的切片盘中，以适当的角度切出厚度约为4-6um的石蜡切片，切片时需要保持刀片的清洁，避免刮伤组织。

3.切片回收：使用刀片回收装置将切下的切片轻轻回收至水中，再将切片转移到预处理盒中。

染色：1. 去蜡：将石蜡切片放入脱蜡溶液（如xylene）中进行脱蜡处理，每个浸泡站点持续3-5分钟。

2.脱水：将石蜡切片从脱蜡溶液中取出，放入浓度递减的乙醇溶液中，分别浸泡5分钟，如95%乙醇、70%乙醇和纯水。

3.抗原修复：为恢复组织切片的抗原表位，可以选择酶消化、高压加热或微波处理等方法来进行抗原修复，常用的抗原修复方法包括热处理和酶切法。

4.屏障消除：为了阻止非特异性结合，需要进行屏障消除，使用5%非脂干奶粉或血清进行预阻断，通常需要在37°C孵育1小时。

5.一抗处理：将相应的一抗加入切片上，覆盖玻璃片，通常需要在4°C下孵育过夜。

6.洗涤：用洗涤缓冲液对切片进行洗涤，通常重复3次，每次5分钟。

7.二抗处理：将荧光标记的二抗加入切片上，覆盖玻璃片，通常需要在室温下孵育1小时。

8.洗涤：用洗涤缓冲液对切片进行洗涤，通常重复3次，每次5分钟。

石蜡切片免疫组化实验方法
石蜡切片免疫组化实验是一种常用的病理组织学方法，用于确定特定的抗原在组织中的位置和表达水平。

以下是石蜡切片免疫组化实验的具体步骤：
1.组织处理。

将取得的组织标本固定在10%的中性缓冲福尔马林中，并进行脱水、浸透及包埋处理，以确保组织样本可以与石蜡相容。

2.石蜡切片制备。

将包埋好的组织样本切成4-5um厚的薄片，并贴附到玻片上，以备后续免疫组化处理。

3.抗原复性。

将石蜡切片置于解离液中，均匀受热数分钟，使样本中的链状分子断裂，恢复抗原的免疫活性。

4.抗体处理。

将待检测的抗体加入到样本中，充分混合并孵育一段时间，以实现抗原与抗体的免疫反应。

这里要注意，不同的抗体使用的孵育时间和检测温度也不同。

5.二次抗体处理。

在完成抗体处理后，将与一级抗体相结合的二级抗体（比如HRP等）加入样本中，进一步实现免疫反应并标记待测抗原。

6.染色处理。

将待检测的免疫活性抗原染色，可以用一些特定的染料，比如DAB染料等。

7.显微镜观察。

最后，将石蜡切片置于光学显微镜下，观察抗原的表达情况，并根据染色结果分析样本中目标抗原的表达、分布和数量。

石蜡切片免疫组化步骤（整理）石蜡切片免疫组化步骤1.脱蜡复水二甲苯1（10min）二甲苯II （10min）二甲苯III （10min）无水乙醇I （10 min）无水乙醇II （5min）95％乙醇（5min）70％乙醇（3min）50％乙醇（3min）30％乙醇（3min）1X PBS浸泡（5min）。

2.抗原修复a.将抗原修复液（250ml）加入开口容器中，放入微波炉中高火（9档）6min左右沸腾，然后将玻片放入后，使用低火（3档）4min，微波炉中冷却5min，重复三次。

（注意液面是否下降，如是需补充等温的缓冲液，或可放置一杯蒸馏水在微波炉中同时加热。

）从微波炉中取出，室温等待缓冲液彻底冷却后（大约30-45 min），取出玻片。

TIP：修复液（柠檬酸：0.1g，柠檬酸钠：0.75g，溶于250mL去离子水）。

b. 用PBS洗（浸泡或冲洗）三次，每次5min。

（期间用组画笔（疏水性油性蜡笔）圈出阻止范围，以节省抗体）。

Tip：抗原决定簇在4％PFA固定过程中遭到破坏，因此需要复性过程以使抗原决定簇重新暴露出来，利于抗体结合。

3. 封闭封闭液为5% 的二抗同源血清，配方为：[940 μl 1xPBS + 50 μl serum + 10 μl 10% BSA]室温封闭1h，在湿盒中进行。

