核酸提取常见试剂的作用原理

核酸提取常见试剂的作⽤原理

异硫氰酸胍

强⽤⼒的蛋⽩质变性剂，能迅速溶解蛋⽩质，导致细胞结构破碎，核蛋⽩由于其⼆级结构的破坏消失⽽迅速与核酸分离。胍盐是破坏蛋⽩质三维结构的离液剂，在通常使⽤的蛋⽩质变性剂中作⽤最强的是异硫氰酸胍，它们可以使多数蛋⽩质转换成⼀随机的卷曲状态。含有强⼒的阴离⼦和阳离⼦基团，它们可以形成较强的氢键。在还原剂存在的情况下，异硫氰酸胍可以断裂氢键，⽽去垢剂，如SDS存在的情况下，可以破坏疏⽔作⽤。

盐酸胍、尿素

盐酸胍是⼀个核酸酶的强抑制剂，它并不是⼀种⾜够强的变性剂，可以允许完整的RNA 从富含RNase的组织中提取出来。4-8M可断裂氢键，有两种可能机制：1变性蛋⽩和盐酸胍、尿素优先结合，形成变性蛋⽩-变性剂复合物，当复合物被除去，从⽽引起N-D反应平衡向右移动，随着变性剂浓度增加，天然状态的蛋⽩不断转变为复合物，最终导致蛋⽩质完全变性；2盐酸胍、尿素对氨基酸的增溶作⽤，能形成氢键，当浓度⾼时，能破坏⽔的氢键结构，结果盐酸胍、尿素就称为⾮极性残基的较好溶剂，使蛋⽩质内部的疏⽔残基伸展和溶解性加强，盐酸胍、尿素引起的变性往往是不可逆的。

⾼浓度尿素使蛋⽩质变性并抑制Rnase活性

⼗⼆烷基肌氨酸钠

使蛋⽩质解体变性

巯基试剂1防⽌蛋⽩质或酶等（如辅酶A）分⼦中SH基团氧化成⼆硫键，2在某些酶反应过程中维持体系的还原环境。DTT，DDTE、巯基⼄醇应⽤最⼴，⾕胱⽢肽也常应⽤，由于他是⽣物体内的还原剂，同时氧化后能被⾕胱⽢肽还原酶原位释放。DNA提取中，常使⽤巯基⼄醇，维持缓冲液的还原环境，防⽌多酚类氧化，由于具有⼀定的毒性，浓度不应⾼于2%。

巯基⼄醇

β-巯基⼄醇的主要作⽤是破坏RNase蛋⽩质中的⼆硫键（肽和蛋⽩质分⼦中的半胱氨酸残基中的键）。

1 还原蛋⽩质⼆硫键，使Rna酶变性

2 抑制酚类氧化，若氧化，核酸会变成灰⿊⾊，苯酚的氧化产物苯醌等氧化物引起磷酸⼆酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联3 保护蛋⽩质的巯基蛋⽩质提取中需要

巯基⼄醇还原⼆硫键，使RNA酶失活

化学变性剂SDS、尿素、盐酸胍能破坏疏⽔键、盐键、氢键、范德华⼒使蛋⽩质变性但不影响肽键和⼆硫键，不能使蛋⽩质彻底变性

加上还原剂巯基⼄醇或DTT，能还原⼆硫键，使RNA彻底变性DTT⼆硫苏糖醇

刺激性⽓味要⼩很多，毒性也⽐巯基⼄醇低很多。⽽且DTT⽐巯基⼄醇的浓度低7倍时，两者效果相近，但DTT价格略⾼⼀些。由于容易被空⽓氧化，因此DTT的稳定性较差；但

冷冻保存或在惰性⽓体中处理能够延长它的使⽤寿命。由于质⼦化的硫的亲核性较低，随着pH值的降低，DTT的有效还原性也随之降低；DTT或含有DTT的溶液不能进⾏⾼压处理。抑制Rnase活性TCEP 三(2-甲酰⼄基)膦盐酸盐

半胱氨酸Trizol

苯酚、异硫氰酸胍、8－羟基喹啉、β-巯基⼄醇等。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作⽤是裂解细胞，使细胞中的蛋⽩，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋⽩质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加⼊了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基⼄醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使⽤可增强抑制作⽤。异硫氰酸胍属于解偶剂，是⼀类强⼒的蛋⽩质变性剂，可溶解蛋⽩质并使蛋⽩质⼆级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋⽩迅速与核酸分离。

β-巯基⼄醇的主要作⽤是破坏RNase蛋⽩质中的⼆硫键。

液氮

组织破碎，裂解细胞SDS

⼗⼆烷基硫酸钠

阴离⼦去垢剂，⾼温（55-65℃）裂解细胞，使染⾊体离析，蛋⽩变性，形成SDS/蛋⽩质/多糖复合物，释放核酸，提⾼盐（KAc或NaAc）浓度并降低温度（冰浴），使SDS/蛋⽩质/复合物转变为溶解度更⼩的钾盐酸形式，使蛋⽩质及多糖杂质沉淀更加完全、离⼼后除去沉淀，上清液中的DNA⽤酚/氯仿抽提，⼄醇沉淀⽔相中的DNA

