核酸提取常见试剂的作用原理

DNA提取过程中各种试剂的作用及原理 2008-11-01 14:51

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1．溶液I—溶菌液：

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

2．溶液II－NaOH－SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。

但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。

在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6， 因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。

SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：

（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。

（2）解聚细胞中的核蛋白。

（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。

但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中

（用RNase去除RNA时）受到干扰。

3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。

所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，

使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、

RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。

但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。

在溶液II中的NaOH浓度为／L，加抽提液时，该系统的pH就高达， 因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。

SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：

（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。

（2）解聚细胞中的核蛋白。

（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。

但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中

（用RNase去除RNA时）受到干扰。

3. 溶液III--3mol／L NaAc（）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至，必须加入大量的冰醋酸。

所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用的NaAc溶液是为了把的抽提液，调回pH至中性，

使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、

RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，

后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。

4．为什么用无水乙醇沉淀DNA？

用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，

乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。

因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。

但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，

说明书

【产品名称】

【预期用途】

本产品主要原理如下：

1．使用裂解液实现细胞裂解、DNA的释放。

2．磁珠可以特异地吸附DNA，通过洗涤，去除DNA以外的杂质。

3．洗脱液解离吸附在磁珠上的DNA，得到纯度和浓度均很高的DNA。【检验原理】100次/盒； 400次/盒【包装规格】核酸提取或纯化试剂版本号：12/2021

用于核酸的提取、富集、纯化等步骤。其处理后的产物用于临床体外检测使用。核酸提取或纯化试剂4-30℃保存，有效期12个月。可在4-37℃运输，运输时间建议不超过7天。【储存条件及有效期】【主要组成成分】100次/盒400次/盒试剂名称规格数量规格数量裂解缓冲液24ml/瓶1瓶96ml/瓶1瓶漂洗缓冲液1（浓缩液）80ml/瓶1瓶80ml/瓶4瓶漂洗缓冲液2（浓缩液）50ml/瓶1瓶50ml/瓶4瓶漂洗缓冲液396 ml/瓶1瓶192ml/瓶2瓶洗脱缓冲液30ml/瓶1瓶96ml/瓶1瓶蛋白酶K25mg/支2支180mg/瓶1瓶蛋白酶K保存液1.25 ml/支2支5ml/支2支磁珠悬浮液1ml/瓶2瓶8ml/瓶1瓶

1．手动单管提取：

1）恒温混匀仪——货号：CW2593

2）2/15 ml磁力架——货号：CW2594

3）异丙醇、无水乙醇

2．手动96孔深孔板提取：

1）恒温混匀仪——货号：CW2593

2）废液抽吸系统——推荐品牌台湾洛科

3）手动连续分液器——推荐品牌Eppendorf

4）电动连续分液器——推荐品牌Eppendorf

5）手动连续分液器分液管（25 ml）——推荐品牌Eppendorf

6）96孔板磁力架——货号：CW2595

7）异丙醇、无水乙醇

3．磁棒法磁珠自动提取系统：

1）磁棒法磁珠自动提取系统——建议品牌Thermo Fisher

2）异丙醇、无水乙醇【自备仪器、试剂】1. 手动单管操作

1.1向1.5 ml的离心管中加入20 μl蛋白酶K溶液，之后加入200 μl的血液。注意：1）冷冻抗凝血液需提前在室温（15-30℃）下放置，融化混匀。2）如血液体积大于或小于200 µl，蛋白酶K、裂解缓冲液和异丙醇与磁珠混合物的用量需按比例调整。1.2向离心管中加入200 μl裂解缓冲液，涡旋振荡5秒钟使其充分混匀后，将离心管放于56℃水浴锅中孵育15分钟，期间涡旋震荡混匀2次。1.3将离心管从水浴锅中取出，短暂离心后室温放置5分钟。加入彻底混匀的320 μl异丙醇与磁珠混合物，涡旋震荡混匀5秒钟后将离心管放于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀5分钟或将离心管连续颠倒混匀10分钟。1.4将离心管放于磁力架上静置1分钟，待磁珠完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去溶液（保持离心管固定于磁力架上）。1.5将离心管从磁力架上取下，加入750 μl漂洗缓冲液1（使用前请检查是否已加入无水乙醇）后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟（震荡过程中确保磁珠处于混匀状态）。之后将离心管放于磁力架上静置1分钟，待磁珠完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液（保持离心管固定于磁力架上）。1.6重复步骤1.5。1.7将离心管从磁力架上取下，加入750 μl漂洗缓冲液2（使用前请检查是否已加入无水乙醇）后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟（震荡过程中确保磁珠处于混匀状态）。之后将离心管放于磁力架上静置1分钟，待磁珠完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液（保持离心管固定于磁力架上）。【样本要求】

nucleozol 原理

Nucleozol是一种常用的核酸提取试剂，它的原理是利用硅化二甲基苯基氯硅烷（DMBPS）的化学结构，将核酸与其特异性地结合，形成特定的络合物。配合Nucleozol缓冲溶液，可以在一定条件下使核酸脱离细胞内其他组分，并与DMBPS形成络合物。

DMBPS是一种疏水性化合物，它具有苯基和硅烷基，能够与核酸中的酰胺键形成氢键和疏水作用。通过Nucleozol缓冲溶液中的高盐浓度和酸性条件，可以改变核酸及其他细胞组分的电荷情况，增加了核酸与DMBPS的亲和性。此外，高盐浓度还可以降低有机物和蛋白质的溶解度，从而使它们沉淀或析出，从而有效分离核酸。

经过离心沉淀步骤后，溶液中的核酸-DMBPS络合物可溶解于水，并可通过丙酮沉淀和洗涤的方式从细胞残渣中进一步纯化。最后，通过加入适当的溶剂，如去离子水或低盐缓冲溶液，可以使核酸从络合物中解离，得到纯净的核酸提取物。