结束后将载玻片竖立于吸水纸上，去除封闭液。

不需要洗！Tip:从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景Tip：如不使用二抗同源血清，也可使用3％~5％BSA进行封闭。

Tip：封闭作用：空间占位。

BSA能非特异性的与表面抗原决定簇结合，这样特异性的抗体就不会与非特异性的抗原结合，以降低背景。

Tip：The secondary antibody may cross react with endogenous immunoglobulins in the tissue. Minimize this by pre-treating the tissue with normal serum from the species in which the secondary was raised.Tip：The use of normal serum before the application of the primary also eliminates Fc receptor binding of both the primary and secondary antibody. BSA is included to reduce non-specific binding caused by hydrophobic interactions.4.孵育一抗一抗稀释液：dilution in 0.1% serum, 0.1% BSA in 1xPBS [989 μl 1xPBS + 1 μl serum + 10 μl 10% BSA]。

实验时间石蜡切片免疫组化实验（含详细步骤）
免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。

根据标记物的不同分为：免疫酶法、免疫荧光法、亲和组织化学法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。

其中前三种最常用。

实验原理
根据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔 IgG 分子结合在多聚酶上形成多聚物分子，其与待检的抗原特异性的结合后，加入底物显色。

实验步骤
1. 石蜡切片置于67 ℃ 烘箱中，烘片 2 小时，脱蜡至水，用 pH 7.4 的 PBS 冲洗三次，每次 3 分钟（3 × 3'）。

2. 取一定量 pH = 6.0 柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理 10 分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用 PBS 冲洗2 × 3'（注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定）。

石蜡切片免疫组化实验步骤石蜡切片免疫组化实验是一种常用的实验方法，用于研究细胞或组织中特定蛋白质的表达情况。

下面将详细介绍该实验的步骤。

一、标本固定1.1 选取需要研究的组织标本，如肿瘤组织或正常组织。

1.2 将组织标本进行固定，常用的固定剂有4%的中性缓冲福尔马林溶液。

固定时间一般为24小时。

二、脱水和浸渍2.1 将固定的标本进行脱水，使用不同浓度的酒精进行逐渐脱水，通常是从低浓度到高浓度的酒精。

2.2 脱水后，将标本进行浸渍，使用石蜡和酯类溶剂混合制备浸渍剂，将标本浸渍在浸渍剂中，使其逐渐渗透。

三、石蜡包埋3.1 将浸渍的标本放入石蜡溶液中，使其充分浸泡。

3.2 使用石蜡包埋机将标本置于石蜡中，使其被石蜡完全包裹。

3.3 将石蜡包埋的标本放置于冷冻台上，使石蜡迅速凝固。

四、切片4.1 使用切片机将石蜡包埋的标本切成薄片，通常厚度为4-6微米。

4.2 将切好的标本片放入温水中，使其展开。

4.3 使用载玻片将标本片捞起，放置于载玻片上。

五、脱脂5.1 将载玻片上的标本片放入脱脂剂中，去除石蜡。

5.2 脱脂时间根据实验需求而定，一般为10-20分钟。

六、抗原修复6.1 标本片上的抗原可能在脱脂过程中被破坏，需要进行抗原修复，以使其恢复原有的形态和免疫反应性。

6.2 常用的抗原修复方法有热处理法和酶解法。

热处理法是将标本片放入缓冲溶液中，进行高温加热处理；酶解法是使用特定的酶对标本进行酶解处理。

七、抗体反应7.1 将修复后的标本片进行抗体反应。

首先将载玻片上的标本片加入抗体溶液中，使其与目标蛋白质结合。

7.2 抗体反应时间一般为1-2小时，温度一般为室温或4摄氏度。

7.3 抗体反应后，使用洗涤缓冲液洗涤标本片，去除未结合的抗体。

八、检测与显色8.1 将洗涤后的标本片加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗溶液中，使其与一抗结合。

8.2 二抗结合后，使用显色底物，如DAB（3,3'-二氨基联苯）溶液，进行显色反应。