操作简单，温和，可提取到⾼分⼦量的DNA，但产物多糖类杂质较多

阳离⼦强表⾯活性剂，通常与蛋⽩酶K和抗氧化剂、螯合剂⼀起使⽤

可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋⽩与DNA分离

溶解膜类蛋⽩SDS 能裂解细胞。使细胞中的蛋⽩质和核酸之间常借着静电引⼒或配位键结合，阴离⼦去污剂能够破坏这种价键，使染⾊体离析，蛋⽩变性，释放核酸。

（1）SDS是⼀种阴离⼦表⾯活性剂，能使蛋⽩质的氢键和疏⽔键打开，并结合到蛋⽩质的疏⽔部位;

（2）SDS可引起蛋⽩质构象改变

（3）SDS是⼀种良好的解离剂，可使蛋⽩质溶解，变性

（4）形成SDS-蛋⽩质复合物，并使复合物带负电

质粒⽅⾯：在1％的SDS溶液中慢慢加⼊5 N的 NaCl，你会发现SDS在⾼盐浓度下是会产⽣沉淀的。因此⾼浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加⼊的不是NaCl⽽是 KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是⼗⼆烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）遇到钾离⼦后变成了⼗⼆烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），⽽PDS是⽔不溶的，因

此发⽣了沉淀。如此看来，溶液III加⼊后的沉淀实际上是钾离⼦置换了SDS中的纳离⼦形成了不溶性的PDS，⽽⾼浓度的盐，使得沉淀更完全。⼤家知道SDS专门喜欢和蛋⽩质结合，平均两个氨基酸上结合⼀个SDS分⼦，钾钠离⼦置换所产⽣的⼤量沉淀⾃然就将绝⼤部分蛋⽩质沉淀了，让⼈⾼兴的是⼤肠杆菌的基因组DNA也⼀起被共沉淀了。基因组DNA ⼀旦发⽣断裂，只要是50－100 kb⼤⼩的⽚断，就没有办法再被 PDS共沉淀了CTAB

CTAB：⼗六烷基三甲基溴⼄胺，低温时易沉淀

阳离⼦去污剂

⼀种在⾼盐下能和核酸结合形成可溶、稳定的复合物，低盐浓度下可沉淀的表⾯活性剂

是⼀种阳离⼦去污剂, 低离⼦强度（0.1-0.5M NaCl），沉淀核酸与酸性多聚糖，⽽蛋⽩质和中性多聚糖仍留在溶液中。在⾼离⼦强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋⽩质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋⽩，多糖，酚类等杂质后加⼊⼄醇沉淀即可使核酸分离出来。CTAB可从⼤量产⽣黏多糖的植物及某些⾰兰⽒阴性菌制备纯化的DNA，这种去污剂加⼊调节⾄⾼离⼦强度的细菌和细胞裂解液中（＞0.7M NaCl），经过连续的酚/氯仿抽提，去除CTAB/黏多糖/ 蛋⽩质复合体，异丙醇/⽆⽔⼄醇沉淀上清即可将DNA分离出来CTAB还有提⾼DNA互补链复性速率及稳定已形成的DNA双螺旋的作⽤

CTAB法的主要特点是⽤⽤较⼴

CTAB溶液在低于15度会形成沉淀析出，因此在将其加⼊冰冷的植物材料时，必须预热，且离⼼温度不低于15度

EDTA酶抑制剂，螯合⼆价⾦属，抑制⾦属依赖性的酶

螯合Mg2+或Mn2+离⼦，抑制细胞中DNase的活性，该酶可降解DNAEDTA是去垢剂，结合离⼦⽤，⽽它结合的部分离⼦是能够诱发或者促进RNA酶活性的，⽐如Ca2+。EDTA是⼀种⼆价离⼦熬合剂,能熬合Mg2+和Ca2+等⼆价阳离⼦,⽽多种RNA酶的活性是需要依赖⼆价阳离⼦的,所以EDTA能通过熬合⼆价阳离⼦来抑制RNA酶的活性

碱性条件下才能够溶解，要和NaOH粉末混合后，再加⽔，然后⽤NaOH⽔溶液调节pH。0.01M，DNase酶基本失活。

BSA

酶抑制剂，使⼀些降解酶的活性的表⾯变性

精胺或其他多胺

酶抑制剂，降低核酸酶的影响

氰化物

酶抑制剂，降低重⾦属氧化酶的影响PVP

减少酚类、醌类、单宁类物质的影响，抗氧化作⽤，络合多酚和萜类物质，防⽌多酚类褐变⽽氧化，去除多糖和⾊素，⾊素是PCR强抑制剂，必须去除

样品液氮研磨及提取缓冲液中加⼊PVP或PVPP等能络合多酚和萜类物质，离⼼或氯仿抽提出去，有效防⽌多酚氧化成醌类，避免溶液变褐⾊⽽具有抗氧化能⼒

提取液中加⼊适量的PVP或PVPP能提⾼DNA的纯度，⽤量根据杂质⽽定（1-6%），PVP同时能去除多糖，因此将PVP和巯基⼄醇配合使⽤并调整⽤量，能有效防⽌多酚污染PVP(聚⼄烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成⼀种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。Triton-x100

