BHK-21传代细胞培养

BHK-21（幼仓鼠肾传代细胞）一、细胞复苏：1、从液氮罐取出一支装有BHK-21的细胞冻存管，用镊子立刻将冻存管置于37℃水浴箱中融解，将冻存管盖口以下面积浸入水中，不时摇动冻存管加速融化，直至管内冰块融化，约1~2min。

2、将融化后的冻存管放入超净台中。

取出一支15ml离心管，加入6ml DMEM(低糖培养液)，用1000µl移液枪移取全部冻存管内细胞液至离心管中，盖上离心管盖，轻轻上下颠倒混匀后离心（800r/min，5min）。

3、用移液枪将液面气泡吸走，倒去上清液。

4、加入2ml生长液（10% FBS(胎牛血清)，89% DMEM，1% 双抗（青霉素+链霉素）），用移液枪吹打均匀。

5、用移液枪将生长液移至25cm2细胞培养瓶中，补加4ml生长液。

6、盖上透气滤膜盖，置于37℃、CO25%培养。

备注：1、细胞复苏后5h，镜下观察细胞已贴壁，贴壁细胞密度50%~60%。

二、细胞换液（复苏后24h换液）1、取出细胞，镜下观察，细胞已长至80~90%，有部分细胞漂浮在培养液中。

2、倒去培养液，加入6ml生长液（10% FBS（胎牛血清），89% DMEM（低糖培养液），1%双抗），盖上透气滤膜盖，置于37℃、CO2 5%培养。

备注：1、一般复苏后的第一天（24h）需换液，复苏后第二天（48h）才能考虑传代，若没有传代，第三天（72h）必须传代。

2、处理过程不需用PBS（磷酸盐缓冲液）或HASS洗涤，因细胞刚复苏，不需过多处理细胞。

三、细胞传代（复苏后48h传代）1、镜下观察，细胞已长满整个细胞瓶底，有部分细胞漂浮。

2、倒去培养液，用移液枪吸取1ml PBS或HASS，沿培养瓶细胞对侧壁加入洗液，盖上盖子，轻摇瓶子让洗液洗涤整个瓶壁。

后续过程。

1200L反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒技术一、技术背景国内口蹄疫布控形势仍严峻，高效、安全的病毒性疫苗是防止口蹄疫情发生的最有效方法。

BHK21细胞是繁殖FMDV的理想宿主，国外普遍采用了2000－5000L 反应器悬浮培养BHK21细胞技术生产口蹄疫苗。

目前国内主要通过大规模转瓶培养BHK21细胞生产口蹄疫苗，仅一家单位已采用上千升反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗。

转瓶培养BHK21细胞生产口蹄疫苗工艺，因为每个转瓶均是独立的细胞培养单元，每瓶的细胞质量、病毒产量和滴度都不同，导致疫苗批间差大，隐性污染引起高内毒素，副反应大等缺点。

反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫苗工艺，不仅能提高BHK21细胞密度，自动监控细胞生长或病毒繁殖时的最适生化条件，提高病毒滴度，而且工艺规模放大相对容易，管道化操作最大可能避免了污染的发生，能显著提高口蹄疫疫苗的质量。

MMBS已成功开发了BHK21反应器悬浮培养基、120L-650L-1200L反应器悬浮BHK21细胞技术、1200L反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗工艺等关键技术，为反应器生产口蹄疫疫苗的产业化奠定了扎实的技术基础。

二、工艺技术1200L反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒工艺：利用BHK21悬浮培养基从液氮中复苏已适应悬浮培养的BHK21细胞株，种子细胞经摇瓶、5L反应器、120L反应器和650L反应器等逐级放大培养，最后在1200L反应器中悬浮培养BHK21细胞至合适密度，接种口蹄疫病毒种毒，维持一定的溶氧、pH值、温度等工艺参数，适时收获一次性收获培养液,制备成苗。

图1表示了反应器悬浮培养BHK21细胞的照片，细胞密度可以达到3×106cells/ml左右以上。

图2表示了悬浮培养的BHK21细胞接种口蹄疫病毒14hr 后的BHK21细胞。

从反应器中收获上清的口蹄疫病毒抗原量（146S完整病毒粒子）高于转瓶培养工艺。

BHK-21 传代细胞培养BHK 是仓鼠肾细胞［原理］细胞在培养瓶壁上长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。

传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。

同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。

［材料和试剂］1、细胞：贴壁BHK-21 细胞株2、试剂：0.25％胰蛋白酶、配制好的DMEM 培养液、小牛血清、双抗溶液、7.5%碳酸氢钠3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、胶塞、量筒、注射器、针头、酒精灯、污物缸等［操作步骤］1、应需要计算好培养液的总用量，按10%的比例加入血清，按1%的比例加入双抗。

用7.5%的碳酸氢钠调PH 至7.0~7.2 左右。

2、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。

3、加入0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中为宜。

4、瓶口塞好胶塞，平放在实验台上。

约2~3 分钟会看到贴壁细胞层出现细针孔空隙，赶紧将胰酶弃去，加入少量培养液终止消化。

5、用注射器将贴壁的细胞反复吹打，使其均匀分散成悬液，再加入足量的培养液，分成两到三瓶。

塞好胶塞，置37 C温箱中继续培养。

细胞培养常用溶液的配制青、链霉素溶液青霉素钠盐（80万IU /瓶）5瓶链霉素（100万IU /瓶）4瓶将两者溶于400ml0.9 %的无菌生理盐水，分装小瓶，-20C保存。

双抗在培养基中的终浓度为100IU/ml 为宜。

二、7.5%碳酸氢钠溶液的配制称取碳酸氢钠7.5g ，加入超纯水使总体积为100ml 。

高压灭菌，分装于小瓶中，4C 贮存。

三、1%酚红溶液的配制首先配制1mol/L的NaOH溶液。

称取NaOH4.0 g,加入100ml超纯水，使NaOH 完全溶解，在室温或4C贮存（最好现用现配）。

配制好NaOH溶液后，再称取1.0 g酚红置研钵中，加1mol/L的NaOH （不多于7.0ml），研磨使酚红完全溶解，加超纯水至100ml,高压消毒，在室温或4 C贮存。

实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。

二、常用细胞的种类BHK-21：仓鼠肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2：猪肾传代细胞Hela：人的子宫瘤细胞Vero：非洲绿猴肾细胞Marc-145：来源于Vero细胞TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞Sf9：昆虫细胞三、材料1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞3、0.25%胰酶4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM5、伪狂犬病病毒液（PRV）四、传代细胞培养的条件要求1）细胞密度：2-3×105个/ml2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞一般为37℃昆虫细胞28-30℃五、常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。

2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。

3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。

六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。

2、血清1）血清的种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。

2）血清的处理无菌采集，过滤除菌。

用前56℃灭活30min。

3）血清的作用A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。

B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。

C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。