Triton?X100之类的去垢剂有苯环结构，所以在280nm有很强的吸收。

蛋⽩酶K

蛋⽩酶K：切割活性较⼴的丝氨酸蛋⽩酶，切割脂族和芳⾹族氨基酸的羧基端肽键，将蛋⽩质降解成⼩肽或氨基酸，使DNA分⼦完整地分离出来。

蛋⽩酶K 在较⼴的pH范围内均有活性（pH 4-12.5）温度范围37-60度盐浓度3M GuHCl 或4M尿素中均有活性在⼀些去污剂：Tween20(5%)、Triton X-100 (1%)和SDS(1%)条件下也有活性。

蛋⽩酶K消化裂解法适⽤于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳.如组织细胞(包括⽯蜡包埋组织)绒⽑、⽑发、精斑、⾎液(⾎清、⾎浆、全⾎)局部分泌物、尿，粪便等.蛋⽩酶K的⼀般⼯作浓度是50—100µg/ml

蛋⽩酶(蛋⽩酶K 或链酶蛋⽩酶) 可以降解蛋⽩质,灭活核酸酶(DNase 和RNase) ,DNase 和RNase 也⽤于去除不需要的核酸，有⼈使⽤蛋⽩酶替代DEPC处理⽔的，但有些⼈说效果不好。

蛋⽩酶 K，威⼒巨⼤的⼴谱蛋⽩酶，95C 加热10 分钟，则完全失活。数年前⾸次使⽤它替代 DEPC 处理 RNA 抽提⽤的离⼼管和枪头，效果不错；后来⼜⽤于处理 RNase-Free 的⽔，效果也是⼀级棒。从此就再也不⽤ DEPC 了。配制 RNA 裂解试剂时，直接⽤灭菌的双蒸⽔配制，最后，加⼊蛋⽩酶 K ⾄终浓度 1ug/ml。轻轻混匀，室温放置 15 分钟后即可。

枪头及离⼼管去除 RNase：先将枪头及离⼼管清洗⼲净后，移⼊预先混好的含 1ug/ml 蛋⽩酶 K 的双蒸⽔，彻底浸⼊。室温放置 30 分钟后，连⽔⼀起⾼压灭菌。弃⽔后，烘⼲即可。RNase-Free ⽔的获得：直接在灭菌的双蒸馏⽔中加⼊蛋⽩酶 K ⾄终浓度 1ug/ml。轻轻混匀，室温放置 15 分钟后，灭菌处理即可。该蛋⽩质的残留对后续实验没有可见的影响。⽆蛋⽩质残留的RNase-Free ⽔的获得：这⽐较⿇烦。直接在灭菌的双蒸馏⽔中加⼊蛋⽩酶 K ⾄终浓度 1ug/ml。轻轻混匀后，倒⼊专⽤的蒸馏器中。放置 15 分钟后，加热蒸馏，流出的就是⽆蛋⽩质残留的RNase-Free ⽔。要提醒的是，该专⽤蒸馏器头⼏次流出来的⽔，只能当普通蒸馏⽔⽤，因为通道中难确保 RNase-Free 的环境；另外，⼀定要主要密闭性，否则，流出的⽔⼜被污染了。

DNA裂解液的作⽤是破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋⽩与DNA分离，抑制细胞中Dnase的活性，⽽蛋⽩酶k的作⽤是将蛋⽩质降解成⼩肽或氨基酸，使DNA分⼦完整地分离出来！溶菌酶

溶壁酶Dnase

Rnase

多糖⽔解酶：⽔解多糖

饱和酚

酚是⼀种有机溶剂,预先要⽤STE 缓冲液饱和,因未饱和的酚会吸收⽔相⽽带⾛⼀部分核酸。酚也易氧化发黄,⽽氧化的酚可引起核酸链中磷酸⼆酯键断裂或使核酸链交联：故在制备酚饱和液时要加⼊82羟基喹咛,以防⽌酚氧化。

苯酚

⾮极性分⼦⽔为极性分⼦

使蛋⽩质变性，同时抑制了DNase的降解作⽤。⽤苯酚处理匀浆液时，由于蛋⽩与DNA 联结键已断，蛋⽩分⼦表⾯⼜含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋⽩分⼦溶于酚相，⽽DNA 溶于⽔相。使⽤酚的优点：1. 有效变性蛋⽩质；2. 抑制了DNase的降解作⽤。能有效使